全 文 ：一株可利用甘蔗渣水解液发酵酒精的菌株筛选
张聚宝，林 影，向柱方，吴晓英!
（华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 !"#$%#） 摘 要：甘蔗渣是一种制糖工业废料，主要含有丰富的纤维素类物质，纤维素类物质由五碳糖和六碳糖组成，通过 粉碎，用 "&’()*碱预处理 +% ,，在 "+" -、.*"/#的条件下水解 " ,，不同的酵母利用水解液发酵生产酒精的研究 结果表明：假丝酵母 "001能高效地利用水解液中的葡萄糖、木糖，转化生产酒精，发酵 %2 ,，测得发酵液中的酒精含 量达 #/102 3 4 "## 56，折合成干物质转化率为 "7/#%&。 关键词：酒精；甘蔗渣；菌株筛选；纤维素；木糖 中图分类号：891+：917 文献标识码：: 文章编号："$0+ ; 7$02（+##%）#7 ; ##$# ; #7
!"# $$%&%’ () * +$*,- ,-#*&% ./&"/ "(012 0-&1&3$ 4*’*,,$ /+2#(1+,*-$, -( )$#5$%- $-/*%(1 <*:’= >?@A(B，6C’ DEF3，GC:’= <,?@H(F3，IJ GE(B@KEF3 （LM.(NO5MFO BH PEBOMQ,FBRB3K，SB?O, T,EF( JFEUMNVEOK BH 8MQ,FBRB3K，=?(F3W,B? !"#$%"，T,EF(） 64,-#*"-：P(3(VVM EV O,M NMVEX?M BH V?3(N EFX?VONK，Y,EQ, EV 5(EFRK QB5.BVMX BH QMRR?RBVM/ :HOMN QB55EF?OMX (FX .NMONM(OMX AK "& ’()* HBN +% ,，A(VV(3M Y(V ,KXNBRKWMX (O "+" - (FX .*"/#/ 8,M HMN5MFO(OEBF OMVOV BH ,KXNBRKV(OMV OB .NBX?QM MO,(FBR YMNM QBFX?QOMX YEO, XEHHMNMFO KM(VO VON(EFV/ 8,M NMV?ROV EFXEQ(OM O,(O !"#$%$" &’ / "001 B?O BH HB?N VON(EFV QB?RX MHHEQEMFORK ?OEREWM 3R?QBVM (FX ZKRBVM BH XMOMN5EFMX (V ,KXNBRKV(OMV OB KEMRX MO,(FBR/ 8,M QBFOMFO BH MO,(FBR EF 5MXE?5 Y(V XMOMN5EFMX (V #/102 3 4 "## 56 (O %2 ,/ CO (5B?FOMX OB O,M QBFUMNVEBF BH XNK V?AVO(FQM (V "7/#%& / 7$+ .(#2,：MO,(FBR；A(3(VVM；VON(EF@VQNMMFEF3；QMRR?RBVM；ZKRBVM 甘蔗渣是一种木质纤维素，主要含纤维素、半纤 维素和木质素。纤维素是!@L葡萄糖基 "，%糖苷键 联结而成的线性高分子化合物；半纤维素的结构单 元中包括戊糖基（木糖基、阿拉伯糖基等）、己糖基 （葡萄糖基、甘露糖基、半乳糖基、鼠李糖基等）、糖酸 基和乙酰基。半纤维素的分子量较低，聚合度小，且 分子中往往含有支链；而木质素是由苯丙基丙烷单 元（即 T7 ; T$ 单元）通过醚链和碳@碳联结而成，具 有三维结构的芳香族高分子化合物。完全水解纤维 素可以得到 1$& [ 12&的 L@葡萄糖，而完全水解半 乳糖可以得到木糖，葡萄糖和木糖的含量占所有的 组分的 0+& [ 1%&［"］，其中葡萄糖和木糖的比例为 +/$ [ %/0 \"［"］。为了转化生物可再生资源为燃料酒 精，其一是充分的将纤维素和半纤维素水解转化为 单糖；其二是有效地将水解糖（主要为葡萄糖和木 糖）转化为酒精。但是普通的酿造酵母，很难将戊糖 进行转化。一些代谢因素在限制戊糖（包括木糖和 阿拉伯糖）的有效利用［+］。所以要对纤维素生产燃 料酒精的研究主要是针对工程菌构造的研究，即通 过基因工程的改造得到一株能良好利用纤维素水解 ! 收稿日期：+##7@""@"# 作者简介：张聚宝（"12#@），男，硕士生，研究方向：酶工程。 :?3] +##% ·$#· 生 物 加 工 过 程 T,EFMVM >B?NF(R BH PEB.NBQMVV ^F3EFMMNEF3 第 +卷第 7期 +##%年 2月 万方数据 糖发酵生产酒精的菌株。国外用纤维素生产燃料酒 精的菌株的研究主要是寻找直接利用纤维素和半纤 维素的菌株，!"#$% &’($% )*+（,---）构建了一株能 够直接利用纤维素的菌［.］，/0$1&0$ 2#3（4554）也构 建了一株能够产生纤维素酶的酵母并通过酵母 &671,表面展示［8］，而国内对天然纤维素类物质生 产燃料酒精的研究比较少，尤其对其中的半纤维素 水解产物戊糖的利用研究还没有见过报导。本文通 过比较四株酵母菌种对提高甘蔗渣水解糖发酵生产 酒精的能力，也进一步为燃料酒精的生产菌种的构 造与选育打下良好的基础。 ! 材料与方法 ,9, 原 料 甘蔗渣 华南理工大学造纸学院提供甘蔗渣 菌种（见表 ,）。 表 , 本实验所用酵母菌种 6#:;< , ’<#=> =>?#0$= 0$ <@A?03<$= 菌名 拉丁菌名 菌种来源 酿造酵母古巴 , !"##$"%&’(#)* #)%)+,*," 本研究室保藏 &671, !"##$"%&’(#)* #)%)+,*," 本研究室保藏 假丝酵母 ,BB- -"./,/" *0 9 购于中国工业 微生物菌种保藏中心 脆壁克鲁斯酵母 1 2 3%"4,5) 本研究室保藏 主要药品试剂 甲醇（色谱纯），乙醇（色谱纯）， 正丁醇（色谱纯），葡萄糖，木糖，麦芽糖，乙腈（分析 纯），均为国产。 培养基 固体斜面培养基：葡萄糖 45 %，蛋白胨 C %，酵母 粉 . %，麦芽汁 . %，琼脂 ,C %，蒸馏水 , 555 3D， AEC9C。 种子活化培养基：葡萄糖 ,5 %，蛋白胨 C %，酵母 粉 . %，麦芽汁 . %，蒸馏水 , 555 3D，AEC9C。 无碳源基础培养基：硫酸铵C %，磷酸二氢钾, %，氯 化钠 59, %，硫酸镁 59C %，氯化钙 59, %，酵母膏 594 %。 发酵培养基：将甘蔗渣研磨约直径 598 F 59- 33，称取 C595 %入 ,G2#HE溶液浸没，预处理 48 *， 调 AEB95，加入硫酸调 AE,95，使固液比大约为 , I ,5，于 ,4, J高温下水解 , *，将水解液用棉花过滤， 调葡萄糖含量约为 4G，调 AEC9C分装。 ,94 菌的生长和发酵条件 所有酵母菌种生长和发酵条件都为 47 F .5 J。 ,9. 分析方法 ,9.9, 葡萄糖，木糖含量的测定 EKD)法 色谱柱为糖柱，流动相为乙腈和水以 8 I,比例混合，流速为 597 3D L 30$，柱温为 .4 J，内 标物为麦芽糖。 ,9.94 酒精含量的测定 毛细管气相色谱法 色谱柱为 EK 0$$ +"#@ .5 3
M 59.4 33 M 59C!3 ，以甲醇为溶剂，正丁醇为内标
物，程序升温如图 ,：
图 , 气相色谱升温程序
N0%9, 6<3A(?< A?+%?#3 0$O) 最终以 % L ,55 3D来表示酒精的含量。 ,9.9. 细胞浓度的测定 比浊法测 67 值（P55$3）。
" 结 果
49, 菌种的活化
将菌种接种于种子活化培养基，在 47 F .5 J，
.P小时长势良好。
494 不同碳源对菌种生长的影响
将活化好的菌种用牙签蘸取少量在“4G不同碳
源 Q无碳源培养基 Q ,G琼脂”培养基作成的平皿上
划线，观察 .天内长势，结果如表 4。
表 4 不同菌种在不同碳源培养基上的生长情况
6#:;< 4 O?+">* +R =>?#0$= #> S0RR 3碳源 木糖 半乳糖 阿拉伯糖纤维二糖
酿造酵母古巴 , Q Q Q T T Q
&671, T T Q T T T T
假丝酵母 ,BB- Q Q Q T T Q Q
脆壁克鲁斯酵母 Q Q T T T T
长势：Q Q为长势一般有少量圆形白色菌落形成；Q为
长有少量，可见划线的地方有白色酵母菌的线形菌落；11为
不生长或观察不到。
菌种 ,BB- 在木糖、半乳糖、纤维二糖中都能生
长，且长势较好，其它菌种长势不佳。
49. 菌种接种时间的确定
将能利用多种糖生长的菌种假丝酵母 ,BB- 作
4558年 7月 张聚宝等：一株可利用甘蔗渣水解液发酵酒精的菌株筛选 ·P,·
万方数据
为选定的菌株，同本研究室保藏的其它酒精发酵能
力较强的另外三株菌种（酿造酵母古巴 ! "，#$%&!， 脆壁克鲁斯酵母）作发酵能力的对比试验。生长曲 线如图 ’所示。 —!—酿造酵母古巴 ! "；—"—#$%&!；
—#—假丝酵母 !(()；—$—脆壁克鲁丝酵母 图 ’ 四种酵母菌的生长曲线 *+,-’$./ ,0123. 4506/7 18 8150 9/:73 730:+;7
由图 ’可以看出，假丝酵母 !(()，酿造酵母古巴
! "和脆壁克鲁斯酵母的对数生长后期为 !< = ’> .，
选 ’> .为接种时间，而 #$%&!的对数生长期后期为 ’% = ?> .，选择 @> .为接种时间。 ’-? 发酵试验 将处于对数生长后期的菌种按 ! A !> 的接种量 接种于配制好的培养基中，利用液相色谱法和气相 色谱法测发酵过程中葡萄糖（图 @）、木糖（图 ?）以及 发酵液中酒精的生产情况（图 <）。 —!—酿造酵母古巴 ! "；—"—#$%&!；
—#—假丝酵母 !(()；—$—脆壁克鲁丝酵母 图 @ 发酵过程中葡萄糖的消耗 *+,B@$./ 41;3/;3 18 ,C5417/ +; 8/0D/;3:3+1;
由图 @可以看出，所有的菌都能利用葡萄糖，且
在 ’> .以后糖的利用很少，说明此时残糖的浓度已
经很低，微生物很难利用。
由图 ?可以看出，除菌假丝酵母 !(() 外，其它
菌种对木糖的利用基本很少。
由图 <可见，各种酵母菌均能利用甘蔗渣的水解
糖生产酒精，其中假丝酵母 !(()在 ?% .时，发酵液中
的酒精含量有一个最大值：>-)(% , E !>> DF。因为先
前是将干物质按 ! A !>进行水解的，在配制培养基的
同时为了使其中的葡萄糖含量为 ’G左右，又将水解
液进行了稀释（水解液同水的比例为 @ A!），所以将这
个最大值转化成干物料的转化率为 !@->?G。
—!—酿造酵母古巴 ! "；—"—#$%&!； —#—假丝酵母 !(()；—$—脆壁克鲁丝酵母
图 ? 发酵过程中木糖的消耗
*+,-? $./ 41;3/;3 18 H9C17/ +; 8/0D/;3:3+1; —!—酿造酵母古巴 ! "；—"—#$%&!；
—#—假丝酵母 !(()；—$—脆壁克鲁丝酵母 图 < 四种酵母菌的产酒精情况 *+,B<$./ /3.:;1C I01J54/J K9 3./ 8150 9/:73 730:+;7
! 讨 论
在发酵酒精生产中，关键是要选育一株发酵能
（下转第 L(页）
·L’· 生物加工过程 第 ’卷第 @期
万方数据
表 ! 物料体积对复水率的影响
"#$%& ! ’#(&)*#% +,%-.& +&)/-/ )&012)#(*,3 )#(& 4,) 2)1*35 6#)),( （788 9 : 0） 物料体积（..;） 复水比 <7= >?=7 7=8 =?=< =88 !?=! 由表 ;和表 !可见，经吸附式低温干燥后胡萝 卜的复水比在 >左右，显著高于热风干燥；干燥气体 的湿度变化对胡萝卜复水比没有明显影响。在干燥 气体温度、湿度和风量都相同时，随着粒度的增大， 复水能力下降，因为在相同的复水时间内，粒度大的 物料有可能没有得到完全恢复，导致复水比随粒度 增加变小。 ! 结论 （<）吸附式低温干燥条件下，胡萝卜的干燥曲线 呈现大致相同的反 @型变化规律，有较明显的调整、 恒速和降速三个干燥阶段。 （7）吸附式低温干燥过程可使被干燥物料达到 超干水平，不受露点限制。 （;）增加干燥气体流量对干燥过程进行有利。 在兼顾能耗的同时，干燥气体的相对湿度越低，风量 越大，越有利于干燥的进行。 （!）被干燥物料颗粒大小和形状对干燥过程有 显著影响。颗粒尺寸越小，比表面积越大，暴露在干 空气中的表面越大，越有利于水分蒸发。 （=）经过吸附式干燥后的胡萝卜色泽仍较鲜艳， 无褐变，外表品质优于热风干燥。 （>）经吸附式低温干燥后胡萝卜的复水比 （>?=7）显著高于热风干燥（?AB）；干燥气体的湿度<br变化对胡萝卜复水比没有明显影响。 参考文献： ［<］ C D#0%#+#3E#2&0，F G#/*)*，’ H#))#$*?"&603*6#% I,(& J&(&).*3#(*,3 ,4
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学报，!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
N（上接第 >7页）
力强的菌株，这样才有可能进行后续的发酵条件优
化的研究。菌种的选择是酒精生产中的第一步，本
研究初步筛选得到一株能利用纤维素水解糖（葡萄
糖和木糖等）发酵生产酒精的菌种。进一步的菌种
选育，是要提高菌种酒精产生能力，优化发酵工艺条
件和后续一步的酒精提纯工作，实现工业化、工厂
化。
参考文献：
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*35 (, 6&%%-%,/&[ M,-)3#% ,4 ’,%&6-%#) Z#(#%1/*/ G：\3E1.#(*6 7887（788!年 B月 孙庆梅等：胡萝卜吸附式低温干燥特性的研究 ·>A·
万方数据