全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００４
收稿日期：２０１４－０４－１３
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２００９ＣＢ７２４７０６）
作者简介：于　 敏（１９９１—），女，江苏如皋人，硕士研究生，研究方向：工业生物催化；周　 华（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈｕａ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
大孔树脂共吸附固定葡聚糖 脂肪酶催化合成香茅酯
于　 敏，周海燕，任立伟，蒋振华，周　 华，韦　 萍
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：以大孔树脂为载体对脂肪酶和葡聚糖进行共吸附固定，考察葡聚糖的共吸附对脂肪酶固定化效果的影响，
并应用所得固定化酶在无溶剂体系催化合成月桂酸香茅酯。 结果表明：在固定化过程中添加终质量浓度为 ０􀆰 ７５
ｍｇ ／ ｍＬ的葡聚糖可提高固定化酶酶活回收率，使用该固定化酶在无溶剂体系催化月桂酸与香茅醇酯化，酶的催化
效率及操作稳定性均有提高。 在底物月桂酸与香茅醇物质的量的比为 １ ∶ １，加入 １ Ｕ的固定化脂肪酶，在 ５０ ℃时
无溶剂体系中反应 １０ ｈ，反应的酯化率达 ９５􀆰 ３％。 添加终质量浓度为 ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ的 Ｔ ２０及 Ｔ ４０（葡聚糖相对
分子质量为 ２×１０４ 和 ４×１０４）制备的固定化酶可将到达 ９５％酯化率的反应时间缩短至 ６ ｈ，其中添加 Ｔ ４０的固定
化酶经 １０次连续催化后，仍保持 ７５％以上的催化活性。
关键词：脂肪酶；葡聚糖；共固定；无溶剂；月桂酸香茅酯
中图分类号：Ｑ８１４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００１８－０６
Ｃｏ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｌｉｐａｓｅ ｏｎ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ
ｒｅｓｉｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｙｌ ｅｓｔｅｒｓ
ＹＵ Ｍｉｎ，ＺＨＯＵ Ｈａｉｙａｎ，ＲＥＮ Ｌｉｗｅｉ，ＪＩＡＮＧ Ｚｈｅｎｈｕａ，ＺＨＯＵ Ｈｕａ，ＷＥＩ Ｐｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｉｐａｓｅ ａｎｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｗｅｒｅ ｃｏ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ａ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ，ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ
ｃｏ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｙｌ ｌａｕｒａｔｅ． Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ ｃｏ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｘｔｒａｎ ｗｉｔｈ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０􀆰 ７５
ｍｇ ／ ｍＬ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅ
ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ ９５􀆰 ３％ ａｆｔｅｒ １０ ｈ，ｗｈｅｎ １ Ｕ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｄｏｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ａｔ ５０ ℃ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｏ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ ｏｆ １ ∶ １． Ｍｏｒｅ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔｌｙ，ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｔｏ ６ ｈ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ⁃２０ （Ｍｗ ＝２×１０４） ａｎｄ
Ｔ⁃４０ （Ｍｗ ＝４×１０４） ｗｉｔｈ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅ
ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｓｔｉｌｌ ａｂｏｖｅ ７５％ ａｆｔｅｒ ｔｅｎ ｒｅｃｙｃｌｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｐａｓｅ； ｄｅｘｔｒａｎ； ｃｏ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｆｒｅｅ； ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｙｌ ｌａｕｒａｔｅ
　 　 糖类物质是生物机体的重要组成成分和能量供
应者，自然界中存在很多活性多糖，已被应用于治疗
肿瘤及增强免疫力等方面。 除此之外，糖类物质也被
用作酶、疫苗等生物活性材料的保护剂［１］。 其中，海
藻糖由于其极佳的保护效果已引起国内外学者的关
注，海藻糖对酶活性的保护机制主要有水替代学说、
玻璃态假说及优先排阻学说［２－４］。 杨基础等［５］研究
了海藻糖对纤维素酶在干燥和存放过程中的保护作
用，发现海藻糖能有效地减少干燥过程中酶的热失
活，而且能提高纤维素酶存放过程中的热稳定性。 杨
小民等［６］发现在高温下，葡聚糖对纤维素酶也有明显
的保护作用。 柴丽红等［７］的研究也证明海藻糖及葡
聚糖均能提高乳链菌肽热处理后的稳定性。 所以，除
已被深入研究的海藻糖外，葡聚糖在酶活性保护作用
方面也极具潜力。
酶的固定化技术经过近几十年的研究，从固定
化材料到固定化方法均已取得较大的发展［８－１０］，但
固定化酶在活性、稳定性、工业应用性等方面仍存
在一些问题。 已有学者尝试在酶固定化及催化过
程中添加一定浓度的糖醇类物质对酶进行保护以
提高固定化酶的性能［１１－１２］，现有的方法是先将酶吸
附或共价于固定化载体再浸渍小分子二糖后烘干，
这种固定化方法的不足之处是糖与载体的相互作
用不明确且存在容易脱落等缺点。 Ｊｉａｎｇ 等［１３］在非
水相催化合成植物甾醇酯的过程中添加微量海藻
糖溶液，显著提高了固定化脂肪酶的催化效率及操
作稳定性，但海藻糖来源有限，其价格较高，且每次
反应前均需要重新添加，增加了成本及工作量。
笔者以大孔树脂为载体，同时对脂肪酶和葡聚
糖进行吸附，尝试通过最简单的方法将酶与大分子
多糖共同固定于孔道微环境，使两者在非水相催化
过程中可稳定存在于载体内，以进一步提高脂肪酶
在无溶剂体系催化香茅醇与脂肪酸酯化反应能力，
并提高固定化酶的催化稳定性，建立一种简单、高
效的固定化方法。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与仪器
Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｌｉｐａｓｅ（ＣＲＬ），Ｓｉｇｍａ 公司；大孔
树脂 ＮＫＡ，南开大学化工厂；正己烷（ＡＲ）、月桂酸
（ＣＰ），国药集团化学试剂有限公司；葡聚糖（相对
分子质量为 ０􀆰 ６×１０４、２×１０４、４×１０４、７×１０４，＞９８％），
美国 Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；对硝基苯基乙酸酯（ＡＲ），日
本 ＴＣＩ 公司；β 香茅醇（９５％）、丁酸丁酯（９９􀆰 ５％，
色谱纯），阿拉丁试剂。
ＴＨＺ Ｃ 型摇床，江苏太仓实验设备厂； ＢＳ
１２４Ｓ型电子天平，德国赛多利斯公司；Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０
型气相色谱仪，美国安捷伦公司；ＤＺＦ ６０２０型真空
干燥箱，上海博迅实业公司；Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５ 型傅里叶红
外光谱仪，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ公司。
１􀆰 ２　 脂肪酶的固定化
按照供应商提供的方法对大孔树脂 ＮＫＡ进行预
处理。 将适量 ＣＲＬ用 ｐＨ ５􀆰 ０（０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ）的磷酸盐
缓冲液配制成质量浓度为 ４ ｍｇ ／ ｍＬ 的酶溶液，４ ℃、
１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ以去除不溶物，取 ５ ｍＬ上清
液并添加不同相对分子质量的葡聚糖（０􀆰 ６×１０４、２×
１０４、４×１０４、７×１０４，分别简写为 Ｔ ６、Ｔ ２０、Ｔ ４０、
Ｔ ７０）至终质量浓度分别为 ０􀆰 １、０􀆰 ３、０􀆰 ７５、１􀆰 ２ 和
１􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ，混匀后加入 ０􀆰 １ ｇ 载体。 ３０ ℃吸附 ５ ｈ
后，用砂芯漏斗抽滤提取固定化酶，并用 ５ ｍＬ ｐＨ ５􀆰 ０
（０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ）的缓冲液冲洗固定化酶数次。 再用少
量 ｐＨ ７􀆰 ０（０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ）的磷酸盐缓冲液浸泡固定化
酶 ２０ ｍｉｎ后，将固定化酶于 ３０ ℃真空干燥 ４８ ｈ，利用
酶的“ｐＨ记忆性”将脂肪酶的构象调至最适宜催化
的状态。
１􀆰 ３　 蛋白及葡聚糖装载量测定
采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［１４］测定蛋白装载量，以牛血清
白蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线，测定原酶液、
固定化后余液和洗脱液中的酶蛋白含量。 酶蛋白
装载量（Ｐａ）
Ｐａ ＝（ρｉ－ρｆ）Ｖｉ ／ ｍ （１）
式中：ρｉ表示溶液中固定化前酶蛋白的初始质量浓
度（ｍｇ ／ ｍＬ）； ρｆ表示固定化过程中未被结合的酶蛋
白的最终质量浓度（ｍｇ ／ ｍＬ）；Ｖｉ表示加入酶液的体
积（ｍＬ）；ｍ表示载体质量（ｇ）。
葡聚糖装载量采用蒽酮 硫酸法测定［１５］。
１􀆰 ４　 固定化酶酶活测定
以对硝基苯基乙酸酯（ ｐ ＮＰＡ）为底物，采用
比色法测定游离和固定化脂肪酶的水解活性［１６］，配
制浓度为 ０􀆰 ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ｐ ＮＰＡ 的乙腈溶液，取 ５
ｍＬ 加入到 ３５ ｍＬ 的磷酸缓冲液 （ ｐＨ ７􀆰 ０， ０􀆰 ０２
ｍｏｌ ／ Ｌ）中，加入适量固定化酶或游离酶。 ３７ ℃反应
１０ ｍｉｎ后，迅速取出 １ ｍＬ 上清液并进行适当稀释，
在 ４１０ ｎｍ处测吸光值。 空白以空载体代替固定化
酶。 在 ３７ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０的条件下，１ ｍｉｎ内水解产生 １
μｍｏｌ ｐ ＮＰ 所需要的酶量定义为一个活力单位
（Ｕ）。 酶活回收率为固定化酶总活力与加入游离酶
酶活之比［１７］。
１􀆰 ５　 固定化酶热稳定性测定
将游离酶和固定化酶分别溶解或悬浮于 ｐＨ
５􀆰 ０的磷酸盐缓冲液中，在 ５０ ℃水浴中分别放置
０􀆰 ５、１、２、３、４和 ５ ｈ后，迅速冷却至室温。 再测定经
９１　 第 ６期 于　 敏等：大孔树脂共吸附固定葡聚糖 脂肪酶催化合成香茅酯
过热处理的游离酶和固定化酶的相对活性。
１􀆰 ６　 固定化酶 ｐＨ稳定性测定
以比色法测定脂肪酶水解活性为基础，改变部
分反应条件测定固定化酶水相催化最适 ｐＨ。 其他
条件不变，将底物 ｐ ＮＰＡ 的乙腈溶液分别加入到
ｐＨ ４􀆰 ０～８􀆰 ０（０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ）的缓冲液中，以此为反应
液分别测定游离酶和固定化酶的水解活性。
１􀆰 ７　 月桂酸香茅酯的合成及检测
向 １０ ｍＬ具塞锥形瓶中加入 ２ ｍｍｏｌ β 香茅醇
和 ２ ｍｍｏｌ月桂酸，５０ ℃摇床中预热，待酰基供体熔
解后加入 １ Ｕ干燥后的固定化脂肪酶（约 ０􀆰 ０５ ｇ）和
４ μＬ去离子水，摇床转速 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ，５０ ℃反应 ２ ｈ
后，加入 ０􀆰 ５ ｇ的 ４Å分子筛，间隔一定时间取样 １０
μＬ，用 ７９０ μＬ正己烷稀释，加入 ２００ μＬ ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
的丁酸丁酯作为内标，０􀆰 ２２ μｍ 有机滤膜过滤。 采
用 Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０ 型气相色谱仪测定香茅醇的转化
率，色谱条件如下：载气 Ｎ２；检测器 ＦＩＤ，２９０ ℃；气
化室 ２４０ ℃；色谱柱 ＰＥＧ ２０Ｍ（１５ ｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×
０􀆰 ２５ μｍ）；柱室温度 ５０ ℃，维持 ２ ｍｉｎ，以 ２０
℃ ／ ｍｉｎ 升温至 ２１０ ℃并维持 ３ ｍｉｎ。 通过内标法计
算香茅醇的含量。
酯化率＝［１－（ｍ２ ／ ｍ１）］×１００％ （２）
式中：ｍ１、ｍ２分别为反应前后反应液中香茅醇的质
量。 固定化酶的回收方法参照文献［１８］。
１􀆰 ８　 红外图谱分析
对脂肪酶 ＣＲＬ、葡聚糖及葡聚糖处理后的 ＣＲＬ
进行分析。 采用 ＫＢｒ压片法（质量比 １ ∶ １００），图谱
采集范围为 ４００～ ４ ０００ ｃｍ－１，图谱以透过率的方式
表示。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 大孔树脂对葡聚糖的吸附效果
　 　 分别添加不同浓度及不同分子量的葡聚糖，考
察大孔树脂对葡聚糖的吸附能力，结果如图 １所示。
由图 １可知，随着葡聚糖浓度的增加，进入大孔树脂
的糖量也随之上升，当糖质量浓度达 ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ
时，载体内的糖装载量已接近饱和。 大孔树脂 ＮＫＡ
对 Ｔ ２０及 Ｔ ４０ 的装载量高于对 Ｔ ６ 及 Ｔ ７０
的装载量，这可能是由于疏水性大孔树脂 ＮＫＡ对分
子量较小、亲水性相对较强的 Ｔ ６ 吸附能力较弱，
而 Ｔ ７０则因其分子体积较大，进入 ＮＫＡ孔道相对
困难所致。
图 １　 大孔树脂对葡聚糖的吸附效果
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ＮＫＡ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｘｔｒａｎｓ
２􀆰 ２　 葡聚糖浓度对蛋白吸附量的影响
在制备固定化酶的过程中，分别添加不同浓度
的葡聚糖 Ｔ ２０，考察共吸附固定过程中葡聚糖的
装载量及其对蛋白装载量的影响，结果如图 ２所示。
图 ２　 共固定对葡聚糖及蛋白装载量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｌｏａｄｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ
ｏｆ ｂｏｔｈ ｌｉｐａｓｅ ａｎｄ ｄｅｘｔｒａｎ
由图 ２可知，蛋白装载量未受到明显影响，但是
糖的装载量与 ＮＫＡ仅吸附葡聚糖时相比，几乎削减
一半。 这可能是由于被吸附的葡聚糖填充于酶与
大孔树脂的空隙内，或者葡聚糖通过氢键等非共价
作用力均匀结合于游离脂肪酶分子的外表面后，随
脂肪酶一同被大孔树脂吸附。 在共吸附过程中，葡
聚糖质量浓度从 ０􀆰 １ 增至 ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ 时，大孔树
脂对糖的吸附量呈明显增加趋势，糖质量浓度大于
０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ时，共吸附的糖量仅有略微上升，这与
ＮＫＡ仅吸附葡聚糖趋势相同，结合经济角度考虑，
０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ 的葡聚糖浓度是与酶共吸附的最适
浓度。
２􀆰 ３　 葡聚糖对固定化酶酶活的影响
　 　 考察葡聚糖对固定化酶酶活回收率的影响，结
果如表 １所示。 由表 １ 可知，当糖质量浓度为 ０􀆰 ３
ｍｇ ／ ｍＬ时，Ｔ ６、Ｔ ２０、Ｔ ４０和 Ｔ ７０的装载量分
别为（５􀆰 １２±０􀆰 ３４）、（７􀆰 ５５±０􀆰 ４８）、（６􀆰 ０５±０􀆰 ３６）和
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
（４􀆰 ８５±０􀆰 ５４） ｍｇ ／ ｇ，仅有 Ｔ ２０ 和 Ｔ ４０ 的酶活回
收率高于未与葡聚糖共吸附的固定化酶酶活回收
率（３０􀆰 ０１±１􀆰 １４）％。 当糖质量浓度为 ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ
时，Ｔ ６、Ｔ ２０、Ｔ ４０ 和 Ｔ ７０ 的装载量分别为
（１０􀆰 ４９ ± ０􀆰 ２３）、 （ １５􀆰 １１ ± ０􀆰 ４３）、 （ １５􀆰 ２５ ± ０􀆰 ７６）、
（１０􀆰 ２３±０􀆰 ３５） ｍｇ ／ ｇ，固定化酶酶活回收率均明显
提高。 由此可见，葡聚糖的装载量是影响酶活回收
率的重要因素，在一定范围内随着葡聚糖装载量的
增加，固定化酶酶活回收率也相应提高。
表 １　 不同葡聚糖对酶吸附量和酶活回收率的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｅｆｅｒｅｎｔ ｄｅｘｔｒａｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ
ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
葡聚糖
葡聚糖吸附量 ／ （ｍｇ·ｇ－１） 酶活回收率 ／ ％
０􀆰 ３ ｍｇ ／ ｍＬ ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ ０􀆰 ３ ｍｇ ／ ｍＬ ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ
对照 ３０􀆰 ０１±１􀆰 １４
Ｔ ６ ５􀆰 １２±０􀆰 ３４ １０􀆰 ４９±０􀆰 ２３ ３０􀆰 ３２±１􀆰 １１ ３６􀆰 ９１±０􀆰 ８５
Ｔ ２０ ７􀆰 ５５±０􀆰 ４８ １５􀆰 １１±０􀆰 ４３ ３５􀆰 １２±１􀆰 ０２ ３８􀆰 ４１±１􀆰 ５９
Ｔ ４０ ６􀆰 ０５±０􀆰 ３６ １５􀆰 ２５±０􀆰 ７６ ３５􀆰 ７１±０􀆰 ９９ ４２􀆰 ０１±１􀆰 ６７
Ｔ ７０ ４􀆰 ８５±０􀆰 ５４ １０􀆰 ２３±０􀆰 ３５ ３１􀆰 ５３±０􀆰 ３９ ３３􀆰 ３１±０􀆰 ９３
２􀆰 ４　 葡聚糖共吸附对脂肪酶热稳定的影响
热稳定性是固定化酶应用的重要条件，选取与
０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ葡聚糖 Ｔ ２０ 共吸附固定的脂肪酶进
行热稳定性测定，５０ ℃的热失活曲线如图 ３ 所示。
由图 ３可知，在 １ ｈ内，游离酶活性迅速降低。 对酶
进行固定化后，脂肪酶 ＣＲＬ 的稳定性有所提高，当
将 Ｔ ２０与酶进行共固定后，固定化酶的热稳定性
得到了明显提高，表明葡聚糖的共吸附对脂肪酶
ＣＲＬ产生了良好的保护作用。
图 ３　 脂肪酶热失活曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＬ
２􀆰 ５　 葡聚糖共吸附对脂肪酶 ｐＨ稳定性的影响
考察游离酶和固定化酶的 ｐＨ 稳定性，结果见
图 ４。 由图 ４ 可知，游离酶和固定化酶的最适反应
ｐＨ均为 ７􀆰 ０，当与葡聚糖共吸附固定后，脂肪酶对
环境 ｐＨ的敏感度较游离酶和普通固定化酶而言有
明显降低，说明葡聚糖的引入有利于增强脂肪酶的
ｐＨ耐受性。
图 ４　 固定化酶和游离酶的最适反应 ｐＨ
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ
２􀆰 ６　 葡聚糖共吸附固定化脂肪酶催化合成月桂酸
香茅酯
　 　 以香茅醇和月桂酸为模式底物，以大孔树脂共吸
附固定的葡聚糖 脂肪酶为催化剂合成月桂酸香茅
酯，并分别考察葡聚糖的相对分子质量（２􀆰 ０×１０４、
４􀆰 ０×１０４）及葡聚糖质量浓度（０􀆰 ３、０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ）对固
定化酶催化性能的影响。
２􀆰 ６􀆰 １　 葡聚糖共固定化对催化速率的影响
分别选择葡聚糖质量浓度为 ０􀆰 ３ ｍｇ ／ ｍＬ 和
０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ制备的固定化酶，考察共固定于载体的
不同相对分子质量的葡聚糖对固定化酶无溶剂体
系催化合成月桂酸香茅酯的影响，结果如图 ５所示。
由图 ５ 可知，葡聚糖共吸附固定化的脂肪酶几
乎均可提高反应速率。 主要原因可能是葡聚糖表
面的非共价作用力促进了脂肪酶催化活性中心周
围底物浓度增加［１９］，并且葡聚糖与脂肪酶共存于大
孔树脂孔道内后，可帮助维持酶活性构象所需的
“必需水”，且能够使脂肪酶非水相催化所处的微环
境更接近生物体内亲水性、较为拥挤的自然状
态［２０］。 因此，葡聚糖的共固定可提高该体系中脂肪
酶的催化效率。 与质量浓度为 ０􀆰 ３ ｍｇ ／ ｍＬ的 Ｔ ２０
及 Ｔ ４０共吸附制备的固定化酶催化到达反应平衡
的时间为 ８ ｈ，当固定化过程中葡聚糖质量浓度增加
到 ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ时，反应 ６ ｈ 即可到达反应平衡，说
明影响催化效率的主要因素是葡聚糖的装载量，在
一定范围内，葡聚糖装载量越大，对脂肪酶催化活
性的提高也越显著，但前文研究结果已证明添质量
浓度为 ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ的葡聚糖几乎已达到大孔树脂
１２　 第 ６期 于　 敏等：大孔树脂共吸附固定葡聚糖 脂肪酶催化合成香茅酯
图 ５　 葡聚糖与脂肪酶共吸附固定对催化香
茅醇酯化反应影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ
ｃｏ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗｉｔｈ ０􀆰 ３ ｍｇ ／ ｍＬ
ａｎｄ ０􀆰 ７５ ｍｇ ／ ｍＬ ｄｅｘｔｒａｎ
对其的吸附饱和状态，所以无法通过进一步提高葡
聚糖装载量来获得更高的催化活性。
２􀆰 ６􀆰 ２　 葡聚糖共吸附固定化脂肪酶操作稳定性
在底物物质的量比为 １ ∶ １、温度为 ５０ ℃，转速为
２００ ｒ ／ ｍｉｎ、加入酶活为 １ Ｕ的条件下，使用不含葡聚
糖及共吸附有葡聚糖的脂肪酶重复催化无溶剂体系
月桂酸香茅酯合成反应，考察操作稳定性，结果如图
６所示。
图 ６　 固定化酶的重复利用能力
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ
由图 ６ 可知，固定化脂肪酶连续 １０ 批次催化
后，酶活已降至 ４０％左右。 而共固定有葡聚糖 Ｔ
２０和 Ｔ ４０的固定化脂肪酶酶活分别维持在 ７０％
和 ７５％以上，证明葡聚糖与酶共固定不仅可以提高
脂肪酶的催化活性，还可以增加固定化酶的操作稳
定性。 ＮＫＡ具有较大的孔径，催化过程中难免有部
分脂肪酶从孔道中泄漏至反应液，而葡聚糖的引入
使载体孔道内变得更为拥挤，在一定程度上可防止
酶分子的流失。 此外，葡聚糖共固定化脂肪酶单批
次催化反应所需时间的缩短，可减少多次重复利用
过程中酶热失活因素的累积。 因此，葡聚糖共固定
化脂肪酶能够在无溶剂体系催化合成香茅酯的过
程中展现出更高的稳定性。
２􀆰 ７　 红外图谱表征结果
脂肪酶 ＣＲＬ、葡萄糖 Ｔ ２０ 及其混合物的红外
图谱表征结果如图 ７ 所示。 由图 ７ 可知：脂肪酶
ＣＲＬ的红外吸收峰在３ ３５９ ｃｍ－１处是束缚的 Ｎ—Ｈ
单峰伸展振动，２ ９３４ ｃｍ－１处为 Ｃ—Ｈ 伸缩振动峰，
ａｍｉｄｅ Ｉ（１ ７００～１ ６００ ｃｍ－１） 由肽键的Ｃ 􀪅Ｏ基团伸
缩振动产生，而 ａｍｉｄｅ ＩＩ（１ ５８０ ～ １ ５１０ ｃｍ－１） 由肽
键的 Ｎ—Ｈ 和 Ｃ—Ｎ 基团弯曲及伸缩振动产生，
ａｍｉｄｅ ＩＩＩ（１ ４５０ ～ １ ２５０ ｃｍ－１）由 Ｃ—Ｎ 伸展振动和
Ｎ—Ｈ弯曲振动的混合峰，１ １００ ｃｍ－１处为 Ｃ—Ｏ 伸
缩峰。
图 ７　 脂肪酶 ＣＲＬ、葡聚糖 Ｔ ２０及其混合物的红外图谱
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＣＲＬ，ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ⁃２０
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ
葡聚糖的红外吸收峰在３ ３９０ ｃｍ－１处为 Ｏ—Ｈ
的伸缩峰，因易缔合产生氢键而峰强度大且宽；
２ ９３０ ｃｍ－１波数左右为 Ｃ—Ｈ 伸缩峰； １ ４８０ ～ １ ３００
ｃｍ－１处为 Ｏ—Ｈ 弯曲峰，振动偶合产生多重分裂峰；
１ ３００～１ ０００ ｃｍ－１处为 Ｃ—Ｏ伸缩峰，不对称结构振
动产生了多重分裂峰，１ １６０ ｃｍ－１处为 Ｃ—Ｏ—Ｃ 对
称伸缩振动，９００ ｃｍ－１波数左右为—ＯＨ 的变形振
动峰。
葡聚糖酶混合物的红外吸收峰在３ ３５９ ｃｍ－１处
的 Ｎ—Ｈ 因氢键形成发生红移，波数降低至３ ３３７、
２ ９３４ ｃｍ－１处的 Ｃ—Ｈ 伸缩振动向低波数移动 ２０
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ｃｍ－１左右，峰带变宽，葡聚糖保护后酶的红外吸收峰
与未保护的明显不同，也与葡聚糖的明显不同。 葡
聚糖 ２ ９３０ ｃｍ－１的 Ｃ—Ｈ 伸缩峰向低波数移动，
１ ３６０ ｃｍ－１的—ＣＨ２剪式振动向低波数移动 ２０ ｃｍ
－１
左右，９００ ｃｍ－１左右的—ＯＨ变形振动峰波形也发生
了较大改变。 说明酶和葡聚糖之间有键合作用或
相互作用。
３　 结论
笔者将酶与大分子多糖共同固定于大孔树脂
ＮＫＡ，讨论了不同相对分子质量葡聚糖对酶固定化
过程及催化性能的影响。 结果表明：在固定化过程
中，大孔树脂对中等相对分子质量的葡聚糖 Ｔ ２０
及 Ｔ ４０ 吸附效果较好，加入终质量浓度为 ０􀆰 １ ～
１􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ的葡聚糖并不会明显影响蛋白装载量，
且随着糖装载量的增大，所制备的固定化酶酶活回
收率也相应提高。 利用该固定化酶在 ５０ ℃的温度
下催化合成月桂酸香茅酯可获得 ９５％以上的酯化
率，与未添加葡聚糖的固定化酶相比，到达反应平
衡的时间最多可缩短 ４ ｈ，连续 １０ 批次催化后仍可
保持 ７０％以上的催化活性，表明葡聚糖的共吸附固
定对酶的活性起到了良好的保护作用，为开发简
单、高效的酶固定化方法提供了实验支撑。
参考文献：
［ １ ］　 Ｋａｎｇ Ｍ Ｓ，Ｊａｎｇ Ｈ，Ｋｉｍ Ｍ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ ｆｏｒ
ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｄｕｃｋ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ ［ Ｊ］ ．
Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ，２０１０，８９（６）：１１６７⁃１１７０．
［ ２ ］ 　 Ｌｏｐｅｚ⁃Ｄｉｅｚ Ｅ Ｃ，Ｂｏｎｅ Ｓ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ｗｉｔｈ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ：
ａｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２００４，１６７３（３）：１３９⁃１４８．
［ ３ ］ 　 Ａｌｐｔｅｋｉｎ Ａ， Ｍｅｈｍｅｔ Ｔ． Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ⁃ｄｅｘｔｒａｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ［ Ｊ］ ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ， ２００４， ２０
（１３）：５５２１⁃５５２９．
［ ４ ］ 　 Ｌｕｉｓ Ｅ，Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓ，Ｎｏｒｍａ Ｓ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ
ｄｒｉｅｄ ｇｌａｓｓｙ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｓｕｎｌｉｇｈｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｐｒｏｇ，２００４，２０（４）：１２２０⁃１２２４．
［ ５ ］ 　 杨基础，董燊，杨小民．海藻糖对固定化酶的保护作用［ Ｊ］ ．化
工学报，２０００，５１（２）：１９３⁃１９７．
［ ６ ］ 　 杨小民，杨基础．不同糖对纤维素酶保护的机理研究［ Ｊ］ ．清华
大学学报：自然科学版，２０００，４０（２）：５５⁃５８．
［ ７ ］ 　 柴丽红，李忻怡，王宏元．海藻糖和葡聚糖对 Ｎｉｓｉｎ 热稳定性
的保护效应［Ｊ］ ．食品研究与开发，２０１１，３２（１）：３８⁃４１．
［ ８ ］ 　 Ｌａｕｒｅｎｔ Ｎ，Ｈａｄｄｏｕｂ Ｒ， Ｆｌｉｔｓｃｈ Ｓ Ｌ． Ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｓｏｌｉｄ
ｓｕｒｆａｃｅｓ［Ｊ］ ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６（６）：３２８⁃３３７．
［ ９ ］ 　 汪海萍，魏荣卿，沈斌，等．双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶研
究［Ｊ］ ．生物加工过程，２００４，２（１）：２５⁃２９．
［１０］ 　 王伟，朱凯，杨波，等．表面改性 ＳＢＡ １５ 材料固载猪胰脂肪
酶［Ｊ］ ．生物加工过程，２０１２，１０（２）：４０⁃４４．
［１１］ 　 Ｎｏｅｌ Ｍ，Ｃｏｍｂｅｓ Ｄ．Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｌｉｐａｓｅ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ／ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｃｅ
ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈ， ２００３， ３３ （ ２）：
２９９⁃３０８．
［１２］ 　 Ｎｏｕｒｅｄｄｉｎｉ Ｈ，Ｇａｏ Ｘ，Ｊｏｓｈｉ Ｓ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ
ｌｉｐａｓｅ ｂｙ ｓｏｌ⁃ｇｅｌ ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ ［ Ｊ ］ ． Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ２００３， ８０ （ １１ ）：
１０７７⁃１０８３．
［１３］ 　 Ｊｉａｎｇ Ｚ Ｈ，Ｙｕ Ｍｉｎ，Ｒｅｎ Ｌ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒｓ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｅｄｉａ ［ Ｊ］ ． Ｃｈｉｎ Ｊ
Ｃａｔａｌ，２０１３，３４（１２）：２２５５⁃２２６２．
［１４］ 　 Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ Ｍ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ⁃
ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］ ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７６，７２：２４８⁃２５４．
［１５］ 　 匡扶，朱照静，马俐安，等．葡聚糖 Ｔ２０作为白芨多糖含量测定
标准品可行性研究［ Ｊ］ ．重庆医科大学学报，２００８，３３（ ５）：
５７０⁃５７４．
［１６］ 　 Ｏｚｙｉｌｍａｚ Ｇ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ ｏｎ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２００９，５６（４）：２３１⁃２３６．
［１７］ 　 喻本青，闫云君，刘涛，等．海藻酸 ＳｉＯ２杂化凝胶固定化洋葱
伯克霍尔德菌脂肪酶的研究［Ｊ］ ．生物加工过程，２０１０，８（１）：
１６⁃２２．
［１８］ 　 任立伟，徐田，蒋振华，等．无溶剂体系脂肪酶动力学拆分 ２
辛醇及产物的非均相共沸蒸馏提取 ［ Ｊ］ ．生物加工过程，
２０１４，１２（４）：５５⁃５９．
［１９］ 　 Ｍｉｎｔｏｎ Ａ Ｐ． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｏｗｄｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］ ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ，２０００，１０（１）：３４⁃３９．
［２０］ 　 Ｗａｎｇ Ａ Ｍ， Ｚｈｏｕ Ｃ， Ｗａｎｇ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ
ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ ｉｎ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｒｏｗｄｉｎｇ ｔｈｅｏｒｙ［Ｊ］ ．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ，２００７，１５（６）：７８８⁃７９０．
（责任编辑　 荀志金）
３２　 第 ６期 于　 敏等：大孔树脂共吸附固定葡聚糖 脂肪酶催化合成香茅酯