全 文 ：Sep．2008
· 36·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第5期
2008年9月
豆粕水解液为氮源发酵产脂肪酶的研究
朱耀光，谭天伟
(北京化工大学 生命科学与技术学院，北京市生物加工过程重点实验室，北京100029)
摘 要：研究了以豆粕水解液作为氮源，假丝酵母c口利池sP．99—125发酵生产脂肪酶的过程。分析水解时间对于
产酶的影响，对比豆粕水解前后作为氮源发酵时的产酶规律。在30L发酵罐中批次发酵酶活最高可达
6000IU／mL，采用豆油反馈流加之后，发酵脂肪酶活力可达8500IU／mL。
关键词：脂肪酶；水解；豆粕
中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05-0036—04
Lipaseproductionbyusinghydrolyzedsoybeanmealasnitrogensource
ZHUYao—guang，TANTian-wei
(CollegeofLifeScienceandTechnology，BeijingBioprocessK yLaboratory，BeijingUniversity
ofChemicalTechnology，Beijing100029．China)
Abstract：ByusinghydrolyzedsoybeanmealasnitrogensourceinCandidasp．99—125fermentationits
productionprocesswainvestigated．Theeffectof ydrolyzingtimeandifferencesoflipaseproduction
betweenusingsoybeanmealandhydrolyzedsoybeanmealasnitrogensourcewasanalyzed．Batchfermen—
tationina30Lfermentorwasuptohighlipaseactivityof6000IU／mL．ByusingpH—responsiveadding
strategy，thefinallipaseactivityreached8500IU／mL．
Keywords：lipase；hydrolyzed；soybeanmeal
脂肪酶(LipaseEC3．1．1．3)，又称三酰基甘油
酰基水解酶(Triacylglycerolacylhydrolase)，是分解
脂肪的酶⋯。脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它
可作用于甘油三酯的酯键，将甘油三酯降解为甘油
二酯、单甘酯、脂肪酸。
脂肪酶在动植物的各种组织及许多微生物中都
普遍存在，在生物体内有着相当重要的生理功能。脂
肪酶由于来源不同可以分为动物脂肪酶、植物脂肪酶
和微生物脂肪酶。而微生物脂肪酶由于种类多、易于
大量生产及提纯等优点，是工业用脂肪酶的重要来
源，常见的包括假丝酵母(饧蒯如sp．)口。1、根
霉．4J、青霉‘5o和假单胞菌帕1等产生的脂肪酶，其中假
丝酵母是国内外研究较多的产脂肪酶菌种。
目前国内对于脂肪酶的发酵工艺研究有一些
报道，何耀强等"1对假丝酵母99·125脂肪酶的发酵
工艺条件进行了一系列研究，对培养基组成及发酵
条件进行了优化，采用全脂豆粉作为发酵氮源，摇
瓶产酶水平达到5000U／mL，30L发酵罐产酶水平
达到8000U／mL。豆粕和全脂豆粉发酵特征以及
效果相似，但是发酵时间都较长，并且所得发酵液
收稿日期：2008-03-19
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20576013)；国家973计划资助项目(2003CB716002)；北京市自然科学基金资助项目(2071002)；北
京市科技计划资助项目(D0205004040211)；国家杰出青年基金资助项目(20325622)
作者简介：朱耀光(1983一)，男，天津人，硕士研究生，研究方向：生物化工。
联系人：谭天伟．教授，博士生导师，E-mail：twtan@mail．butt．edu．cn
万方数据
2008年9月 朱耀光等：豆粕水解液为氮源发酵产脂肪酶的研究 ·37·
黏度较大，对于后续的分离提取有着很大的影响，
因此在本实验中采用豆粕水解液替代全脂豆粉发
酵，在产酶能力得到提高的同时降低了培养基成
本，并且缩短了发酵时间，大幅提高了发酵效率。
1材料与方法
1．1菌种
假丝酵母(Candidasp．99—125)，本实验室选育
保存。
1．2培养基
摇瓶培养基(g／L)：豆油40，豆粕40，K：HPO。
1，KH2P04l；
原始发酵培养基(∥L)：豆油60，豆粕80，
K2HPO。2，KH2PO。1，加入适量消泡剂；
豆粕水解液发酵培养基(g／L)：豆油60，
K2HPO。2，KH：PO。1，加入适量消泡剂，再加豆粕80
g／L(按照y(蛋白酶)：V(豆粕)：V(水)=1：100：
500加入蛋白酶以及水，40℃水浴搅拌进行水解)。
1．3发酵条件
1．3．1摇瓶培养
250mL锥形瓶中装培养基50mL，从斜面上接
种，放置于旋转式摇床中在26℃下培养120h，转速
220r／min。
1．3．230L发酵罐培养
将发酵培养基(按12L装液量)配好并装入发
酵罐内，121℃下灭菌30rain，冷却至26℃后接种，
搅拌转速350r／min，通风量1m3／(rain·L)。
1．4脂肪酶酶活的测定
采用橄榄油乳化液测定法。
I．5核酸的测定方法
I．5．I纯菌体的获得
摇瓶培养结束后，发酵液5000r／rain离心20
min，用去离子水充分洗涤沉淀菌体，5000r／min离心
20min，收集沉淀菌体于60℃干燥箱中烘干至恒重，
研钵研碎，置干燥处保存备用。
1．5．2核酸的提取测定方法
精密称取0．1g纯菌体，加入25mL质量分数
5％的三氯乙酸溶液，于80℃水浴中提取25min．其
间不断进行搅拌，取出后冰浴冷却，然后5000r／rnin
离心30min，稀释5倍，以质量分数5％三氯乙酸作空
白对照，于260llm处测OD值。
1．5．3实验结果的处理方法
为保证结果的准确可靠，所有测定都进行3次
重复，取其平均值。为比较培养时间、培养基成分
对菌体中核酸含量影响的大小，引入了相对偏差的
概念，其计算方法为：相对偏差(％)=[(测定最大
值一测定最小值)／所有测定值的平均值]×100％。
1．6生物量的测定方法
取lmL发酵液，按照纯菌体核算提取方法提取
核酸，以未经发酵的培养基提取核酸作为空白于
260illn处测OD值，由标准曲线计算得到生物量。
2结果与讨论
2．1 水解液水解时间对摇瓶产酶的影响
豆粕分别水解0(不水解)，l，3，6,9，12h，配成摇
瓶培养基在摇床中发酵5d并测定酶活，结果见图1。
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f(水解)／Il
图l 水解时间对于产酶的影响
Fig．1Effectofusinghydrolyzedsoybeanofdifferent
hydrolyzetimeasNitrogensouseforlipase
fermentation
相对于原始豆粕，将豆粕水解后发酵，发酵5d
时酶活有所提高。水解超过3h对酶活上升无明显
影响，故取3h为最优水解时间。
为了验证上述结论，采用凯氏定氮的测定方法分
析水解不同时间豆粕释放的营养物质的总氮量见图
1曲线。水解3h氮源基本已经全部释放到发酵液
中，发酵液含氮量上升不明显，这与发酵结果相符合。
在接下来的实验中都取3h为最优水解时间。
2．2 豆粕水解液培养基与豆粕培养基成分对比
豆粕水解液对比豆粕本身应用于发酵的优势
在于减少了不溶物的含量，并且使得氮源易于被微
生物吸收利用，通过3组平行实验对比了豆粕水解
前后制成的培养基在灭菌后的不溶物含量以及上
清液含氮量。由表1可知，通过水解豆粕中的氮源
并大量释放到液体培养基中，有利于菌体吸收利
用。同时减少了不溶物的含量，提高了发酵过程中
的溶氧，传质效果。
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万方数据
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表1 豆粕水解液和豆粕成分对比
Table1 Comparisonof ybeanandhydrolyzedofsoybean
g·L一1
豆粕 35．736．833．635．40．230．340．120．23
豆粕水解液26．728．527．427．54．674．554．324．51
2．3 水解液作为氮源产酶规律研究
通过摇瓶实验对比了豆粕水解液发酵和豆粕
发酵的产酶规律，见图2。
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一豆粕水解液酶活一豆粕水解液发酵卜清液含氮量
—·一原豆粕酶活 -．o=-原豆粕发酵上清液含氮量
图2豆粕水解前后作为氮源发酵产酶规律对比
Fig．2Differencesoflipaseproductionh神weenusingsoybean
andhydrolyzedofsoybeanasNitrogensource．
通过图2分析了发酵过程中发酵卜．清液的含氮
量。当采用豆粕水解液作为氮源，发酵液中的初始
含氮量大大高于豆粕作为氮源的情况，随着发酵过
程的进行，含氮量下降，最终消耗剩余大约2．3g／L；
而当采用豆粕作为氮源，初始发酵上清液中的含氮
量很低，这是因为豆粕可溶性不强，随着发酵的进
行，菌体自身合成的蛋白酶催化豆粕中的氮源释放
到培养基中并被菌体消耗利用，总体上体现出含氮
量略有上升。
可见，采用水解液发酵更利于菌体吸收利用氮
源，利于菌体的快速生长，故而产酶周期缩短，如图2
所示，在发酵第5天达到最高点，比豆粕发酵早2d。
2．4水解液上罐规律的研究
2．4．1批次发酵
采用水解液批次发酵结果见图3。从图3中可
见本次选用水解液作为氮源进行发酵效果明显，酶
活上升速率明显快于豆粕作为氮源发酵的情况，酶
活在3d内超过了6000U／mL。然而，当发酵进行
到72h以后，由于培养基中豆油消耗殆尽，pH反弹
剧烈，导致酶活下降很快，最终停止发酵。
图3水解液上罐各参数变化曲线
Fig．3Changesof ermentationparametersin
hydrolysateferm ntation
O．06{
o．04霎
划
2．4．2豆油流加实验
参照批次发酵实验，采用pH反馈流加的策略。
当发酵进行到豆油消耗殆尽，pH有反弹趋势的时候
流加豆油以保持pH稳定在5．0，酶活继续上升，最
终在100h达到8500U／mL。发酵周期相比于使用
豆粕发酵缩短了约20％，从经济角度讲成本节省了
5％以上，见表2。
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图4 pH反馈流加豆油上罐各参数变化曲线
Fig．4Changesoffermentationparametersinhydrolysate
fermentationus ngpH—responseaddingstrategy
表2发酵成本对比
Table2 Comparisonoffermentioncost
影万单位酶活
3结论
1)假丝酵母发酵过程中采用豆粕水解液发酵
万方数据
2008年9月 朱耀光等：豆粕水解液为氮源发酵产脂肪酶的研究 · 39·
可以提高酶活并且缩短发酵周期。
2)通过采用豆粕水解液作为氮源发酵，在30L
发酵罐中，最终酶活可以达到8500U／mL，并且大
幅度提高了发酵效率。
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山西省拟建14处生物质发电项目
山西省对生物能源具体数量及分布情况进行了调查。据调查情况，山西省生物发电规划初步确定，到
2012年，全省要建设14个生物质发电项目，总容量168MW，年发电量9．24亿kW·h，消耗农林剩余物105
万t；到2020年，将规划扩建13个项目，使年发电量达到17．8亿kW·h。据估算，这个数字将占2020年全省
用电总量的0．6％，也相当于太原去年用电总量的近1／10。可以消耗200万t的农林剩余物，可替代100万t
的标准煤。
(朱宏阳)
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