全 文 ：第７卷第３期
２００９年５月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．３
Ｍａｙ２００９
收稿日期：２００８－１０－１２
作者简介：张 超（１９７８—），男，山东济南人，硕士，助教，研究方向：发酵工学，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｍｅｉｌｉ８２９２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
甲基营养型 Ｌ 丝氨酸产生菌的选育
张 超，栾兴社，张维建，侯书国
（山东建筑大学 市政与环境工程学院，济南 ２５０１０１）
摘 要：以甲基营养型假单胞菌Ｊ １２为出发菌株，经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）诱变处理，Ｄ 丝氨酸
结构类似物平板和高浓度甘氨酸平板定向筛选，获得１株Ｌ丝氨酸高产菌Ｎ １３，其发酵液中Ｌ丝氨酸产量较出
发菌株提高９７９％。在含有２０ｇ／Ｌ甘氨酸和７ｍＬ／Ｌ甲醇的培养基中，Ｌ丝氨酸积累可达４８１ｇ／Ｌ。
关键词：假单胞菌；化学诱变；育种；发酵；Ｌ丝氨酸
中图分类号：Ｑ９３３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０３－００４７－０４
ＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＬｓｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｍｕｔａｎｔ
ＺＨＡＮＧＣｈａｏ，ＬＵＡＮＸｉｎｇｓｈｅ，ＺＨＡＮＧＷｅｉｊｉａｎ，ＨＯＵＳｈｕｇｕｏ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｕｎｉｃｉｐａｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａｎｄｏｎｇＪｉａｎｚｈｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ２５０１０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＬｓｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｍｕｔａｎｔｓｗｅｒｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＪ１２，ｂｙｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｗｉｔｈＮｍｅｔｈｙｌＮｎｉｔｒｏＮｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ）ａｎｄｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＤＥＳ）．Ｔｈｅｍｕｔａｎｔｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ
ｏｎｔｈｅａｇａｒｐｌａｔｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＤｓｅｒｉｎｅａｎｄｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｌｙｃｉｎｅ．ＡｎＬｓｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｕｔａｎｔ
Ｎ１３ｃａｎａｃｃｕｍｕｌａｔｅａｂｏｕｔ４８１ｇ／ＬＬｓｅｒｉｎｅｉｎａｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ２０ｇ／Ｌｇｌｙｃｉｎｅａｎｄ７ｍＬ／Ｌｏｆ
ｍｅｔｈａｎｏｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；ｃｈｅｍｉｃａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｂｒｅｅｄｉｎｇ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｌｓｅｒｉｎｅ
Ｌ丝氨酸作为一种生化试剂，在食品、饲料、医
药、农业中广泛应用，特别是应用于配制第三代复
方氨基酸输液及营养增补剂。利用它合成多种丝
氨酸衍生物，在抗癌、抗艾滋病新药及基因工程用
保护氨基酸等方面意义重大。此外，因Ｌ丝氨酸具
有特殊的保湿性，被大量用于高级化妆品［１］。
Ｌ丝氨酸的生产方法主要有：蛋白质水解法、
化学合成法、微生物发酵法和酶法。蛋白质水解法
和化学合成法都存在损失率大、综合利用率差、成
本高等缺陷。目前主要应用微生物发酵法来生产
Ｌ丝氨酸［２］。
国内利用微生物发酵法生产Ｌ丝氨酸的研究，
大多集中在基因工程菌或以甘氨酸为前体进行发
酵生产［３］等方面。笔者从土壤中筛选到一株甲基
营养型Ｌ丝氨酸生产菌 Ｊ １２，以 Ｊ １２为出发菌
株，通过硫酸二乙酯（ＤＥＳ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）逐级
诱变处理和选育，赋予其特定遗传标记，进一步提
高其产酸水平。
１ 材料与方法
１１ 材料
１１１ 出发菌株
假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｊ １２，由本实验室分
离得到。
１１２ 主要试剂
Ｄ 丝氨酸为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；甘氨酸为上
海生化技术公司产品；（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４和
Ｋ２ＨＰＯ４为中国医药（集团）上海试剂公司产品；乙
醇和丙酮为中国金山化工厂（上海）产品。
１１３ 培养基
１）基本培养基 （ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４
２ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ８ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ０００２ｇ／Ｌ，
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０００２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０６ｇ／Ｌ，生物
素５０μｇ／Ｌ，硫胺素 １００μｇ／Ｌ，制霉菌素００５μｇ／Ｌ，
琼脂条１５ｇ／Ｌ。
２）筛选培养基 基本培养基中添加３０ｇ／Ｌ甘
氨酸或７ｍＬ／Ｌ甲醇或１５ｇ／ＬＤ 丝氨酸。
３）发酵培养基 甘氨酸２５ｇ／Ｌ，甲醇７ｍＬ／Ｌ，
（ＮＨ４）２ＳＯ４１５ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０３
ｇ／Ｌ，玉米浆１５ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ３２０ｇ／Ｌ。
１２ 方法
１２１ 诱变方法
常规化学诱变法［４］。
１２２ 平板筛选
１）结构类似物抗性突变株的获得 把结构类似
物按质量浓度梯度制备一系列的抗性平板，将待诱变
菌株的菌悬液均匀涂布于抗性平板表面，３０℃恒温
培养３～６ｄ以确定药物抑制菌体生长的临界质量浓
度。在基本培养基中加入适当质量浓度的结构类似
物制作成抗性平板，将诱变处理过的一定质量浓度的
菌液涂布于抗性平板上。３０℃恒温培养３～６ｄ，挑
取长出的单菌落，即为结构类似物抗性突变株。
２）高浓度底物耐受性变异株的获得 配制基
本培养基，灭菌后加入一定量的甘氨酸或者甲醇，
制成各种高质量浓度梯度的筛选平板。涂布经诱
变处理过的菌液，置３０℃恒温箱中培养３～７ｄ，挑
取长出的菌落，即为高浓度底物耐受性变异株。
１２３ 发酵方法
１）初筛 从斜面培养基上取一环菌体接入到
３０ｍＬ的发酵培养基中（２５０ｍＬ三角瓶），３０℃摇床
培养７２ｈ，测定发酵液中Ｌ丝氨酸产量。
２）复筛 初筛得到的高产菌株经斜面活化，每
株菌取一满环接入到１５ｍＬ发酵培养液中（２５０ｍＬ
三角瓶），摇床培养１２ｈ，然后各取２ｍＬ种子液加
入３个发酵瓶中，３０℃摇床培养７２ｈ。测定三角瓶
中Ｌ 丝氨酸产量，取其平均值，确定不同菌株的产
量稳定性，从中选出高产稳产的优良菌株。
１２４ 分析方法
１）生物量测定 干质量法。
２）ｐＨ测定 ＰＨＳＪ ４Ａ型数字ｐＨ计测定。
３）发酵液中 Ｌ 丝氨酸含量的测定 纸层析
分光光度法。显色液为０５ｇ茚三酮溶于１００ｍＬ
丙酮中，洗脱液为体积比 ２∶３８的 ０１％ＣｕＳＯ４和
７５％乙醇，在波长５０６ｎｍ下测定其吸光值［５］。
１２５ 遗传稳定性研究
将筛选得到的菌株转接保藏斜面，３０℃培养
２ｄ后作为Ｆ１代，从Ｆ１代斜面转接至保藏斜面，３０℃
培养２ｄ后为 Ｆ２代，同样方式接连传代到 Ｆ５，即为
Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５代。取上述 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５代斜
面，接种到发酵培养基中培养７２ｈ后测发酵液中Ｌ
丝氨酸含量，考察其传代稳定性。
２ 结果与讨论
２１ 出发菌株的筛选
由于使用的原始菌株经多次传代后可能退化，
需在诱变育种前进行分离纯化。由表１可知，经过
单菌落分离，得到一株产量为２４３ｇ／Ｌ的菌，编号
为Ｊ １２，作为出发菌株。
表１ 保存菌种产Ｌ 丝氨酸情况
Ｔａｂｌｅ１ Ｌｓｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓ
菌号 Ｊ ２ Ｊ ５ Ｊ ７Ｊ １０Ｊ １２Ｊ １７Ｊ １８
ρ（Ｌ丝氨酸）／
（ｇ·Ｌ－１）
１８９ １２５ １２６ １５３ ２４３ ２２４ ２２８
２２ Ｌ 丝氨酸产生菌的选育方案与谱系
２２１ Ｌ丝氨酸选育方案的确定
从甘氨酸出发的丝氨酸合成所需的 Ｃ１供体
（Ｎ５，Ｎ１０ 亚甲基四氢叶酸）来自甘氨酸的甲基碳，
通过甘氨酸的裂解反应供给，理论上２ｍｏｌ甘氨酸
可生成１ｍｏｌ丝氨酸。甲基营养型菌株，其甘氨酸
生产丝氨酸所需的 Ｃ１供体来自甲醛同四氢叶酸反
应，而不是来自甘氨酸的裂解，与异养型菌株相比，
大大提高了甘氨酸对丝氨酸的转化率，理论上，２
ｍｏｌ的甘氨酸转化为２ｍｏｌ的 Ｌ 丝氨酸［６］；而且甲
醇比甘氨酸便宜，所以甲基营养型的丝氨酸产生菌
可以创造更高经济价值。
８４ 生 物 加 工 过 程 第７卷
由于Ｌ丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，代
谢运转速度极快［７］。因此，直接发酵法生产Ｌ 丝氨
酸十分困难。从图１的 Ｌ 丝氨酸合成途径可以看
出，甘油酸、甘氨酸均可作为发酵法生产Ｌ 丝氨酸时
添加的前体物［８］。以甘氨酸为前体物发酵生产Ｌ丝
氨酸时，菌体积累Ｌ 丝氨酸的含量将与菌体含有的
丝氨酸羟甲基转移酶（ＳＨＭＴ）活性高低直接相关。
研究表明，ＳＨＭＴ受丝氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、叶酸、嘌
呤、胸腺嘧啶等物质的反馈调节［９］。为解除这些物质
对ＳＨＭＴ活性的反馈抑制作用，可以筛选出这些物质
的结构类似物抗性突变株以及这些物质的营养缺陷
型，以达到过量积累Ｌ丝氨酸的目的。
图１ 细菌细胞内Ｌ 丝氨酸代谢途径
Ｆｉｇ．１ ＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｐａｔｈｗａｙｏｆＬｓｅｒｉｎｅｉｎｂａｃｔｅｒｉａ
２２２ Ｌ丝氨酸产生菌的选育谱系
Ｌ丝氨酸产生菌的选育谱系如图２所示。
图２ Ｊ １２的选育谱系图
Ｆｉｇ．２ ＧｅｎｅａｌｏｇｙｏｆＬｓｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｕｔａｎｔｓＪ１２
２３ 诱变剂量和时间的确定
２３１ ＤＥＳ诱变致死率曲线
ＤＥＳ是诱变中常用的一种烷化剂，可引起ＧＣ和
ＡＴ的互换，从而引起 ＤＮＡ复制时碱基配对错误。一
般选择致死率７０％ ～８０％为佳。采用质量分数为
２％的ＤＥＳ，对菌体分别处理不同时间，结果如图３所
示。根据经验，选择ＤＥＳ处理时间为２０ｍｉｎ。
２３２ ＮＴＧ诱变剂量的选择
用质量浓度为２５０μｇ／ｍＬ的 ＮＴＧ溶液对菌体
处理不同时间，测定致死率，结果见图４，选择处理
时间为 ３０ｍｉｎ。
图３ ＤＥＳ诱变致死率曲线
Ｆｉｇ．３ ＴｅｒｍｉｎａｌｒａｔｅｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＤＥＳｍｕｔａｔｉｏｎ
图４ ＮＴＧ处理Ｌ １６７致死率结果
Ｆｉｇ．４ ＬｅｔｈａｌｉｔｙｏｆＬ１６７ｂｙＮＴＧ
２４ 遗传稳定性研究
由图２可知，菌株Ｋ １６和Ｌ １６７的变异性可
遗传，产Ｌ丝氨酸稳定。
将突变株Ｎ １３在斜面培养基上连续进行０～
４℃保存、传代，再测定其产Ｌ 丝氨酸能力，结果见
表２。由表２可知，Ｎ １３传代５次，其产Ｌ丝氨酸
能力并没有下降，保持稳定，说明 Ｎ １３其变异性
可遗传，产Ｌ丝氨酸稳定。
表２ 突变株Ｎ １３的稳定性考察
Ｔａｂｌｅ２ ＴｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＬｓｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＮ１３
测定项目
传代次数
１ ２ ３ ４ ５
ρ（Ｌ丝氨酸）／
（ｇ·Ｌ－１）
４３１ ４２９ ４３１ ４２７ ４３０
ρ（干菌体）／
（ｇ·Ｌ－１）
２２４３ ２２５６ ２２６８ ２２８２ ２２５４
９４ 第３期 张 超等：甲基营养型Ｌ丝氨酸产生菌的选育
２５ 营养因素对发酵的影响
由表３～５可知，营养因子对 Ｌ 丝氨酸产量影
响程度从高到低依次为甘氨酸、（ＮＨ４）２ＳＯ４、玉米
浆。最适产Ｌ丝氨酸条件为Ａ３ＢｌＣ３，即２０ｇ／Ｌ甘
表３ 正交试验因素水平
Ｔａｂｌｅ３ Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｇ·Ｌ－１
水平
因素
Ａ
ρ（甘氨酸）
Ｂ
ρ（硫酸铵）
Ｃ
ρ（玉米浆）
１ １０ １５ ２０
２ １５ ２０ ５
３ ２０ ５ １５
４ ２５ １０ １０
表４ 三因素四水平正交实验
Ｔａｂｌｅ４ Ｌ１６（４）
３Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
试验号 Ａ Ｂ Ｃ ρ（Ｌ 丝氨酸）／（ｇ·Ｌ－１）
１ １ １ １ ０９８
２ １ ２ ２ １０６
３ １ ３ ３ ０８２
４ １ ４ ４ １６４
５ ２ １ ２ ２６２
６ ２ ２ １ ０８６
７ ２ ３ ３ １２９
８ ２ ４ ４ ０９４
９ ３ １ ４ ３９５
１０ ３ ２ ３ ３２５
１１ ３ ３ ２ ２７０
１２ ３ ４ １ １４５
１３ ４ １ ３ ４３０
１４ ４ ２ ４ ２３９
１５ ４ ３ ２ １２５
１６ ４ ４ １ ２６２
表５ 正交试验结果分析
Ｔａｂｌｅ５ Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
方差源 Ａ Ｂ Ｃ
Ｋ１ １１２５ ２９６３ １４７８
Ｋ２ １４２８ １８９０ １９０８
Ｋ３ ２８３８ １５１５ ２４１５
Ｋ４ ２６４０ １６６３ ２２３０
Ｒ １７１３ １４４８ ０９３７
氨酸，１５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１５ｇ／Ｌ玉米浆，在该条件
下菌株Ｎ １３产Ｌ丝氨酸可达４８１ｇ／Ｌ，Ｌ丝氨酸
产量较出发菌株Ｊ １２提高９７９％。
３ 结 论
以假单胞菌Ｊ １２为出发菌株，经 ＤＥＳ和 ＮＴＧ
诱变处理，获得１株 Ｌ 丝氨酸高产菌 Ｎ １３，其发
酵液中Ｌ丝氨酸产量较出发菌株提高９７９％。在
含有２０ｇ／Ｌ甘氨酸和７ｍＬ／Ｌ甲醇的培养基中，Ｌ
丝氨酸积累可达４８１ｇ／Ｌ。
参考文献：
［１］ 克立凤，张伟国，钱和．Ｌ丝氨酸的生产及应用［Ｊ］．江苏食
品与发酵，２００１，３１（２）：９１２．
ＫｅＬｉｆｅｎｇ，ＺｈａｎｇＷｅｉｇｕｏ，ＱｉａｎＨｅ．Ｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｏｆＬｓｅｒｉｎｅ［Ｊ］．ＪｉａｎｇｓｕＦｏｏｄａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，２００１，３１
（２）：９１２．
［２］ 冯美卿，曹秀格，卢水辉．Ｌ丝氨制备方法评述［Ｊ］．氨基酸
和生物资源，２０００，２２（３）：４２４４．
ＦｅｎｇＭｅｉｑｉｎｇ，ＣａｏＸｉｕｇｅ，ＬｕＳｈｕｉｈｕｉ．Ａｂｒｉｅｆｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＬｓｅｒｉｎｅ［Ｊ］．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄａｎｄＢｉｏｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅ，
２０００，２２（３）：４２４４．
［３］ 魏东，谭慧林．Ｌ丝氨酸高产菌株的选育和摇瓶发酵条件优
化［Ｊ］．氨基酸和生物资源，２００６，２８（１）：４６４８．
ＷｅｉＤｏｎｇ，ＴａｎＨｕｉｌｉｎ．ＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＬｓｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎａｎｄ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄａｎｄＢｉｏｔｉｃ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，２００６，２８（１）：４６４８．
［４］ 施巧琴，吴松刚．工业微生物育种学［Ｍ］．北京：科学出版
社，２００３．
［５］ 卢发，张伟国．纸层析 分光光度法测定发酵液中 Ｌ 丝氨酸
和甘氨酸的含量［Ｊ］．食品与发酵工业，２００５，３１（３）：
１１９１２１．
ＬｕＦａ，ＺｈａｎｇＷｅｉｇｕｏ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＬｓｅｒｉｎｅａｎｄｇｌｙｃｉｎｅｉｎ
ｂｒｏｔｈｗｉｔｈｐａｐｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ
ａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，２００５，３１（３）：１１９１２１．
［６］ ＭｏｒｉｎａｇａＹ，ＹａｍａｎａｋａＳ，ＴａｋｉｎａｍｉＫ．ＬＳｅｒｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙ
ｍｅｔｈａｎｏｌｕｔｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＭＳ３１［Ｊ］．ＡｇｒｉｃＢｉｏｌ
Ｃｈｅｍ，１９８１，４５（６）：１４１９１４２４．
［７］ 张炳荣．氨基酸生产技术讲座［Ｊ］．中国调味品，１９８６，２２
（１０）：２８－３２．
ＺｈａｎｇＢｉｎｇｒｏｎｇ．Ｔｈｅｌｅｃｔｕｒｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ，１９８６，２２（１０）：２８－３２．
［８］ ＫｕｂｏｔａＫ，ＫａｇｅｙａｍａＫ．ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｏｆＬｓｅｒｉｎｅｆｒｏｍｇｌｙｃｉｎｅｂｙ
ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｙｃｉｎｏｐｈｉｌｕｍ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７２，４２
（１８）：３６５－３７５．
［９］ ＫｕｂｏｔａＫ，ＫａｇｅｙａｍａＫ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＬｓｅｒｉｎｅｆｒｏｍｇｌｙ
ｃｉｎｅ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８５，７６（３１）：２２７３－２２７９．
０５ 生 物 加 工 过 程 第７卷