全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ０１２
收稿日期：２０１４－０１－２６
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１６４０）
作者简介：王　 成（１９８８—），男，江苏宿迁人，研究方向：轻工技术与工程；詹晓北（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｂｚｈａｎ＠ ｙａｈｏｏ􀆰 ｃｏｍ
通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产
花生四烯酸的影响
王　 成１，２，郑志永１，２，朱　 莉３，高敏杰１，２，詹晓北１，２
（１􀆰 江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２； ２􀆰 江南大学
工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２； ３􀆰 江苏瑞光生物科技有限公司，江苏 无锡 ２１４１２５）
摘　 要：高山被孢霉具有很强的积累花生四烯酸（ＡＲＡ）的能力，通过对 ３０ Ｌ气升式反应器发酵过程的通气量进行
调控，结果发现：通气量对高山被孢霉菌体生长、形态及 ＡＲＡ 合成具有显著影响。 中等大小的球形菌丝形态有利
于菌体持续生长和油脂积累，ＡＲＡ占总油脂的含量最高，而羽状菌丝形态菌体中总油脂含量和 ＡＲＡ含量均小于球
形菌丝形态菌体中的含量。 通气量为 １􀆰 ０ ｖｖｍ（１ ｖｖｍ为每分钟通气量与罐体实际料液体积之比）时有利于菌体保
持良好形态和生长，通气量为 １􀆰 ４ ｖｖｍ有利于发酵对数期后（７２～１６８ ｈ）ＡＲＡ的积累。 提出一种两阶段通气量控制
策略，在气升式发酵罐中高山被孢霉的菌丝形态得到显著改善，ＡＲＡ产量达到 ４􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ，比对照提高了 ４０􀆰 １％。
关键词：高山被孢霉；花生四烯酸；气升式反应器；通气量
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００６８－０７
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ｉｎ ａｉｒｌｉｆｔ ｒｅａｃｔｏｒ
ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ１，２，ＺＨＥＮＧ Ｚｈｉｙｏｎｇ１，２，ＺＨＵ Ｌｉ３，ＧＡＯ Ｍｉｎｊｉｅ１，２，ＺＨＡＮ Ｘｉａｏｂｅｉ１，２
（１􀆰 Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ； ２􀆰 Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ； ３􀆰 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｒａｙｇｕａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｗｕｘｉ ２１４１２５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ ｈａｓ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＡＲＡ） ｉｎ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ．
Ｗｈｅｎ Ｍ． ａｌｐｉｎａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｉｎ ａ ３０ Ｌ ａｉｒｌｉｆｔ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ， ｔｈｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｈａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ＡＲＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｃｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｍｅｄｉｕｍ ｓｉｚｅ ｐｅｌｌｅｔ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ＡＲＡ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｗｈｉｌｅ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｙｃｅｌｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｈａｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ＡＲＡ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ａｔ １􀆰 ０
ｖｖｍ （ｇａｓ ｖｏｌｕｍｅ ｆｌｏｗ ｐｅｒ ｕｎｉｔ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ） ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔａｇｅ，ｃｅｌｌｓ ｇｒｅｗ ｗｅｌｌ ａｎｄ ｔｈｅ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｇｕｌａｒ ｐｅｌｌｅｔ ｍｙｃｅｌｉａ． Ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｓｔａｇｅ，ｔｈｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ １􀆰 ４
ｖｖｍ ｆｏｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＲＡ ａｆｔｅｒ ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｐｈａｓｅ （７２⁃１６８ ｈ）． Ｔｈｅ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＡＲＡ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ４􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ４０􀆰 １％ ｈｉｇｈｅｒ
ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ；ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ａｉｒｌｉｆｔ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ；ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ
　 　 花生四烯酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＲＡ），全称二十
碳 ５，８，１１，１４ 四烯酸 （全顺），是 ω ６ 系列多不
饱和脂肪酸，主要以磷脂的形式存在于机体各种组
织的细胞膜上，具有多种生理活性，被广泛应用于
食品、医药和化妆品等领域。 ＡＲＡ 是人体中前列腺
素、血栓素和白三烯等重要物质的前体物质，对预
防心血管疾病具有很好功效［１－２］，并且 ＡＲＡ 可以作
为食品添加剂和营养强化剂添加到婴儿奶粉中，有
助于提高婴幼儿感光及认知能力［３］。
ＡＲＡ在成年人体内合成量很少，在婴幼儿体
内，因缺少相应的酶而无法合成［４］。 传统 ＡＲＡ主要
来源于蛋黄、动物肝脏和肾上腺等，但动物组织中
ＡＲＡ含量大多低于 ５％［５］，并且提取得到的为 ＡＲＡ
粗品，含有大量的二十碳五烯酸，而过量的二十碳
五烯酸会抑制 ＡＲＡ的吸收和合成，从而降低细胞中
ＡＲＡ水平，导致婴幼儿大脑发育不成熟，甚至性早
熟［６］。 利用微生物发酵生产 ＡＲＡ具有突出的优势：
其不受原材料及气候限制、生产周期短、培养工艺
简单并且含量高。 因此，微生物发酵生产 ＡＲＡ已成
为主流趋势。 高山被孢霉 （Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ） 目前
被认为是发酵生产 ＡＲＡ 的最佳菌株，其菌体中
ＡＲＡ含量丰富且不饱和脂肪酸组成合理［７－８］。
气升式反应器具有结构简单、剪切应力小、能
量耗散均匀和供气效率高等优点，对剪切力敏感的
微生物培养具有重要意义［９］，用于 ＡＲＡ发酵有利于
保持 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体的优势形态，而菌体形态对总油
脂及 ＡＲＡ的积累影响很大［１０］。 目前利用气升式反
应器发酵生产 ＡＲＡ的文章鲜有报道，本文中笔者将
考察气升式反应器重要操作参数———通气量对
Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 的生长及合成 ＡＲＡ 的影响，以期提高
ＡＲＡ的发酵水平。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株
高山被孢霉 （Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ） ＣＦＣＣ ８８４４７，
购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。
１􀆰 ２　 培养基
斜面培养基 （ｇ ／ Ｌ）：马铃薯 ２００，葡萄糖 ２０，琼
脂 ２０；ｐＨ自然。
种子培养基 （ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ３０，豆粕粉 １０，酵母
膏 １０， ＫＨ２ＰＯ４ ３， ＮａＮＯ３ ３， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５；
ｐＨ ６􀆰 ０。
发酵培养基 （ｇ ／ Ｌ）：初始葡萄糖 ５０，豆粕粉 １０，
ＫＨ２ＰＯ４ ３，ＮａＮＯ３ ３，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５；ｐＨ ６􀆰 ０。
１􀆰 ３　 培养条件
种子液的制备：５００ ｍＬ 三角瓶中加入 １００ ｍＬ
种子培养基，将 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 菌种接种到种子培养基
中，２５ ℃、１１０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡摇床培养 ４８ ｈ作为种子液
备用。
气升式反应器恒速补料分批发酵条件：３０ Ｌ 气
升发酵罐 （无锡市海信化机设备有限公司），接种量
１０％，装液系数为 ０􀆰 ６，通气量 ０􀆰 ８ ｖｖｍ（１ 个 ｖｖｍ 表
示每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值），分
批发酵时初始 ｐＨ 为 ６􀆰 ０，使用 ２􀆰 ０ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ 维
持发酵液 ｐＨ为 ６􀆰 ０ ± ０􀆰 １，发酵温度为 ２５ ℃，发酵
开始后，恒速 （６􀆰 １２ ｍＬ ／ ｈ） 流加补料液 （７００ ｇ ／ Ｌ
葡萄糖） 直至发酵 ７ ｄ结束。
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １　 生物量测定
准确量取 ５０ ｍＬ发酵液进行真空过滤 （直径 ７
ｃｍ中速定量滤纸），用蒸馏水冲洗至流出液无色，
将菌体置于培养皿中，１０５ ℃下烘干至恒质量，称菌
体干质量。 生物量计算公式：生物量＝菌体干质量 ／
发酵液体积。
１􀆰 ４􀆰 ２　 菌球直径的测定
发酵结束后，取 ２ ｍＬ摇匀后的发酵液倒入培养
皿中，加入 ２０ ｍＬ 去离子水，稀释后从中随机选取
３０个菌球，以游标卡尺为参照逐个测定菌球直径，
计算平均值和标准差。
１􀆰 ４􀆰 ３　 葡萄糖含量测定
利用 ３，５ 二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法［１１］测定发酵
液中残留的葡萄糖含量。
１􀆰 ４􀆰 ４　 总油脂含量测定［１２］
精确称取干燥后的菌体 ０􀆰 ５ ｇ，置于研钵中充分
研磨至粉状，转移到 ７ ｍＬ 离心管中，加入 ３ ｍＬ
ＣＨＣｌ３ ＣＨ３ＯＨ溶液 （体积比 １ ∶ ２），剧烈振荡抽提
１ ｍｉｎ，再加入 １ ｍＬ ＣＨＣｌ３溶液，再次剧烈振荡 １
ｍｉｎ，最后加入 １ ｍＬ 去离子水，振荡萃取 １ ｍｉｎ，静置
３０ ｍｉｎ后溶液分层，将下层有机相全部取出至预先
称质量的 ５ ｍＬ 离心管中，水浴 （８０ ℃、４ ｈ） ，将有
机相蒸干，干燥后再次称离心管质量，减去空离心
管的质量即为总油脂的质量。
１􀆰 ４􀆰 ５　 ＡＲＡ含量测定［１３］
精确称取 １􀆰 ４􀆰 ４中总油脂 ０􀆰 １ ｇ，加入 ２ ｍＬ ０􀆰 ５
ｍｏｌ ／ Ｌ的 ＮａＯＨ ＣＨ３ＯＨ溶液，６０ ℃水浴加热至油
脂完全溶解，冷却后加入 ２ ｍＬ 体积分数 ２５％的
９６　 第 １期 王　 成等：通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产花生四烯酸的影响
ＢＦ３ ＣＨ３ＯＨ溶液，６０ ℃水浴酯化 ２０ ｍｉｎ，再次冷却
后加入 ２ ｍＬ 正己烷并振荡混匀，最后加入 ２ ｍＬ
ＮａＣｌ饱和溶液并振荡，静置 ３０ ｍｉｎ后取上层有机相
于 １个干燥试管中，并加入少量无水 Ｎａ２ＳＯ４以去除
微量水分，供气相色谱 ／质谱（ＧＣ ／ ＭＳ）分析使用。
ＧＣ ／ ＭＳ分析采用美国瓦里安公司气相色谱串
联质谱联用仪 １２００ Ｌ型 ＧＣ ＭＳ；色谱条件：色谱
柱为 ＤＢ ２２５，３０ ｍ × ０􀆰 ２５ ｍｍ × ０􀆰 １５ μｍ 毛细
管柱；载气为 Ｈｅ；流量为 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ，不分流进样；
程序升温条件：初始温度 １８０ ℃，维持 ２ ｍｉｎ，以 ５
℃ ／ ｍｉｎ速率升温至 ２３０ ℃，维持 １２ ｍｉｎ；质谱条
件：接口温度 ２５０ ℃；离子源温度 ２００ ℃；离子化
方式 ＥＩ；电子能量 ７０ ｅＶ；检测电压 ３５０ Ｖ；发射电
流 ２００ μＡ。
按照上述分析方法得到样品气相图谱如图 １所
示，其不同保留时间所对应的油脂组分见表 １。
图 １　 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ产油脂的总离子流图
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｏｔａｌ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｂｙ Ｍ􀆰 Ａｌｐｉｎａ
表 １　 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ合成的油脂组分分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
保留时间 ／ ｍｉｎ 油脂成分
４􀆰 ４０ 肉豆蔻酸
６􀆰 ４３ 棕榈酸
８􀆰 ９７ 硬脂酸
９􀆰 ２８ 油酸
９􀆰 ９４ 亚油酸
１０􀆰 ３７ 亚麻酸
１２􀆰 １８ 二十碳 １１ 烯酸
１３􀆰 ６４ 二十碳 ７，１０，１３ 三烯酸
１４􀆰 １６ 花生四烯酸
１５􀆰 ８８ 二十二酸
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 通气量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体生长影响
气升式反应器中通气量大小对丝状真菌
Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体形态及生长影响较大，通气量较大时
相应的剪切力也会增加，可能影响菌体形态；通气
量较小时供氧不足，亦影响菌体生长。 为此，首先
考察不同通气量大小对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 菌体形态及生长
的影响。
图 ２　 通气量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
在不同通气量（０􀆰 ６、１􀆰 ０、１􀆰 ４ 和 １􀆰 ８ ｖｖｍ）时 ３０
Ｌ气升式反应器恒速补料分批发酵，结果如图 ２、图
３和表 ２所示。 从图 ２ 可以看出：发酵起始后菌体
快速进入对数生长期，７２ ｈ 后菌体生长放缓，进入
稳定期。 结合图 ３ 和表 ２ 可以看出：不同通气量对
发酵过程菌体形态有显著影响，通气量较低时（０􀆰 ６
ｖｖｍ），发酵液中菌球（图 ３（ｅ））平均直径最大（３􀆰 ９
ｍｍ），球状菌体所占比例也最高（８８􀆰 ４％）；而随着
通气量的增加，气泡逸出液面的几率增加，气泡破
碎产生的剪切力趋于明显，发酵液中球状菌体比例
趋减，不规则羽状形态菌体（图 ３（ ｆ））比例不断增
加，同时菌球平均直径减小，发酵液逐渐变得黏稠。
比较不同通气量水平可看出：通气量 １􀆰 ０ ｖｖｍ 时，
０７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ生物量最高，此时羽状菌体比例低于通气
量 １􀆰 ８ ｖｖｍ时的比例，菌球（图 ３（ｇ））平均直径相对
于 ０􀆰 ６ ｖｖｍ通气量时较小（２􀆰 ４ ｍｍ），而菌体生物量
和细胞得率系数均达到最大，分别为 ３４􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ 和
０􀆰 ４８９ ｇ ／ ｇ，同时最大比生长速率 μｍａｘ（０􀆰 ０５５ ｈ １）比
其他通气量时要高，且达到最大值的时间（１２ ｈ）要
稍短。 可见，利用 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ进行气升式反应器发酵
生产 ＡＲＡ时，通气量的选择很关键。
在气升式反应器中，通气量直接影响反应器
内的体积传氧系数 ｋＬａ，进而影响反应器的传氧速
率。 当通气量较低时（ ０􀆰 ６ ｖｖｍ），气泡上升速率
慢，剪切速率小，菌丝相互缠绕易形成大的菌球，
菌球的形成有利于菌丝保持其完整形态而不发生
断裂，使菌体维持正常的生理状态，但是 Ｈｕａｎｇ
等［１４］也发现，当菌球直径过大时，不利于 Ｏ２ 从发
酵液中扩散至菌球内部，会导致菌球内部的菌丝
体因缺氧而死亡和自溶。 而当通气量较大时（１􀆰 ８
ｖｖｍ），虽然溶氧能大幅提高，但随着气泡上升，速
率加快，气泡在液面破裂时，细胞所受的剪切力也
快速增加，菌丝缠绕形成的菌球又会随气泡破裂
而崩散，形成大量羽状形态的菌体，导致发酵液变
得黏稠，这亦会影响 Ｏ２ 的传递［１５］ 。 而当通气量为
１􀆰 ０ ｖｖｍ时，合适的通气量有利于形成大小合适的
菌球形态，维持较小的发酵液黏度，一方面有利于
保持大部分菌丝以菌球形态相互缠绕而不断裂，
另一方面，较小的菌球也有利于 Ｏ２ 的传质和生物
量的积累，故通气量 １􀆰 ０ ｖｖｍ时较有利于 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
菌体的生长。
图 ３　 通气量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体形态的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
表 ２　 通气量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体生长的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
通气量 ／
ｖｖｍ
ｍ（菌球形态生物量） ／
ｍ（总生物量） ／ ％
菌球平均直径 ／
ｍｍ
菌球直径
标准差
生物量 ／
（ｇ·Ｌ－１）
细胞对底物的得率 ／
（ｇ·ｇ－１）
０􀆰 ６ ８８􀆰 ４ ３􀆰 ９ ０􀆰 ９０ ２３􀆰 ４ ０􀆰 ４０３
１􀆰 ０ ８１􀆰 ８ ２􀆰 ４ ０􀆰 ６２ ３４􀆰 ６ ０􀆰 ４８９
１􀆰 ４ ６１􀆰 １ ２􀆰 ０ ０􀆰 ５６ ２９􀆰 ４ ０􀆰 ４５７
１􀆰 ８ ３７􀆰 ６ １􀆰 ２ ０􀆰 ５４ ２０􀆰 ４ ０􀆰 ３９５
１７　 第 １期 王　 成等：通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产花生四烯酸的影响
２􀆰 ２　 通气量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 菌体中总油脂和 ＡＲＡ 合
成影响
　 　 ＡＲＡ是 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ胞内次级代谢产物，其最终产
量的决定性因素有生物量、总油脂含量和 ＡＲＡ占总
油脂比例。 图 ４ 为通气量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 菌体中总油
脂和 ＡＲＡ生物合成的影响结果。
图 ４　 通气量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体中总油脂
和 ＡＲＡ生物合成影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ａｎｄ
ＡＲＡ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
从图 ４ 可以发现：总油脂的合成与菌体生长呈
部分耦联关系，在 ０ ～ ７２ ｈ 内随菌体生物量的快速
增加而迅速积累，至 ９６ ｈ 时，非油脂生物量基本达
到稳定，此后菌体主要进行油脂的合成。 从整个发
酵过程看，不同通气量对菌体中总油脂的比例影响
不大，最终总油脂产量主要依赖于菌体的生物量。
同时由图 ２和图 ３可知，１􀆰 ０ ｖｖｍ通气量时最有利于
Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体维持良好形态和生长，发酵结束后生
物量最高，所以此时总油脂含量也最高，达到 １５􀆰 ２
ｇ ／ Ｌ。 但对比不同时期、不同通气量条件时的 ＡＲＡ
合成情况却发现，在 ０ ～ ７２ ｈ 阶段，１􀆰 ０ ｖｖｍ 通气量
时 ＡＲＡ平均合成速率最高 （０􀆰 ０３１ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）），而在
７２～１６８ ｈ阶段，通气量为 １􀆰 ４ ｖｖｍ 时，ＡＲＡ 平均合
成速率最高 （０􀆰 ０１６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ））。 此外，分析总油脂
中 ＡＲＡ比例变化规律同样可以看出，发酵 ７２ ｈ 后，
通气量 １􀆰 ４ ｖｖｍ 条件下，总油脂中 ＡＲＡ比例已明显
高于其他通气量时比例。 发酵结束时，１􀆰 ４ ｖｖｍ 通
气量对应总油脂中 ＡＲＡ 比例和 ＡＲＡ 产量最高，分
别为 ２９􀆰 １％和 ３􀆰 ９３ ｇ ／ Ｌ，比 １􀆰 ０ ｖｖｍ 通气量时分别
提高了 ３１􀆰 ６％和 １６􀆰 ６％。 以上分析表明：总油脂产
量主要依赖于菌体生物量，当通气量 １􀆰 ０ ｖｖｍ 时最
有利于菌体生长，此时油脂也含量最高。
表 ３为不同菌体形态 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ中总油脂和 ＡＲＡ
的含量比较结果。 从表 ３可以看出，不同菌体形态中
总油脂含量存在很大差异，其中羽状菌体中油脂含量
较低。 分析原因可能是：通气量较大时，菌丝发生断
裂，损伤较大，而这种损伤有时候是不可恢复的［１６］，
同时，损伤的菌体需要利用更多的底物进行自身修
复［１７］，从而影响了油脂合成。 因此，适当提高通气量
对菌体生长对数期后 （７２～１６８ ｈ） ＡＲＡ合成更有利，
即溶氧在 ＡＲＡ 合成中起着至关重要作用，这与
Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ等［１８］发现溶氧可以提高产油微生物菌
体胞内不饱和脂肪酸比例结果一致，其原因是不饱和
脂肪酸的形成要经过脂肪酸链的延长和油脂脱饱和
作用，而 Ｏ２ 是脱饱和途径电子传递链的末端受体，并
且 Ｏ２ 还可调控脱饱和酶的形成。 但结合图 ２和图 ３
结果分析发现，Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 菌体生长和目标产物 ＡＲＡ
合成的最适通气量大小不一致，因此，采用分阶段溶
氧调控策略进行下一步实验。
表 ３　 不同菌体形态 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ中总油脂和 ＡＲＡ的含量比较
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ＡＲＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｙｃｅｌｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
菌体形态 ｍ（总油脂） ／ｍ（生物量） ／ ％
ｍ（ＡＲＡ） ／
ｍ（总油脂） ／ ％
球状 ４６􀆰 ８ ２４􀆰 ３
羽状 ３９􀆰 １ １８􀆰 ２
２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
２􀆰 ３　 两阶段通气量控制策略对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 生产
ＡＲＡ的影响
　 　 为了最大程度同时满足 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 菌体生长和
目标产物 ＡＲＡ合成需要，提高最终 ＡＲＡ产量，对发
酵过程通气量进行了分阶段控制，即初始阶段 （０ ～
７２ ｈ） 保持通气量 １􀆰 ０ ｖｖｍ，对数期后 （７２ ～ １６８ ｈ）
保持通气量 １􀆰 ４ ｖｖｍ，以 １􀆰 ０ ｖｖｍ 通气量为对照，结
果如图 ５、图 ６ 和表 ４ 所示。 在 ０ ～ ７２ ｈ 阶段，
Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体处于对数生长期，此时通气量对应的
剪切速率较小，有助于维持菌体成球状（图 ６），保证
了氧传递效率，最终菌体能够更快生长，实现总油
脂和 ＡＲＡ合成速率的提高。 在 ７２ ～ １６８ ｈ 阶段，菌
体生长变缓，非油脂生物量基本维持稳定，此后菌
体生物量的增加主要来自油脂的合成，发酵结束时
最终生物量为 ３５􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，总油脂达到 １６􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，相比
单一采用 １􀆰 ４和 １􀆰 ０ ｖｖｍ通气量进行发酵均有了显
著提高。 同时，在 ７２ ～ １６８ ｈ 阶段因通气量由 １􀆰 ０
ｖｖｍ提升至 １􀆰 ４ ｖｖｍ，导致剪切速率相应增加，随着
发酵的进行，菌球平均直径不断减小，并且羽状形
态菌体比例有了一定增加（图 ６），但与图 ３（ｃ）和图
３（ｄ）相比，菌体形态有了明显改善，发酵结束时羽
状菌体比例降低。 另一方面，溶氧的提高增强了菌
　 　 　 　
体油脂中非饱和脂肪酸的转化能力，特别是 ＡＲＡ的
合成，最终 ＡＲＡ 产量达到 ４􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ，比对照（１􀆰 ０
ｖｖｍ）提高了 ４０􀆰 １％。 可见，通过两阶段通气量调控
策略，在保证 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ 良好生长的同时，实现 ＡＲＡ
产量的显著增加。
图 ５　 两阶段通气量调控策略对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ生产 ＡＲＡ影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ
ｏｎ ＡＲＡ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｍ􀆰 ａｐｉｎｅ
图 ６　 两阶段通气量调控过程中 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体形态变化
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ ｉｎ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ
表 ４　 两阶段通气量调控策略对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ生产 ＡＲＡ的影响
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｎ ＡＲＡ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ
发酵策略
ｍ（菌球形态
生物量） ／
ｍ（总生物
量） ／ ％
生物量 ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（总油脂） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＡＲＡ） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ｍ（总油脂） ／
ｍ（生物
量） ／ ％
ｍ（ＡＲＡ） ／
ｍ（生物
量） ／ ％
菌体对底
物的得率
Ｙｘ ／ ｓ ／
（ｇ·ｇ－１）
总油脂得
率系数
Ｙｐｔ ／ ｓ ／
（ｇ·ｇ－１）
ＡＲＡ得率
系数
Ｙｐａ ／ ｓ ／
（ｇ·ｇ－１）
两阶段通
气量调控 ７３􀆰 ６ ３５􀆰 ２ １６􀆰 ２ ４􀆰 ７２ ４６􀆰 ０ ２９􀆰 １ ０􀆰 ５２９ ０􀆰 ２４０ ０􀆰 ０７０
对照 ８１􀆰 ８ ３４􀆰 ６ １５􀆰 ２ ３􀆰 ３７ ４３􀆰 ９ ２２􀆰 １ ０􀆰 ４８９ ０􀆰 ２１５ ０􀆰 ０４８
变化量 ／ ％ ６􀆰 ６ ４０􀆰 １ ４􀆰 ８ ３１􀆰 ７ ８􀆰 ２ １１􀆰 ６ ４５􀆰 ８
　 注：下标中 ｘ表示生物量，ｓ表示葡萄糖，ｐｔ表示总油脂，ｐａ表示 ＡＲＡ．
３７　 第 １期 王　 成等：通气量对气升式反应器培养高山被孢霉生产花生四烯酸的影响
３　 结论
在 ３０ Ｌ气升式反应器水平上研究了不同通气
量对 Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体生长和 ＡＲＡ 合成影响。 结果表
明，通气量为 １􀆰 ０ ｖｖｍ时有助于Ｍ􀆰 ａｌｐｉｎａ菌体生长，
通气量为 １􀆰 ４ ｖｖｍ时有助于发酵对数期后 （７２～１６８
ｈ） 目标产物 ＡＲＡ的合成。 通过两阶段通气量调控
策略，最终 ＡＲＡ 产量达到 ４􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ，相比对照提高
了 ４０􀆰 １％，效果显著，体现了气升式反应器发酵生
产 ＡＲＡ 过程中通气量调控的重要性，同时为 ＡＲＡ
的生产工艺研究提供了一种新的思路。
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（责任编辑　 管　 珺）
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