全 文 :!10
"!
3
#
2012
$
5
%
M
¶
Ê
Ë
Ì
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.10No.3
May2012
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2012.03.004
OPQI
:2011-09-20
KCR!
:
ÍÎ×Ø)ÙÆÇ8ÉÚÛ
(973
ÚÛ
)
ÓÔÕÖ
(BK2011150);
%nÏÐÑo)ÒÓÔÕÖ
(SBK201122445);
ëiøÀ
ïãîÚÛÓÔÕÖ
(NCET110658)
ST.U
:
Uÿ!
(1986—),
m
,
"##¥ã
,
påÆÇM
,
ÆÇæç
:
89ýM¶WX
;
$
%
(
êã
),
ëì
,Email:yni@jiangnan.edu.cn
6K78ey`
Candidaontarioensis
9:
(R) 2
;
1 (3
;
øÅ
)qr
,
G
H
,
BKL
(
,59: ;<7@:A 78;
_
214122)
7
l
:`
abc]d¬£¤ûefgÑ
CandidaspPT2A,
h¾¿
18SrRNA
WHáij234£
Candidaon
tarioensis。
"
C.ontarioensis
k"lmâ)
(R) 2
n
1 (3
noN
)
Î謥¦¨ÇKLÓ(KLæçb
(
,
GHIp¬¥¦¨ÇKLÓ(KL
:
ôó
30℃,
éR
pH65,
qrÕ
180r/min,
£÷ñ¸òó
200g/L。
íå
2
n
1(3
noN
)
ηñ¸òóá
10g/L
³
,
mâ,F
72h,(R) 2
n
1 (3
noN
)
Îè¬
ee.
s
á
999%,¨
Òá
99%;
tÍñ¸òóÏÐu
30g/L
³
,¨
Òvwá
843%。
íåxyzN{MN|(}
(CTAB)
"
Contarioensis
~4æç¾ïð
(CTABg/L,4℃
vïð
20min),
ù
30g/L
tÍv,F
24h,¨
ͬ
ee
Ó
¨ÒÖ×ÁT
999%
Ó
975%。
mno
:
k"lmâ
;Candidaontarioensis;CTAB;(R)2
n
1(3
noN
)
Îè
;
¾ïð
pqrst
:Q554+.9
6uvBw
:A
6x;t
:1672-3678(2012)03-0017-06
Asymmetricsynthesisof(R)2chloro1(3chlorophenyl)ethanolby
carbonylreductaseproducingstrainCandidaontarioensis
ZHANGBeihua,NIYe,SUNZhihao
(KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyoftheMinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,
JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:AcarbonylreductaseproducingstrainCandidasp.PT2Awasselectedfromstraincolectionof
ourlaboratoryandwasidentifiedasCandidaontarioensisby18SrRNAsequencing.Thefermentation
conditionsandbioreductionconditionsfortheasymmetricsynthesisof(R)2chloro1(3chlorophenyl)
ethanolbyCandidaontarioensiswereoptimizedastemperatureof30℃,initialpHof65,rotationspeed
of180r/min,andcelconcentrationof200g/L.Afterfor72hreaction,thee.e.andtheproductyield
were995% and99%,respectivelyonsubstrateconcentrationof10g/L,whereastheyieldwasdropped
to843% onenhancedsubstrateconcentrationof30g/LUsingC.ontarioensiswholecelspretreated
with4g/LCTABfor20minat4℃,theproducte.e.andtheyieldreached999% and975% onsub
strateconcentrationof30g/Latshortenedreactiontimeof24h
Keywords:asymmetricreduction;Candidaontarioensis;cetyltrimetylammoniumbromide(CTAB);per
meability;(R)2chloro1(3chlorophenyl)ethanol
ÉoB α &Z©PíYZ9|¿{õ
m}À¶>×·£¯(
[1-3]。
Ö
,
YZÉoB
α &ZP_·QXo~M¶,ÍM¶WX,
EêÖ>0)}~¯û
、
Ð~
、
$%Ö
ø=¯
,
ZóÖYZÉo£¯PΪ*>YZæ
ÉA
[4-6]。
·G÷ ßM¶WX}Èæ90+
`aÐýBVÐêSþàQêÖ>
ö
[7-8],
11úÀ¶YZ>Ze
,
àQÍÖ>p
Güð
。
(R) 2
d
-1 (3
de)
)
[PíYZ β39
|¿{õm}
(β3 ARõm})>NOsÊ
[9]。
Ö
,
ËM¶YZ
(R) 2
d
1 (3
de)
)
[P>*þÍ©
[10-14],
ÐÍÑÐÏ
¶·,ÆÊtuK3õV~
NADP+/NAD+
)r
ù+,-M$
,
1ÌUPÊ1:¶YZ>Z
e
,
,^9àcpXG>
[12-14]。
QRË0rst>
100
øB9y4~r
4Èæ>}
,
5ØAB0
2
d
1 (3
de)
)
[O
°¶àQÍû_)`aV®¯~/}~¯>4B
CandidaspPT2A,
!ûE
18SrRNA
@-ÈæA
£
。
VWO4>89:V>
,
;<·G
CTAB
0
:¯©ª)VWE0÷ WX`a
2
d
1
(3
de)
)
[Obc
(R)2
d
1(3
de)
)
[
P>?@
,
ÿ#ó
(R) 2
d
-1 (3
de)
)
[P
>pXM:A£>ªL.y
。
1
~%
11
`
CandidaspPT2A
ørsG4BÇó%a1o
M¶WXý£¯ÄÅÆÇtS/0sÏ_>}5
Ø!
。
12
~%ÞË
2
d
1 (3
de)
)
[O/×1ä2´µh
3
;
ó4
2
d
1 (3
de)
)
[P/5õX£
`abc5Ø
;
e¦½
、
BNP
(
¹ºB
)
Ϻ
6òMXQ¸´µ
;
E7§}Çó89iB§
}
,
ÏÍÀÁÂXoQ¸´µ
。
9y),E
DNA
§}:Ï8j;Æ<
ÑÄQ¸´µ
。
13
K
=wx)
:
>?@ATwx)
(
ÿ>?zó
Z
10°Be'
>>?@Ê
2%
>ATbZ
)。
î-wx)
(g/L):
tuK
50,
9y
20,
KH2PO44,MgSO4·7H2O15;pH60。
89wx)
(g/L):
tuK
10,
BC¡z
20,
CaCl2005;pH65。
14
`ÇÈ
=wx
:30℃
wx
48h。
î-wx
:
wxÖ>=
50mL
>
250mL
KT®s
,
*
30℃、180r/min
"wx
24h。
89wx
:
wx
24h
Þ>î-ÿ
5%
>î
³
50mL
>
250mL
KT®>89wx)s
,
*
30℃、180r/min
"89
20h。
15 Candidasp.PT2A
i
18SrRNA
=
Û`9y),E§}:æ
Candida
sp.PT2A
),E
DNA,
ÿ
CF:5′TCCTCTAAATGAC
CAAGTTTG3′、CR:5′GGAAGGGRTGTATTTATTAG
3′
ó"è[¶0Ö>),Èæ
PCR
,P
、
£@
,
£@Ø>),E@-~
NCBI
Èæþ0
,
G
MEGA40
D·G
N J
uv
Candidasp
PT2A
êqÈXE
[15]。
16
°±Òi¨
2mL
89GÂÆÇ
100mL,
~F
660nm
"££E
OD
ð
,¸
ó
OD660。
U
(
G
)(g/L)
ý
OD660>bô´(ó
U
=17223×OD660-1021。
17
ó\>78#$
50mL
89
,
°i4
(2350×g、
5min),
ÿ
085%
MªÂHI4
2
b
,
Ùä*
10mLK2HPO4KH2PO4(02mol/L,pH65)Ó+
s
,
ÊA£
U>°¶
2
d
1 (3
de)
)
[O
,
~
30℃、180r/min
"Ð
72h,
S;Ð
ê~Ð"
,
¹]§¨ß
3
Eðæ§s
。
18
?@Ä6K78i¨
50mL
89
,
°i4
(2350×g、
5min),
ÿ
085%
MªÂHI4
2
b
,
Ùä*
10mLK2HPO4KH2PO4(02mol/L、pH65)Ó+
s
,
Ê
10g/L2
d
1 (3
de)
)
[O
,
~
30℃、180r/min
"Ð
1h,
G
10mL
[=[^¢
,
AÂ
MgSO4¡J,KëÞûíS¹ºi:¶
>MZ
,
!Úô¹`89s >V®
。
©O_)`aVV®£±
:30℃
"
,
¹iL
WX
2
d
1 (3
de)
)
[OMZ
1μmol(R)
2
d
1 (3
de)
)
[Pµ¶·>V£±ó
1
]V®g
(U)。
81
M
¶
Ê
Ë
Ì
!
10
"
19
er
FG
Agilent´
µ>
Agilent1100
ûíS¹º
(HPLC)
i
。
·GMe1NO£¯
ChiralcelOB
H
¹º¼
(046mm×250mm×5μm),i:
ÂmS
V(
e¦½
)∶V(
BNP
)=90∶10,
Â
10
mL/min,
F
220nm,
¼
30℃。
:
=n(MZ:¶)n(
½¾°¶
)×100%
ee
ð
=
AR-AS
AR+AS
×100%
(s
:AR—S¹ºi R uÁ:¶>Ì?;
AS—S¹ºiSuÁ:¶>Ì?。
2
%)
21 Candidasp.PT2A
i
18SrRNA
`=
Ë0,P5Ø>
CandidaspPT2A
>
18S
rRNA
67),Èæ@-i
(GenBank
nPÍ
:
JN820129),
!G
MEAG40
D·G
N J
uv
CandidaspPT2A
êqÈXE
,
ÂÃçY
1
µè
。
/
Y
1
òÅ
:CandidaspPT2A
ý¥1fÔ 4
Can
didaontarioensis
g*;Ai`
,
QRNêÎ(
,
,^
CandidaspPT2A
A£ó
Candidaontarioensis。
q
1 Candidasp.PT2A
Æóm
Candida
iæç2ÚA
Fig.1 Phylogenetictreeindicatingtheestimated
relationshipsbetweenstrainCandidasp
PT2AandrelatedspeciesofgenusCandida
22 Contarioensis
deÇÈiÙÚ
221
wx)½¾
pH
089:V>?@
wx)½¾
pH
í?@4Mÿ4
²ëîV®¯>×·,¿
。
VW9;wx)½¾
pH
04M
、
:¶
ee
ð
、
_)`aVV®>?@
,
Â
ÃÄY
2。
/Y
2
òÅ
:
½¾
pH
0:¶>
ee
ðÔ
Q?@
,
.04>M~:VQÌêÖ>?@
。
È
½¾
pH
*
65
<
,
4>M~þV®ËÌ
pH
>PÊÍPÊ
;
È
pH
û*
65
<
,
wx$%êÐ9F
*4>M
,
4>M~þV®Çôù"ú>õ
ö
,
,^ü£ÎÙ½¾
pH
ó
65。
q
2
K
pH
C.ontarioensis
deijk
Fig.2 EfectsofpHoncarbonylreductaseproductionof
C.ontarioensis
222
U089:V>?@
89Uí?@4 M~89:V>
×·,¿ÉA
,
,^
,
VW9;89U04M
_)`aVV®>?@
,
ÂÃÄz
1。
/z
1
òÅ
:OD660~V®Ç~30℃<Îû,89U0³
X:¶
ee
ðÔQ?@
。
ËÌU/
30℃
`û
40℃,OD660~V®ÇÞê"ú。,^ü£ÎÈ8
9Uó
30℃。
1
ÉC.ontarioensis
deijk
Table1 Efectsoftemperatureoncarbonylreductase
productionofC.ontarioensis
U
/℃ þV®
/
(U·L-1)
ee
ð
/% OD660
20 003±0001
25 003±0001
30 2259±113 >999 025±0013
35 2023±101 >999 016±0008
40 1625±081 >999 014±0007
223
S³089:V>?@
VW9;S³0
Contarioensis
89>
U_)`aVV®>?@
(
°¶
10g/L)。
4
UË̳>`û9GPÊ
。
ÈS³
*
180r/min
<
,
_)`aVV®ËÌS³
91
!
3
#
Uÿ!ø
:
_)`aV:M4
Candidaontarioensis
bc
(R)2
d
1(3
de)
)
[P
>PÊÍPÊ
,
ÈS³û*
180r/min
,
ü£S³ÿ
180r/min
óá
(
ìè
êè
)。
zÞS³089ËÌs>¡Dÿ·
ÏQÌ×·?@
。
23 Contarioensis
\>78
2
;
1 (3
;
øÄ+ÚÇÈiÙÚ
231
Ó+
pH
090+`a
2
d
-1 (3
d
e)
)
[O>?@
Y
3
êè1
30℃
<9;Ó+½¾
pH
0`
aÐ>?@
。
/Y
3
òÅ
:
9;Ó+
pH
0:
¶>
ee
ðÔQ?@
,
:¶>ÉoBUÇó
999%
ÿ
。
~
pH50~65
lÛ²
,
:¶>:ô`
õö
,
!~
pH65~75
lÛ²zùåÍÖ>³X
íÃ
。
/*:~
pH65
<{Îû
,
Î}~
pH65
ó³XÐÎÈ
pH。
ÆÇzÞ
,
Ó+
pH
0_)`aV>WX®¯QA£>?@
。
q
3
BCD
pH
C.ontarioensis
\>78
2
;
1(3
;
øÄe,Æe
e.e.
Eijk
Fig.3 EfectsofbuferpHonproductyieldande.e.
forasymmetricreductionof2chloro1(3chloro
phenyl)ethanonebyC.ontarioensiswholecels
232
³XU090+`a
2
d
1 (3
de
)
)
[O>?@
~
pH65
Ðê"
,
VW³XU090+
`aÐ>?@
,
ÂÃÄY
4。
/Y
4
òÅ
:
:¶>
ee
ð~
999%
ÿ
,
9{³XU>?@
;
³XU0:¶:>?@9Þê
,
~
30~45℃
l
Û²Ç~
98%~99%。
/*
35℃
<>:ä
þ
30℃
<û1
02%,
,^}~
30℃
óÐ>
ÎȳXU
。
233
S³090+`a
2
d
1 (3
de
)
)
[O>?@
ÐËÌs>·í?@WXí>_·,
¿ÉA
。
,^
,
VWS³0WX
2
d
1 (3
q
4
ÉC.ontarioensis
\>78
2
;
1
(3
;
øÄe,Æe
e.e.
Eijk
Fig.4 Efectsoftemperatureonproductyieldand
e.e.forasymmetricreductionof2chloro1
(3chlorophenyl)ethanonebyContarioensis
wholecels
de)
)
[O`aÐ>?@
,
ÂÃÄY
5。
/Y
5
òÅ
:
ËÌS³>û
,
³XÐê>·
íû
,
:¶>:9GPÊ
,
ȳ1*
180
r/min
<:{Îûð
。
,^
,
ÚYVÿ·í
、
¡D~:¶³X>?@
,
ü£
180r/min
óÎ
ÈS³
。
q
5
FG+HContarioensis
\>78
2
;
1(3
;
øÄe,Æe
e.e.
Eijk
Fig.5 Efectsofrotationspeedonproductyieldand
e.e.fortheasymmetricreductionof2chloro1
(3chlorophenyl)ethanonebyC.ontarioensis
wholecels
234
4
U090+`a
2
d
1 (3
de)
)
[O>?@
Ðês>4
UZz¤ý³XÐ
>V
,
,^
,
VW4
U090+`a
2
d
1 (3
de)
)
[O>?@
(
Y
6),
4
U*
200g/L
<
,
:¶>:ËÌ4
U>
PÊÍPÊ
,
ÍÈ4
U1*
200g/L
<
,
:
¶:9«ZX
,
:¶
ee
ð9{4
UZ
02
M
¶
Ê
Ë
Ì
!
10
"
X>?@Ç~
999%
ÿ
。
,^
,
ü£`aÐ
êsÎÈ4
Uó
200g/L。
q
6
`ÒContarioensis
\>78
2
;
1(3
;
øÄe,Æe
e.e.
Eijk
Fig.6 Efectsofcelconcentrationonproductyieldand
e.e.forasymmetricreductionof2chloro1
(3chlorophenyl)ethanonebyC.ontarioensis
wholecels
235 CTAB
G090+`a
2
d
1 (3
d
e)
)
[O>?@
q
7 CTAB
½Contarioensis
\>78
2
;
1(3
;
øÄÆe
e.e.
Eijk
Fig.7 EfectsofCTABpretreatmentconcentrationon
producteeandyieldforasymmetric
reductionof2chloro1(3chlorophenyl)
ethanonebyContarioensiswholecels
CTAB
íAîQí> :¯©ª}
,
·G
CTAB
09y Èæ⩪
,
òÿQí×åZ
K>:¯
,
ú°¶
/
:¶>·Tn
,
SÍÊ
ÑU WXÐ>
[16-17]。
VW
30g/L
°
¶<9;
CTAB
G
(
⩪
U
)
~
4℃
"0
C.ontarioensis
Èæ⩪
20min
Þ
,
0
90+`aÐ>?@
(
Y
7)。
/Y
7
òÅ
:
ËÌ
CTAB
G>û
,
:¶>:9Gû
,
È
CTAB
Uû*
4g/L
<
,
:¶>:J¾"ú
,
È
CTAB
Uó
12g/L
<
,
:/
989%
úó
971%,^
,
È
CTAB
Uû*
8g/L
<
,
:
¶>
ee
ðîJ¾"ú
,
S
100%
"úó
955%。
:¶>
ee
ð="ú>a,òFíËÌ
CTAB
U>û
,
4 >:¯9Gû
,
Aæ
,
²>Mª$%8MZX
,
0OÐNO_)`a
V>/}~¯:M?@
;
Aæ
,
²WX
:MSÐuÁ:¶>E7_)`aVý°¶>Â
YRP1
,
SÍy8:¶
ee
ð>"ú
。
,^
,
}
~
4g/LCTAB
óÎÈ©ª
U
。
24 CTAB
IJKÏÐCandidaontarioensis
°
±öÚi\>78
2
;
1 (3
;
øÄiLM23
0FG
CTAB
⩪~詪>
Contarioensis
WX>ÐÈÌÈæþÍ
,
ÂÃÄY
8。
/Y
8
òÅ
:
èì
CTAB
©ª>U WX>ÐÈæ
72h
Þ
,
:¶>:~
ee
ðió
843%
~
999%;
Íì
CTAB
⩪> WXÐ
24h
Þ
,
:¶>:~
ee
ði{
975%
~
999%。
0¢>³XÈ棯
HPLC
i
(
Y
9),
:¶>
ee
ð{
999%
ÿ
。
/^òÅ
:
·
G
CTAB
0ÔV9yU Èæ:X©ªÞ
,
ü
M¶ K:¯Pþ
,
°¶ý:¶>·TnQ
íú
,
SÍHسXÐ<Êæç
,
û1M¶
WXÐ>í
。
q
8
N½
CTAB
ÎÏÐÆOÏÐi
C.ontarioensis
°±öÚi\>78
2
;
1(3
;
øÄiLM23
Fig.8 Timecourseofbioreductioncatalyzedby
CTABpretreated(solid)anduntreated
C.ontarioensiscels
3
)
Ë0>9y4~r4Èæ>}
,
5Ø1
òÿûí90+`a
2
d
1 (3
de)
)
[O>
4B
Candidasp.PT2A,
0EÈæ
18SrRNA
A£
,
£Xó¥1fÔ 4
Candidaontarioensis。
12
!
3
#
Uÿ!ø
:
_)`aV:M4
Candidaontarioensis
bc
(R)2
d
1(3
de)
)
[P
q9 Contarioensis
P°±öÚi\>78
2
;
1
(3
;
øÄiQKRSDóT5
Fig.9 ChiralHPLCchromatogramoftheasymmetric
reductionof2chloro1(3chlorophenyl)
ethanonebyContarioensiswholecels
ÆÇ1
C.ontarioensis
89:V~³X
,
ü£ÎÈ89:Vó89U
30℃,
wx
)½¾
pH65;
ÎÈ>³XóÐU
30℃,
Ó
+½¾
pH65,
S³
180r/min,
4
U
200g/L,CTAB
ÎÈ:¯â©ª
Uó
4g/L。
0·G
CTAB
⩪~詪>
C.ontarioensis
W
XÐ<ÊÈÌÈæ1þÍ
,
èì
CTAB
⩪>
WX>ÐÈæ
72h
Þ
,
:¶>:~
ee
ði
ó
843%
~
999%;
Í·G
CTAB
:¯©ª>
WXÐ
24h
Þ
,
:¶>:~
ee
ðòi{
975%
~
999%。
M©6u
:
[1] HaradaH,HirokawaY,SuzukiK,etal.Novelandpotenthuman
andratβ3adrenergicreceptoragonistscontainingsubstituted3
indolylalkylamines[J].BioorgMedChemLet,2003,13(7):
13011305.
[2] PatelRN.Synthesisofchiralpharmaceuticalintermediatesby
biocatalysis[J].CoordinationChemRev,2008,252:659701.
[3] PabelJ,HofnerG,WannerKT.Synthesisandresolutionofrace
miceliprodilandevaluationoftheenantiomersofeliprodilas
NMDAreceptorantagonists[J].BioorgMedChemLet,2000,
10(12):13771380.
[4] PolardDJ,WoodleyJM.Biocatalysisforpharmaceuticalinterme
diates:thefutureisnow[J].TrendsBiotech,2007,25(2):6673.
[5] WoodleyJM.Newopportunitiesforbiocatalysis:makingpharma
ceuticalprocessesgreener[J].TrendsBiotech,2008,26(6):
321327.
[6] ZhangW,NiY,SunZH,etal.Biocatalyticsynthesisofethyl
(R)2hydroxy4phenylbutyratewithCandidakruseiSW2026:a
practicalprocessforhighenantiopurityandproducttiter[J].Proc
Biochem,2009,44:12701275.
[7] deCarvalhoC.C.Enzymaticandwholecelcatalysis:findingnew
strategiesforoldprocesses[J].BiotechAdv,2011,29:7583.
[8] WohlgemuthR.Asymmetricbiocatalysiswithmicrobialenzymes
andcels[J].CurOpinMicrob,2010,13:283292.
[9] DevoceleM,MortreuxA,AgbossouF,etal.Alternativesynthesis
ofthechiralatypicalβadrenergicphenylethanolaminotetraline
agonistSR58611Ausingenantioselectivehydrogenation[J].Tet
rahedrLet,1999,40:45514554.
[10] SawaI,KonishiY,MaemotoS,etal.Processforproducingopti
calyactive()2halo1(substitutedphenyl)ethanoland()
substitutedstyreneoxide:EP,0493617[P].19920807.
[11] LinH,ChenYZ,XuXY,etal.Preparationofkeyintermediates
ofadrenergicreceptoragonists:highlyenantioselectiveproduction
of(R)αhalohydrinswithSaccharomycescerevisiaeCGMCC
2396[J].JMolCatalB:Enzymatic,2009,57:15.
[12] ShimizuS,KataokaM,KizakiN,etal.Processforproducingopti
calyactive(R)2chloro1(3′chlorophenyl)ethanol:EP,
1400594[P].20040324.
[13] KizakiN,SawaI,YanoM,etal.Purificationandcharacterizationofa
yeastcarbonylreductaseforsynthesisofopticalyactive(R)styrene
oxidederivatives[J].BiosciBiotechBiochem,2005,69:7986.
[14] ItohN,MatsudaM,MabuchiM,etal.Chiralalcoholproduction
byNADHdependentphenylacetaldehydereductasecoupledwith
insituregenerationofNADH[J].EurJBiochem,2002,269:
23942402.
[15]
PºW
,
ÕX
,
Yçû
.
89KM:[P4B>>}ýA
£
[J].
?@
,2008,35(2):5860.
[16] YuMA,WeiYM,ZhaoL,etal.Bioconversionofethyl4chloro
3oxobutanoatebypermeabilizedfreshbrewer′syeastcelsinthe
presenceofalylbromide[J].JIndMicrobiolBiotech,2007,34:
151156.
[17] CortezDV,RobertoIC.CTAB,TritonX100andfreezingtha
wingtreatmentsofCandidaguiliermondi:efectsonpermeability
andaccessibilityoftheglucose6phosphatedehydrogenase,xy
losereductaseandxylitoldehydrogenaseenzymes[J].NewBio
tech,2011,29(2):192198.
22
M
¶
Ê
Ë
Ì
!
10
"