全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&& 年 && 月
生"物"加"工"过"程
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IBD%&%;!#!2P;DJJE;$ <#43;$%&&;%#;%&1
收稿日期%$%&& <%1 <%$
基金项目%国家自然科学基金重点资助项目"$%3#%%#&全国优秀博士学位论文作者专项基金资助项目"$%%!#$#
作者简介%李树波"&!3(#$男$广西桂林人$博士研究生$研究方向%微生物食品制造&刘立明"联系人#$教授$0*HGD>%HDEF>gPDGEFEGE;AI=;XE
微生物生产 Q 羟基丁酮研究进展
李树波&$高"翔&$刘立明&$$$陈"坚&$$
"&;江南大学 食品科学与技术国家重点实验室$无锡 $&1&$$&
$;江南大学 工业生物技术教育部重点实验室$无锡 $&1&$$#
摘"要% 羟基丁酮是一种重要的化学合成中间体和多功能材料$广泛应用于食品)制药)化工等领域( 相比化学
合成法和生物酶转化法$微生物发酵法具有低成本)高纯度)高产率等特点( 本文在详细总结微生物发酵生产 羟
基丁酮在菌种选育)代谢机制以及高产策略等方面研究进展的基础上$展望了微生物发酵法生产 羟基丁酮的优
势和发展方向(
关键词%发酵& 羟基丁酮&代谢机制
中图分类号%b5$$1;$$""""文献标志码%L""""文章编号%$ <#43"$%&&#%# <%%# <%#
X42;4011./I.:42J.56942G3:F.2/27QH-LG42ZLJ3F5/2/0
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"" 羟基丁酮"*8VI@B`V6=?GEBEA#$又名乙偶姻)
甲基乙酰甲醇$具有独特的奶油香味和羟基)羰基
等官能团$可作为一种重要的化学合成中间体和多
功能材料$广泛应用于食品)制药)化工以及烟草等
领域*&+ ( 目前$ 羟基丁酮的主要生产方法有%化
学合成法)酶转化法和微生物发酵法( 其中$化学
合成法应用最多$已实现工业化生产$具体方法包
括%丁二酮部分加氢还原工艺)$$ 丁二醇选择性
氧化工艺和丁酮氯化水解工艺等方法*$+ ( 该法操
作简单易行$但原料)生产成本)环境污染以及产品
安全性等因素制约其进一步的发展应用( 酶转化
法具有底物转化率高)产品纯度高)产物具有一定
的旋光度和操作简单等优点$但反应中酶的用量大
且获取较困难)底物成本高等缺点使该工艺不能应
用到大规模生产中$发展潜力有限( 而微生物发酵
法具有生产成本低廉)对环境友好)产品纯度高)反
应条件温和等优势$能解决化学合成法和酶转化法
所面临的环境)资源)产品质量等问题$已成为 羟
基丁酮的研究热点(
本文综述微生物发酵法生产 羟基丁酮在
菌种选育)代谢机理以及高产策略等方面研究
进展(
D?发酵法生产 Q 羟基丁酮的菌种选育
作为 羟基丁酮的工业生产菌株$应具备%
&#在胞内能大量合成并积累 羟基丁酮&$#生长
迅速$发酵周期短&#利用廉价的糖质原料&1#较高
的转化率及生产强度&(#遗传背景清楚$对人畜安
全等( 自然界中能以糖质原料合成 羟基丁酮的
微生物很多$包括细菌)酵母菌和霉菌$如%肠杆菌
属"257&%$607&@# *+ )沙雷氏菌属"F&%7+# *1+ )克雷
伯氏菌属"B#&6+,&## *(+ )芽孢杆菌属"<0+#),# *#+ )
乳球菌属 " -07$0$00),# *4+ )汉逊酵母属 "R5,&5)A
##
*&%+等"表 &#( 其中$对芽孢杆菌的研究最为深
入$如枯草芽孢杆菌)地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆
菌等$已成为研究微生物发酵生产 羟基丁酮最主
要的菌株(
B?微生物中 Q 羟基丁酮合成与分解
代谢途径
""目前研究表明$在微生物内存在 条以丙酮酸
为前体物合成 羟基丁酮的代谢途径*&(+ "图 &#(
表 D?发酵法生产 Q 羟基丁酮的微生物菌种
E5J60D?!F45./1724QH-LG42ZLJ3F5/2/0942G3:F.2/
菌株 )源 "
" 羟基丁酮#2
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B#&6,+&# $L:7$0 /YT(! 糖蜜 1c %c%1 $c$ *!+
<0+#),,)67+#+, 葡萄糖 1%c# %c14 $$c! *#+
-07$0$00),#07+,,)6,1c#07+, 葡萄糖 !c$3 %c&! $%c( *4+
<0+#),1$#:8:L 聚木糖 &&c %c$1 $!c# *&+
4&5+60+#),1$#:8:L 葡萄糖 !c$1 %c&! &3c( *&&+
<0+#),,)67+#+,)O))&%%$( 糖蜜 (c1 %c# 1c$ *&$+
<0+#),,)67+#+,)MT))&3#! 葡萄糖 ((c( %c44 14c# *&+
<0+#),#+0"&5+9$%8+,T0.%! 葡萄糖 1&c$# &c& 1&c$# *&1+
<0+#),1)8+#),/YT&#&34 葡萄糖2蔗糖 #c%2(3c& &c%(2%c!# &c%2$c% *$+
R5,&5+,1$% *)+#+&%5#$5/+ 葡萄糖 %c#( %c%& %c# *&%+
BND?Q 羟基丁酮的合成途径
如图 &"L#所示%在C&%$607&%&%$*&5&,$B315&)A
8$5+&)<3,)67+#+,中$乙酰 b99与丙酮酸在
$
乙酰
乳酸合成酶的催化下生成
$
乙酰乳酸$再在
$
乙
酰乳酸脱羧酶的作用下$生成 羟基丁酮$该途径
广泛存在于各类细菌微生物中$是目前研究最多)
最透彻的代谢途径( 在这一合成途径中的关键
酶乙酰乳酸合成酶 "L.Y#以 b8/9"?8DGHDEA
IDU8BJU8G?A#和 TF$j为辅因子( 9B=>JAE 等*&#+研究
表明$L.Y酶由催化亚基和调控亚基组成$在细菌中
存在L.Y
"
)
%
和
(
种同工酶$而真菌中仅为 &
种( 对于
$
乙酰乳酸脱羧酶"L./)#$发现其仅存
在细菌中$且不同细菌中L./)性质各异$如醋酸短
杆菌的 L./)由 $ 个亚基组成$最适 UN为 #c%$UO
值为 1c1$而产气杆菌中 L./)最适 UN为 #c$$
]A
$j
))G
$j抑制其活性*&4+ ( L./)的存在是决定该
1# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
9/NUV@=aG?AIA8VI@BFAEGJA& L.Y
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,[/EBEAE7VHG?DXB`DIG?DaAIAXG@6B`V>G?DBE& LB/N0YGXA?BDE IA8VI@BFAEGJAAE7VHAJVJ?AH& )BLXBAE7VHALc
图 D?微生物中 Q 羟基丁酮的合成途径
O.;=D?R0F5J26.:95F-M5L127QH-LG42ZLJ3F5/2/0./I.:4224;5/.1I
途径是否存在的前提条件$如酵母中
$
乙酰乳酸
可由相应的酶催化合成$但因缺乏L./)而导致
$
乙酰乳酸不能脱羧形成 羟基丁酮( 在透彻阐释
L.Y和 L./)酶学性质与结构特性的基础上$ B^*
aGXDWBaG等*&3+对其基因的定位)结构功能和调控因
子进行了深入的研究( 在 <3,)67+#+,中$#,Y 和 #,/
构成一个操纵子 #,Y/编码 羟基丁酮合成途径
中的关键酶 L.Y 和 L./)$而 #,Y/的转录受蛋白
L>Je"-=Ie#))XUL和 LU8L共同调控$#,e缺失可
导致 #,Y表达失活( 实际上$L>Je和 #,操纵子即
为-=Ie和6)/操纵子$其中6)/ e编码转录启动因
子".VJe类#$受乙酸)低 UN和厌氧条件的诱导*&!+ (
但在B37&%+*&5和23&%$*&5&,中$$$ 丁二醇脱氢
酶"-/N#参与构成操纵子 #,Y/*$%+ (
如图 &"-#所示%乙酰 b99与乙酰 )BL在丁二
酮合成酶的作用下生成丁二酮$丁二酮可由-/N催
化生成 羟基丁酮( 但这一途径是否存在于微生物
中$还有待于在胞内是否检测出丁二酮合成酶$因此$
部分研究人员认为此代谢途径并不存在$理由是%&#
至今未在胞内检测出丁二酮合成酶的存在&$#丁二酮
可源于
$
乙酰乳酸的非酶氧化反应*$&+ ( 尽管仍未
检出丁二酮合成酶的存在$但在细菌)酵母"<3,)67+A
#+,
*$$+
)B37&%+*&5G
*$%+
)23&%$*&5&,
*$%+
)F30&%&(+,+&
*$+
#
等微生物中能检测出该途径中另一关键酶依赖
于,L/N
$
的丁二酮还原酶的活性(
通常$编码 -/N与 L.Y)L./)的相关基因位
于同一操纵子 6=IL-)区域内$且受蛋白 )XUL)
L>Je和LU8L的调控*$%+ ( 但也有例外$如<3,)67+#+,
中-/N的编码基因 6/" 位于 G>JY/操纵子以外的
区域*$1+ (
如图 &")#所示%在酵母中发现乙酰 b99可与
乙醛在醛连接酶催化生成 羟基丁酮*$(+ ( 该途径
中没有
$
乙酰乳酸)丁二酮等中间产物的形成$被
认为是最为经济的合成途径(
BNB?Q 羟基丁酮的分解途径
微生物细胞内 羟基丁酮的分解途径主要发
生在两个层面上%&# 羟基丁酮在-/N"以,L/N
$
或,L/j为辅因子#的催化下与$$ 丁二醇发生可
逆转化&$# 羟基丁酮在 羟基丁酮脱氢酶复合
物"LB/N0Y#的催化下生成乙酰 )BL和乙醛$乙
醛进而转化为乙酸或乙醇( 这一途径在 431%$1+$5+A
0),)430%6+5$#+0),中得以验证*$# <$4+ (
综上所述$如要进一步提高 羟基丁酮的生产
效率$需要解决的关键问题包括%&#丙酮酸的快速
合成与积累%丙酮酸是合成 羟基丁酮的前体物
质$提高丙酮酸的合成速度且切断或弱化丙酮酸代
谢支路能高效地积累 羟基丁酮&$#理性调控
L.Y)L./))-/N以及LB/N0Y等关键酶的表达量
或酶活力$将碳流导向 羟基丁酮节点并减少
羟基丁酮的分解代谢&#改变 ,L/N
$
2,L/
j的
比例$提高 羟基丁酮的积累&1#提高底物或目标
产物的转运效率(
Q?提高微生物合成 Q 羟基丁酮的代
谢工程策略
""针对上述关键问题$在透彻理解微生物胞内
羟基丁酮代谢途径及其调控机制的基础上$借助
日益发展的代谢工程策略$通过提高前体物质丙酮
酸的积累)强化合成途径的关键酶)弱化或阻断进
一步代谢途径和改善工业应用环境下的生理功能
(#"第 # 期 李树波等%微生物生产 羟基丁酮研究进展
等策略$可实现 羟基丁酮的高效生产( 相关研究
进展详述如下(
QND?提高丙酮酸的积累
丙酮酸作为合成 羟基丁酮的关键前体物质$
其积累速度和含量将直接决定 羟基丁酮的生产
效率( 尽管 bJG= 等*$3+研究表明$在葡萄糖充足的
条件下$在发酵培养基中添加一定量的丙酮酸有利
于 羟基丁酮的合成( 然而$在 羟基丁酮的发
酵法生产中$很少有研究涉及这一科学问题( 因
此$在发酵法生产丙酮酸的研究中$可借鉴的思路
"以G3*#6%7为例#包括%&#降低丙酮酸的进一步
降解( 通过选育维生素和氨基酸缺陷型菌株$在培
养基中添加亚适量的维生素或氨基酸$使丙酮酸进
一步代谢的关键酶活性处于较低水平$从而实现丙
酮酸的高效积累*$!+ &$#通过优化生产菌株的营养或
环境条件)调控维生素水平和选择最佳供氧模式等
策略$实现丙酮酸的高产量和高产率的相对统
一*%+ &#通过降低胞内辅因子 "Lb9#水平)改变
,L/N
$
氧化途径)加速 ,L/N
$
氧化提高 ,L/j水
平)加速糖酵解途径及使碳代谢流的流向和通量发
生改变等策略$能显著提高丙酮酸的生产强度*&+ (
因此$作为丙酮酸工业生产的菌株光滑球拟酵
母Gc*#6%7 在发酵生产 羟基丁酮方面具有巨
大的优势和潜力( G3*#6%7 是通过高渗环境的筛
选),bM等诱变育种)维生素营养缺陷型选育以及
基于代谢网络提高糖质底物消耗速率和解除丙酮
酸底物抑制等策略$实现了丙酮酸高产量)高产率
和高积累的相对统一$作为 羟基丁酮的潜在生产
菌株$其优势有%&#能高产量)高产率和高生产强度
合成 羟基丁酮的前体丙酮酸$ G3*#6%7 发酵生
产丙酮酸的产量可达 3c& F2.$对葡萄糖产率
%c#$& F2F$生产强度可达到 &c$ F2".!8# *$+ &$#菌
种生理功能清晰$G3*#6%7 模式菌株已完成全基
因组测序和相关基因功能的注释$生理功能逐渐清
晰&#具有铜抗性)多重抗生素抗性)耐酸)耐渗透
压及高抗氧胁迫能力等优良生理特性(
QNB?强化 Q 羟基丁酮合成途径的关键酶
在详尽解析 羟基丁酮合成途径关键酶L.Y)
L./)和-/N的编码基因及调控因子的基础上$通
过增加L.Y)L./)和-/N的表达量或提高胞内二
价金属离子),L/j),L/N
$
等辅因子水平以提高其
酶活$显著提高丙酮酸对 羟基丁酮的转化率( 在
酿酒酵母中因L.Y 对丙酮酸的 B
H
值为 c!$通过
增加L.Y的表达量或提高胞内丙酮酸的浓度$能提
高
$
乙酰乳酸的合成速率*&#+ &同时$提高L./)酶
活性或表达量$可降低
$
乙酰乳酸的氧化脱羧作
用$提高
$
乙酰乳酸对 羟基丁酮的转化率%
->BH_aDJ?等*+在酿酒酵母染色体上整合并表达了
$ 种细菌的L./)基因$在显著降低
$
乙酰乳酸的
氧化脱羧作用的同时提高了 羟基丁酮生产强度(
QNQ?阻断或弱化 Q 羟基丁酮进一步代谢的途径
为了提高 羟基丁酮的积累量$目前工作主要
集中于发展代谢工程或生化工程策略以降低 羟
基丁酮进一步代谢途径中关键酶 -/N和 LB/N0Y
的活性$包括%&#添加酶基因转录表达抑制因子$阻
遏基因的表达或降低基因的表达量*1+ &$#敲除各关
键酶的编码基因$使其表达失活或不表达*(+ &#调
节胞内,L/N
$
等辅因子水平$抑制或降低各关键酶
的活力*&+ ( 在酿酒酵母中$敲除-/N基因能增加
羟基丁酮的积累*(+ ( 而在<3,)67+#+,中$操纵子
GXBL-).的转录表达受 羟基丁酮)LXBe和 YDF.
的共同诱导调控$但其表达受葡萄糖的抑制*1+ (
QNV?改善微生物的生理功能
c1c&"基于,L/j2,L/N
$
强化代谢途径的调控
,L/N
$
),L/
j作为-/N的辅因子$催化 羟
基丁酮的合成与分解代谢反应( 因此$合适比例的
,L/
j
2,L/N
$
有利于提高 羟基丁酮的合成与积
累强度( 通过添加不同还原态 )源等外源电子受
体*#+ ),L/j前体物*4+ )改变溶氧*3+ )温度及胞外
氧化还原电位等生化工程方法$或者通过阻断
,L/N
$
竞争代谢途径*!+ )构建,L/N
$
",L/
j
#代谢
途径及过量表达 ,L/N
$
代谢相关酶等代谢工程策
略*1%+ $实现对,L/j2,L/N
$
比例的调节$进而改变
-/N催化反应的方向和速率以及弱化丙酮酸的其
他代谢支路$实现提高目的产物积累的目标(
c1c$"菌种改良与微生物性能强化的综合应用
基于自然选育)诱变育种等传统育种方法与生
质体融合)基因工程技术等现代分子育种方法的结
合$实现对生产菌株的改良( 同时$通过发酵条件
与发酵过程的优化)反应动力学模型的建立与修正
等策略$强化微生物发酵性能$达到高产量)高产率
和高生产强度相对统一的目的( 任潇等*#+通过单
因素)9-及响应面等优化实验$使 <3,)67+#+,发酵产
羟基丁酮的质量浓度可达 1%c# F2.$产率为
%c14 F2".!8#&QDGB等*&$+通过培养基和培养条件的
优化实验$提高了菌种利用糖蜜和大豆水解液产
## 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
羟基丁酮的发酵性能$其产物质量浓度达至
(c1 F2.&而赵祥颖等*&+通过自然和诱变育种)发
酵条件优化$获得 & 株以葡萄糖为底物)产量达
((c( F2.的枯草芽孢杆菌(
V?展望
羟基丁酮作为一种重要的化学合成中间体
和多功能材料$其应用日益广泛$随着石油等非可
再生资源的日益短缺)人们对天然食品)香料的需
求日渐迫切$以安全)天然和环保为特点的微生物
发酵法已备受社会的关注$其发展前景和市场潜力
巨大(
目前$虽然对微生物合成 羟基丁酮的研究在
代谢机理和工业应用等方面取得了一定的进展$但
仍处于实验室研究开发阶段( 因此$欲全面提高微
生物发酵法的优势和竞争力以及突破微生物发酵
法生产 羟基丁酮工业化的关键瓶颈$在深入研究
微生物代谢机理)详尽分析微生物的经济学本能和
工业生产环境与自然环境的巨大差异的基础上$如
何采用诱变选育)基因工程等分子生物学策略对微
生物进行改造$以提高微生物生产 羟基丁酮的产
量和产率$是未来科研工作者亟需解决的问题(
参考文献%
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社$&!!4;
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*&+"赵祥颖$刘建军$张家祥$等;一株产高纯度 羟基丁酮的枯
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*&1+".D= K]$Z8GEFY .$KBEFK)$A?G>;0CDXDAE?U@BI=X?DBE BCGXA*
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3# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"