全 文 ：第 １４卷第 １期
２０１６年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０１􀆰 ００７
收稿日期：２０１５－０８－１２
基金项目：国家自然科学基金（５０９７８１６４）
作者简介：李英东（１９９３—），男，甘肃省兰州人，研究方向：生物技术；陈　 军（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｃｊ７２０６＠ ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
生物转化高浓度甘油生产 １，３ 二羟基丙酮及
分批发酵动力学
李英东，张　 川，吴　 迪，张　 怡，陈　 军
（上海师范大学 生命与环境科学学院，上海 ２００２３４）
摘　 要：以生物柴油生产的高浓度副产物甘油为唯一碳源筛选甘油高耐受性 １，３ 二羟基丙酮（ＤＨＡ）高产菌株，运
用响应面与正交试验优化菌株产 ＤＨＡ条件，提高 ＤＨＡ产量。 分子生物学鉴定表明：筛选的高产 ＤＨＡ菌种 Ｇ４０为
芽胞杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株，ＤＨＡ产量为 ２９􀆰 ４６ ｇ ／ Ｌ。 响应面分析和正交试验优化后，在甘油 ２２４􀆰 ２２ ｇ ／ Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４
１􀆰 ６０ ｇ ／ Ｌ、ＮａＣｌ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、酵母膏 １􀆰 ６０ ｇ ／ Ｌ和 ｐＨ ７􀆰 ２、３５ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ的条件
下，Ｇ４０菌株发酵 ６０ ｈ产生 ＤＨＡ ８６􀆰 ８４ ｇ ／ Ｌ，比优化前提高了 １９４􀆰 ８％。 实验建立了一种利用高浓度甘油高效率发
酵生产 ＤＨＡ的方法。
关键词：１，３ 二羟基丙酮；菌种筛选；甘油；发酵动力学
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０１－００３６－０８
Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ⁃ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎｔｏ １，３⁃ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ ａｎｄ
ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ
ＬＩ Ｙｉｎｇｄｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕａｎ，ＷＵ Ｄｉ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉ，ＣＨＥＮ Ｊｕｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ⁃ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｃａｎ
ａｌｓｏ ｐｒｏｄｕｃｅ １，３⁃ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ （ＤＨＡ） ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ．Ｔｈｅｎ， ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ＤＨＡ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｏｕｔｐｕｔ． Ｔｈｅ
ｍｏｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＨＡ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｓ ｓｈｏｗｎ ｂｙ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｗｉｔｈ ａ ＤＨＡ
ｏｕｔｐｕｔ ｏｆ ２９􀆰 ４６ ｇ ／ Ｌ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｓｔｒａｉｎ Ｇ４０
ｐｒｏｄｕｃｅｄ ８６􀆰 ８４ ｇ ／ Ｌ ＤＨＡ ｉｎ ６０ ｈｏｕｒｓ ｗｉｔｈ ２２４􀆰 ２２ ｇ ／ Ｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１􀆰 ６０ ｇ ／ Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４，０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ，０􀆰 ５
ｇ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ （ＮＨ４） ２ＳＯ４， １􀆰 ６０ ｇ ／ Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ７􀆰 ２，３５ ℃ ａｎｄ ２００ ｒ ／ ｍｉｎ，ｗｈｉｃｈ
ｈａｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ １９４􀆰 ８％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｕｔｐｕｔ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＨＡ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂｉｏ⁃ｍｅｔｈｏｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：１，３⁃ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ；ｂａｃｔｅｒｉａｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｇｌｙｃｅｒｏｌ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ
　 　 １，３ 二羟基丙酮（ＤＨＡ）是一种天然存在的
酮糖［１］ ，可以有效减缓脂肪代谢速度，作为一种生
物添加剂被广泛应用于饲料、化妆品、医学药物合
成、农药合成和食品等行业［２－５］ ，其合成条件和产
业化生产受到了研究者的关注［６］ 。 目前，ＤＨＡ 的
合成方法主要有化学合成法和生物发酵法两种，
其中生物发酵方法由于易于操控、经济效益高并
且有较高的原料利用率和产出量等优点成为研究
的热点［７－８］ 。 Ｙａｍａｄａ 等［９］和游庆红等［１０］利用氧
化葡萄糖酸杆菌在 ６０ ｇ ／ Ｌ 的甘油中发酵 ５７ ｈ，实
现甘油转化率 ９７％；孙杨等［１１］研究了氧化葡萄糖
酸杆菌在 １０６􀆰 ８５ ｇ ／ Ｌ 甘油中的最大产率为
２２４􀆰 ２２ ｇ ／ Ｌ。 高甘油耐受度及转换率对 ＤＨＡ 的生
产具有重要的实际意义。 目前工业上采用动植物
油脂与醇类物质大规模生产生物柴油过程中，每
生产 ９ ｋｇ生物柴油就会产生 １ ｋｇ左右高浓度的废
甘油［１２－１５］ 。 由于菌种对甘油的耐受度低，现行技
术条件下从生物柴油中提取高浓度甘油需要增加
工艺流程来稀释和调节合适的甘油浓度才能不影
响发酵菌种的正常生产［１６］ 。
笔者试图驯化筛选可在高甘油浓度下达到高
ＤＨＡ发酵转化率的甘油发酵菌株，为废弃的高浓度
甘油提供新的利用途径。 同时对高浓度甘油发酵
过程建立动力学模型，为 ＤＨＡ的简便经济发酵生产
提供有效可行的新方法。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 土壤样品及材料来源
多点采集的高浓度油脂污染土壤来自上海师
范大学食品残留处理点；ＤＨＡ标样、甘油（分析纯），
阿拉丁标准试剂网；Ｔａｑ 酶，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司；
细菌基因组 ＲＮＡ 小量制备试剂盒、胶回收试剂盒，
Ａｘｙｇｅｎ公司。
１􀆰 ２　 培养基
基础盐培养基（ｇ ／ Ｌ）：Ｋ２ＨＰＯ４ １􀆰 ５，ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ５，
ＮＨ４ＮＯ３ １􀆰 ０，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０􀆰 ５，ＮａＣｌ ０􀆰 ５，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ５。 根据实验需要添加甘油。
ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０􀆰 ０，酵母粉 ５􀆰 ０，
ＮａＣｌ １０􀆰 ０。
以上培养基调 ｐＨ ７􀆰 ０、０􀆰 １ ＭＰａ蒸气灭菌 ３０ ｍｉｎ。
１􀆰 ３　 仪器设备
Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ＬＣ型高效液相色谱仪，安捷伦科
技有限公司，ＳＣＱ ２５００Ｆ 型超声波细胞粉碎机、
ＺＨＷＹ ２１０２Ｃ 型双层恒温培养振荡器，上海智城
分析仪器制造有限公司；ＵＶ ２５５０ 紫外分光光度
计，上海奥析科学仪器制造有限公司。
１􀆰 ４　 实验方法
１􀆰 ４􀆰 １　 土样中微生物的驯化
取土样 １０ ｇ，加入 ５０ ｍＬ 无菌水漩涡振荡均匀
后，取 １０ ｍＬ土壤悬液加入到含有 ７ ｇ甘油的 ５０ ｍＬ
基础盐培养液中，在 ３７ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ条件下培养 ４８
ｈ后，再吸取 １０ ｍＬ 培养液接入含有 ７ ｇ 甘油的 ５０
ｍＬ基础盐培养基中，相同条件下再次增殖 ４８ ｈ，后
以同样方法连续驯化富集 ４ ～ ５ 次制备最终驯化增
殖培养液。
１􀆰 ４􀆰 ２　 菌种的分离和纯化
最终驯化的增殖培养液经过梯度稀释后，涂布
于灭菌的、以甘油为唯一碳源的基础盐培养平板
上，３７ ℃恒温箱中放置 ４８ ｈ后，挑取生长速度较快、
菌落大且形态不一的菌落反复纯化至菌落形态特
征一致，并对筛得的菌株进行保存。
１􀆰 ４􀆰 ３　 高甘油耐受度 ＤＨＡ生产菌的筛选
将不同菌株以相同的接种量接入以甘油为唯
一碳源的 ５０ ｍＬ 基础盐培养液中，在 ３７ ℃、１５０
ｒ ／ ｍｉｎ下培养 ４８ ｈ后，取降解液在 ４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、２４ ℃
的条件下离心 １０ ｍｉｎ，然后取上清液 １ ｍＬ，通过水
相针式滤器过滤降解液，加入进样瓶中，用高效液
相色谱法（ＨＰＬＣ）测定培养液中 ＤＨＡ 的产生量，筛
选出 ＤＨＡ产量最高的菌株。
１􀆰 ４􀆰 ４　 分析方法
１）菌体生物量测定 　 取 １０ ｍＬ 样液在 １０ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ℃下离心 １０ ｍｉｎ后去除上清液，在干燥箱
中烘干后，称菌体沉淀干质量。 菌体生物量用菌体
沉淀干质量除以样液体积（１０ ｍＬ）计算得到。
２）ＤＨＡ测定　 以 ＤＨＡ标准样品为参照样品检
测。 色谱柱 Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８（５ μｍ，２５０ ｎｍ×４􀆰 ６ ｍｍ），
采用 ５％的甲醛水溶液（用 ０􀆰 ０５ ％ Ｈ３ＰＯ４调节 ｐＨ
至 ３），流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ２５ ℃，检测波长 ２００
ｎｍ，定量体积 １０ μＬ［１７］。
３）甘油的测定 　 配制 ０􀆰 ０５ ｇ ／ ｍＬ ＣｕＳＯ４溶液，
取 １ ｍＬ该溶液与 ３􀆰 ５ ｍＬ的 ０􀆰 ０５ ｇ ／ Ｌ ＮａＯＨ溶液混
合，加入含甘油样品振荡 １２ ｍｉｎ，过滤后在 ６３０ ｎｍ
波长下测定吸光度［１８］。
１􀆰 ４􀆰 ５　 响应面分析试验
以含有甘油的基本盐培养基的各组分为因素
进行优化，利用 Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎ 试验设计对每个
因素设高、低 ２个水平（１，－１），每组试验设 ３ 个平
行，取培养 ６０ ｈ后的样品检测 ＤＨＡ产量。
利用 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计对影响因子最大的
３个因素进行优化，每个因素设高、中、低 ３ 个水平
（１，０，－１），检测培养后的 ＤＨＡ产量。 计算得到关于
ＤＨＡ产量的回归方程和最优培养基组分，并预测最
７３　 第 １期 李英东等：生物转化高浓度甘油生产 １，３ 二羟基丙酮及分批发酵动力学
高的 ＤＨＡ产量，同时对计算结果进行实验验证。
１􀆰 ４􀆰 ６　 正交试验
以响应面分析出的优化培养基培养生产菌株，
根据该菌株分子生物学鉴定结果查找相应文献后，
确定菌种最适条件大致范围［１９－２１］，通过正交试验分
别分析摇床摇速、发酵培养基初始 ｐＨ 以及温度对
ＤＨＡ产量的影响，并得出最适的摇床转速、溶液 ｐＨ
和培养温度。
１􀆰 ４􀆰 ７　 数据统计分析
用 Ｍｉｎｉｔａｂ １６及 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８􀆰 ０６ 软件对响
应面试验结果进行分析并绘制等值图和 ３Ｄ 曲面
图。 通过 ＳＰＳＳ软件对生产菌株 Ｇ４０ 在不同甘油浓
度下随时间变化的细胞浓度、甘油消耗量及 ＤＨＡ产
量作显著性分析。
１􀆰 ５　 菌种分子生物学鉴定及系统发育学分析
以 ２７Ｆ、１４９２Ｒ为引物对 Ｇ４０的基因组进行 ＰＣＲ
扩增，扩增后的 １６Ｓ ｒＲＮＡ经过纯化后寄送上海瑞楚
生物技术有限公司进行测序。 在 ＮＣＢＩ 检索相似序
列后，根据 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ法，通过 ＭＥＧＡ（６􀆰 ０）软
件构建系统发生树，计算自引导值（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ，１ ０００
次重复）以评估系统发生树的置信度。
１􀆰 ６　 分批发酵动力学分析
绘制菌体浓度、甘油残留量和 ＤＨＡ随时间变化
的示意图，分析各参数在分批发酵动力学的关系。
１􀆰 ６􀆰 １　 菌体生长动力学关系式［１９］
①对数生长期的菌体生长动力学关系式
ｄＸ
ｄｔ
＝ μＸ或ｄＮ
ｄｔ
＝ μｎＮ （１）
　 　 两边取自然对数则有
ｌｎ Ｘ ｔ ＝ ｌｎ Ｘ０ ＋ μｔ或 ｌｎ Ｎｔ ＝ ｌｎ Ｎ０ ＋ μｎ ｔ （２）
式中：Ｘ 为菌体质量浓度（ ｇ ／ Ｌ）；Ｎ 为菌体细胞个
数；Ｘ０、Ｘ ｔ分别为初始和 ｔ时间培养后的菌体质量浓
度（ｇ ／ Ｌ）；Ｎ０、Ｎｔ为初始和 ｔ 时间培养后的菌体细胞
个数；ｔ为培养时间；μ为菌体比生长速率；μｎ为以菌
体细胞个数表示的比生长速率。
②菌种生长稳定期的动力学公式，μ 与 Ｓｔ的关
系可用 Ｍｏｎｏｄ方程表示
μ ＝
μｍＳｔ
ＫＳ ＋ Ｓｔ
（３）
式中：ＫＳ是底物亲和常数，其数值相当于 μ 处于最
大比生长速率（μｍ）一半时的底物浓度，反映微生物
对该底物的亲和力，Ｓｔ为稳定期 ｔ 时刻底物剩余量，
也称为生长限制性底物，ＫＳ越大，表明微生物对该
底物的亲和力越低，比生长速率越小。
１􀆰 ６􀆰 ２　 底物消耗动力学关系式
微生物发酵过程中，底物主要消耗于以下三方
面：合成新的细胞物质、合成代谢产物和提供细胞
生命活动的能量。
比生长速率 μ ＝ １
Ｘ
× ｄＸ
ｄｔ
，则有 ｄＳ
ｄｔ
＝ μＸ
ＹＸ／ Ｓ
（４）
同时 μ ＝
μｍＳ
ＫＳ ＋ Ｓ
，则有 ｒＳ ＝ －
ｄＳ
ｄｔ
＝ １
ＹＸ／ Ｓ
×
μｍＳＸ
ＫＳ ＋ Ｓ
（５）
式中：Ｓ为底物质量浓度（ｇ ／ Ｌ），ＹＸ／ Ｓ为细胞得率。
若单位质量细胞在单位时间内的底物消耗量
用 ｑＳ表示，则有
ｑＳ ＝
１
ＹＸ／ Ｓ
×
μｍＳ
ＫＳ ＋ Ｓ
（６）
如果底物消耗的速率方程不考虑单独的产物生成
项，则
ｒＳ ＝ －
ｄＳ
ｄｔ
＝ １
Ｙ∗Ｘ／ Ｓ
ｒＸ ＋ ｍＸ （７）
式中： Ｙ∗Ｘ／ Ｓ为理论细胞得率，表示为长成细胞的质量
与完全消耗于细胞生长的底物的质量之比；ｍ 为维
持细胞结构和生命活动所需能量的细胞维持系数；
ｒＸ 为菌体生长速率；ｒＳ 为底物消耗速率。
ｒＳ ＝ －
ｄＳ
ｄｔ
＝ １
Ｙ∗Ｘ ／ Ｓ
ｒＸ ＋ ｍＸ ，两边除以 Ｘ 再将 ｑＳ ＝
１
ＹＸ／ Ｓ
μ代入式中，得到
１
ＹＸ／ Ｓ
＝ １
Ｙ∗Ｘ／ Ｓ
＋ ｍ
μ
（８）
因此，底物消耗动力学模型可表示为
ｒＳ ＝ －
ｄＳ
ｄｔ
＝ １
Ｙ∗Ｘ／ Ｓ
ｒＸ ＋ ｍＸ ＋
１
ＹＰ ／ Ｓ
ｒｐ （９）
式中：ＹＰ ／ Ｓ为产物的得率系数（也是底物转化为产物
的转换率）；ｒＰ为产物生长速率。
１􀆰 ６􀆰 ３　 代谢产物的合成与微生物生长的动力学
关系
根据 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ Ｐｉｒｅｔ方程，当菌体的目的代谢产
物与菌体生长部分偶联时，微生物生长动力学方程为
ｄＰ
ｄｔ
＝ α ｄＸ
ｄｔ
＋ βＸ （１０）
式中： ｄＰ
ｄｔ
为产物生成速率； α为与菌体生长有关的产
物生成系数； β为与菌体浓度有关的产物生成系数。
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＤＨＡ生产菌的筛选
经过富集和纯化后筛选得到 ４０ 株菌体可以在
高浓度的甘油中生长，通过高效液相色谱复筛得到
１株可以较高效产生 ＤＨＡ（产量为 ２９􀆰 ４６ ｇ ／ Ｌ）的
菌，命名为 Ｇ４０。
将测得的 ＤＨＡ 生产菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列输入
ＮＣＢＩ网站进行在线的序列同源性比对，网站检索结
果显示 Ｇ４０ 菌的序列与芽胞杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ􀆰 ）
相似度较高，可知 Ｇ４０为芽胞杆菌属。 ＰＣＲ 纯化结
果如图 １所示，系统进化树如图 ２所示。
２􀆰 ２　 ＤＨＡ生产菌培养基优化
Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎ试验设计及结果如表 １所示。
根据 Ｅｘｐｅｒｔ ｄｅｓｉｇｎ 软件设计的 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ 试验
表进行试验，Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ 试验结果的主效应图和
曲面图如图 ３和 ４所示。
图 １　 ＰＣＲ纯化结果
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ
图 ２　 基于 １６Ｓ ｒＲＮＡ的系统进化树
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ
表 １　 Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎ试验设计及结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｌａｃｋｅｔｔ⁃Ｂｕｒｍａｎ ｔｅｓｔ
实验组
ρ（成分） ／ （ｇ·Ｌ－１）
Ａ
甘油
Ｂ
Ｋ２ＨＰＯ４
Ｃ
ＮａＣｌ
Ｄ
ＫＨ２ＰＯ４
Ｅ
（ＮＨ４） ２ＳＯ４
Ｆ
酵母提取物
ρ（ＤＨＡ） ／
（ｇ·Ｌ－１）
１ －１ －１ １ １ １ －１ １８􀆰 ９９
２ １ －１ １ －１ －１ －１ ２８􀆰 ０７
３ －１ １ １ －１ １ －１ １９􀆰 ８９
４ １ １ －１ １ １ －１ ２８􀆰 ２８
５ １ －１ １ １ －１ １ ２７􀆰 ５６
６ －１ １ －１ －１ －１ １ １９􀆰 ５５
７ １ －１ －１ －１ １ １ ３０􀆰 ７３
８ １ １ １ －１ １ １ ３３􀆰 ７６
９ －１ －１ －１ １ １ １ ２４􀆰 ７５
１０ －１ １ １ １ －１ １ ２５􀆰 ８７
１１ －１ －１ －１ －１ －１ －１ ２１􀆰 ８７
１２ １ １ －１ １ －１ －１ ３０􀆰 ００
　 　 　 　 注：－１代表基础盐培养基中的相应因子的浓度，１代表基础盐培养基中的相应因子的浓度提升 ２５％后的浓度。
９３　 第 １期 李英东等：生物转化高浓度甘油生产 １，３ 二羟基丙酮及分批发酵动力学
图 ３　 Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎ关于 ＤＨＡ产量的主效应图
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔ ｐｌｏｔ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＨＡ
　 　 根据 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ实验结果，经过软件模拟去
除不显著项后得到 ＤＨＡ 生产量的回归方程，见式
（１１）。
ＤＨＡ 生产量 ＝ ７８􀆰 ３８ ＋ ３􀆰 ３６ＡＢ － ０􀆰 ４７ＡＣ ＋
０􀆰 １３ＢＣ － ８􀆰 ７３Ａ２ － ５􀆰 ４０Ｂ２ － ３􀆰 ９１Ｃ２ （１１）
回归方程系数显著性检验如表 ２ 所示。 由表 ２
可知，模型回归 Ｐ＞Ｆ 的值小于 ０􀆰 ０１，可知该模型与
实际值较为相符，结果可靠。
根据 ＤＨＡ生产量的回归方程式算得产 ＤＨＡ菌
图 ４　 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ试验 ３Ｄ曲面图
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ３Ｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ ｔｅｓｔ
的最优培养基成分 （ ｇ ／ Ｌ）：甘油 ２２４􀆰 ２２、Ｋ２ ＨＰＯ４
１􀆰 ６０、ＮａＣｌ ０􀆰 ５、ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ５、（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ０􀆰 ５、酵母
提取物 １􀆰 ６，模型预测最大产量为 ７８􀆰 ３８ ｇ ／ Ｌ，通过 ４
组平行实验验证，在最优培养基中，ＤＨＡ 平均产量
为 ７７􀆰 ２８ ｇ ／ Ｌ，与预测值相差不大。
２􀆰 ３　 发酵条件正交试验优化
根据 ｍｉｎｉｔａｂ软件设计的正交试验表进行试验，
正交试验结果主效应图如图 ５ 所示。 由图 ５ 可知：
在 ｐＨ ７􀆰 ２、摇床转速 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ、温度 ３５ ℃时，ＤＨＡ
的产量最大，模型预测最大 ＤＨＡ产量为 ８８􀆰 ８１ ｇ ／ Ｌ，
经过 ４组平行验证试验得 ＤＨＡ 产量为 ８６􀆰 ８４ ｇ ／ Ｌ，
比优化前提高了 １９４􀆰 ８％。
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
表 ２　 二次多项模型及多项式的方差分析
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ ｍｏｄｅｌ
来源 平方和 自由度 均方差 Ｆ值 Ｐ值 显著性
模型 ４４１􀆰 ９　 ６ ７３􀆰 ６５ ９􀆰 ９６　 ０􀆰 ００２ ４ ∗∗
ＡＡ ４５􀆰 ０９ １ ４５􀆰 ０９ ６􀆰 １ ０􀆰 ０３８ ７ ∗
ＣＦ ０􀆰 ８６ １ ０􀆰 ８６ ０􀆰 １２ ０􀆰 ７４１ １
ＡＢ ０􀆰 ０６２ １ ０􀆰 ０６２ ０􀆰 ００８ ４５ ０􀆰 ９２９
ＡＣ ２８１􀆰 ５４ １ ２８１􀆰 ５４ ３８􀆰 ０８ ０􀆰 ０００ ３ ∗∗∗
ＢＣ １０７􀆰 ５５ １ １０７􀆰 ５５ １４􀆰 ５５ ０􀆰 ００５ １
Ａ２ ５６􀆰 ４４ １ ５６􀆰 ４４ ７􀆰 ６３ ０􀆰 ０２４ ６ ∗∗
Ｂ２ ５９􀆰 １４ ８ ７􀆰 ３９
余差 ５６􀆰 ５９ ６ ９􀆰 ４３ ７􀆰 ４ ０􀆰 １２３ ８
失拟项 ２􀆰 ５５ ２ １􀆰 ２７
纯误差 ５０１􀆰 ０４ １４
总和 ４４１􀆰 ９ ６ ７３􀆰 ６５ ９􀆰 ９６ ０􀆰 ００２ ４ ∗∗
　 　 　 　 　 　 　 注：∗∗∗表示非常显著（Ｐ＜０􀆰 ００１）；∗∗表示较为显著 ｔ（Ｐ＜０􀆰 ０１）；∗表示显著（Ｐ＜０􀆰 ０５）。
图 ５　 正交试验主效应图
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｍａｉｎ ｅｆｆｅｃｔ ｐｌｏｔ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ
２􀆰 ４　 分批发酵动力学分析
２􀆰 ４􀆰 １　 菌体生长动力学分析
ＤＨＡ生产菌的细胞浓度、ＤＨＡ 生产量及甘油
底物浓度随时间的变化如图 ６所示。
图 ６　 发酵动力学参数
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
从图 ６中可以看出：ＤＨＡ在培养 １０ ｈ后进行生
产，在 ＤＨＡ生产菌的延滞期没有生成量；８～２０ ｈ 为
ＤＨＡ生产菌的无限制对数生长期。 图 ６ 中所统计
出的 Ｇ４０生长曲线生长趋势充分地表现了高浓度
的有机溶剂对细胞会产生一定的毒害作用，从而使
得细胞的生长速度变缓慢的现象［２０］。 这一现象在
以全培养液培养的对数期菌液在高浓度甘油培养
液中培养 ８ ｈ后进入对数生长期时表现出来。 正常
情况下，芽胞杆菌属延滞期不会超过 ４ ｈ，菌种由对
数期转入平稳期的时间也比正常情况下稍长，这有
效地说明了菌种在高浓度甘油下生长受到了抑制。
但是在一些情况下，这种有机溶剂也会对细胞分泌
的产物有促进和催化的作用，细胞以分泌产物来维
持细胞内外渗透压或包裹细胞以此隔阂与有害物
质的接触［２１］，因而在本研究中所使用的筛选菌体在
高浓度的甘油条件下，细胞生长受到影响并诱发了
ＤＨＡ的大量分泌，从而提高了 ＤＨＡ 产量。 根据菌
体生长动力学方程 ｌｎ
Ｘ ｔ
Ｘ０
＝ μｍ ｔ计算 μｍ ，将数据代入
Ｏｒｉｇｉｎ计算得 μｍ ＝ ０􀆰 ２２９ ９５。 将计算所得 μｍ 代入
方程进行方差分析，方差分析结果如表 ３所示，线性
回归分析如表 ４所示。
在 ２０～３２ ｈ，ＤＨＡ生产菌在抑制作用下生长缓
慢，但是未达到平稳期，这一时期的 μ值计算通过将
１４　 第 １期 李英东等：生物转化高浓度甘油生产 １，３ 二羟基丙酮及分批发酵动力学
数据代入 μ ＝
μｍＳｔ
ＫＳ ＋ Ｓｔ
， μｍ＝ ０􀆰 ２２９ ９５，则 ＫＳ ＝
μｍ
２
＝
０􀆰 １１５，计算得 μ ＝ ０􀆰 ２２７ ９９，将 μ值代入原方程检验
拟合度，结果显示 Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９９ ９，表明公式高度符合
实际数据。 则 ＤＨＡ 生产菌在生长阶段的延滞期 μ
＝ ０，对数生长期 μｍ ＝ ０􀆰 ２２９ ９５，平稳期 μ ＝ ０􀆰 １１５，稳
定期 μ ＝ ０，底物亲和系数 ＫＳ ＝
μｍ
２
＝ ０􀆰 １１５。
表 ３　 生长动力学公式的方差分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒｍｕｌａ
分析项 自由度 平方和 均方差 Ｆ值 Ｐ＞Ｆ
模型 １ ５􀆰 ０７６２ ８ ５􀆰 ０７６２ ８ ２５８􀆰 ０４９ ６４ ０􀆰 ００３ ８５
误差 ２ ０􀆰 ０３９ ３４ ０􀆰 ０１９ ６７
总和 ３ ５􀆰 １１５ ６２
表 ４　 生长动力学的线性回归分析
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃｓ
截距 斜率
截距值 标准误差 斜率值 标准误差
统计学分析
校正决定系数
０ — ０􀆰 ２２９ ９５ ０􀆰 ０１４ ３１ ０􀆰 ９８８ ４６
２􀆰 ５􀆰 ２　 代谢产物的合成与微生物生长的动力学
菌体按不同的产物生产形式可以划分为生长偶
联型、非生长偶联型和部分生长偶联型 ３ 种形式，从
实验数据分析得：筛得的 ＤＨＡ生产菌为部分生长偶
联型，则根据 Ｌｕｅｄｅｋｉｎｇ 等提出的模拟方程式：
ｄＰ
ｄｔ
＝ α ｄＸ
ｄｔ
＋ βＸ来描述菌体生长与产物之间的关系，
对方程两边同时除以 Ｘ则有 ｑｐ ＝ αμ ＋ β ，其中 ｑｐ为
比产物合成速率，其中由图 ６可知菌体在 ８～２８ ｈ 生
长的同时也在产生 ＤＨＡ，将 ８～２８ ｈ实验数据代入公
式，用 Ｏｒｉｇｉｎ 软件拟合后得到 α ＝ １􀆰 ０４３ ６６；β ＝
０􀆰 ０１２ １７，方程拟合方差分析表如表 ５所示，回归分析
如表 ６所示。 由方差分析 Ｐ＜０􀆰 ０５得出拟合度较好，
由方差分析和方程拟合图可见，α、β 值带入公式后能
较好地表现菌体生长与产物形成间的实际情况。
表 ５　 产物合成的方差分析
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
分析项 自由度 平方和 均方差 Ｆ值 Ｐ＞Ｆ
模型 １ ０􀆰 ０１５ ７５ ０􀆰 ０１５ ７５ ２３􀆰 ２１５ ５８ ０􀆰 ００８ ５３
误差 ４ ０􀆰 ００２ ７１ ６􀆰 ７８Ｅ ０４
总和 ５ ０􀆰 ０１８ ４６
表 ６　 产物合成的线性回归分析
Ｔａｂｌｅ ６　 Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
截距 斜率
截距值 标准误差 斜率值 标准误差
统计学分析
校正决定系数
０􀆰 ０１２ １７ ０􀆰 ０２３ ３７ １􀆰 ０４３ ６６ ０􀆰 ２１６ ６１ ０􀆰 ８１６ ２８
２􀆰 ５􀆰 ３　 底物消耗动力学关系式
将实验数据代入底物消耗动力模型
ｒＳ ＝ －
ｄＳ
ｄｔ
＝ １
Ｙ∗Ｘ／ Ｓ
ｒＸ ＋ ｍＸ ＋
１
ＹＰ ／ Ｓ
ｒＰ
得： ｍ ＝ ０􀆰 １２４ ６８， １
Ｙ∗Ｘ／ Ｓ
＝ １􀆰 ３６５ ７８， １
ＹＰ ／ Ｓ
＝ ０􀆰 ４２０ ７４
将计算值代入底物消耗动力模型中进行方差
分析，结果如表 ７所示，由方差分析 Ｐ＜０􀆰 ０５ 得出拟
合度较好。 模拟参数 ｍ、 １
Ｙ∗Ｘ／ Ｓ
、 １
ＹＰ ／ Ｓ
对自变量 ｒＸ、Ｘ、ｒＰ
的残余量分析，如图 ７～９所示。
表 ７　 底物消耗动力模型的方差分析
Ｔａｂｌｅ ７　 Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ
分析项 ＤＦ 平方和 均方差 Ｆ值 Ｐ＞Ｆ
回归分析 ３ ８５􀆰 ８００ ９１ ２８􀆰 ６００ ３ ５２２􀆰 ００７ ０􀆰 ００１ ９１
余差 ２ ０􀆰 １０９ ５８ ０􀆰 ０５４ ７９
未修正项和 ５ ８５􀆰 ９１０ ４９
修正项和 ４ ０􀆰 ０１０ １３
图 ７　 模拟参数对自变量 ｒＸ的残差分析
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｒｅｓｉｄｕａｌ ｖｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒＸ Ｐｌｏｔ
图 ８　 模拟参数对自变量 Ｘ的残差分析
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｒｅｓｉｄｕａｌ ｖｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｘ Ｐｌｏｔ
２４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
图 ９　 模拟参数对自变量 ｒＰ的残差分析
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｒｅｓｉｄｕａｌ ｖｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒＰ Ｐｌｏｔ
３　 结论
通过筛选得到 １株甘油高耐性的 ＤＨＡ生产菌，
通过对其培养基成分和培养条件进行优化，使 ＤＨＡ
的产量得到了显著提高。 分子生物学实验表明 Ｇ４０
为芽胞杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ􀆰 ），不同于以往研究的
ＤＨＡ氧化葡萄糖酸杆菌 （Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）。
通过分批发酵动力学分析和检测发现，此菌种生产
ＤＨＡ的方式为部分生长偶联型发酵，并建立了各参
数的动力学模型，各模型 Ｐ 值均小于 ０􀆰 ０５，较好地
反映了菌体浓度与比生长率、底物消耗量以及产物
合成量之间的关系。 研究过程中 ＤＨＡ 产物的形成
在 ４８ ｈ后明显放缓，这可能是由于 ＤＨＡ 在培养液
中大量累积，对 Ｇ４０菌的产物形成酶产生了抑制作
用，也可能是产物形成酶的酶活性在发酵结束前逐
渐失活造成的。 通过本文的研究为 Ｇ４０ 的工业化
生产奠定了一定基础，并为今后进一步放大实验及
连续发酵过程中进行优化调控提供参考。
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（责任编辑　 管　 珺）
３４　 第 １期 李英东等：生物转化高浓度甘油生产 １，３ 二羟基丙酮及分批发酵动力学