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火棘果酒在酿制过程中化学成分及其抗氧化特性的变化



全 文 :China Brewing
2013 Vol.32 No.8
Serial No.257
收稿日期:2013-06-18
基金项目:湖北省教育厅指导性项目(B20111902);湖北民族学院大学生创新项目(2013Z078)
作者简介:蒋春兰(1990-),女,本科生,主要从事生物工程的研究工作。
*通讯作者:李 伟(1976-),男,讲师,硕士,主要从事生物资源的开发与利用工作。
火棘为蔷薇科苹果亚科火棘属的常绿野生灌木,产区
均有果实代粮的历史,恩施州野生火棘产量不低于10万t。
作为天然的野生果树资源,火棘果是加工果汁、果酒的上
佳原料。丁筑红等[1]尝试利用活性干酵母酿制干型火棘果
酒,取得了满意的效果;李胜敖等[2]将火棘鲜果压榨后,接
种酵母发酵,制得酒精度为12%vol的火棘发酵酒。赵晓明
等[3]将火棘果经全汁低温发酵成火棘果酒,具有饮用滋补
双重作用。王宪伟等[4]利用大曲将火棘果汁和糯米一起发
酵酿造制备火棘黄酒,酒体鲜甜醇厚。李新社等[5]将火棘
果汁利用安琪活性干酵母经过酒精发酵和醋酸发酵生产
醋饮料。周文斌等[6]以火棘果为主要原料,经过酒精发酵、
醋酸发酵等工序得到火棘果醋。虽然已有一些科研工作
者对火棘果酒等发酵工艺进行了优化,但是在这些研究中,
均未涉及发酵过程中参数调节对生物活性成分含量及其
活性的变化的影响。因此本文重点研究发酵条件(如发酵
温度、接种量、糖的添加量等)对生物活性成分及生物活性
的影响,为进一步开发恩施丰富的火棘资源提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 实验材料
火棘果:采自于湖北省恩施市龙洞河颗粒饱满、颜色
鲜红的成熟火棘果实。
1.2 实验试剂
芦丁(≥95%):西安艾沃生物科技有限公司;安琪活
性干酵母:安琪酵母股份有限公司;2,2-联氮-二(3-乙基-
苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthia-
zoline-6-sulphonate,ABTS)、水溶性维生素E(6-Hydroxy-2,
5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid,Trolox)、三吡
啶三吖嗪(ferric-tripyridyl-triazine,TPTZ):日本TCI公司;
OPA、碳酸钠、氢氧化钠(分析纯):国家集团化学试剂有限
公司;硫酸氢钠、苯酚、过硫酸钠、四硼酸钠(分析纯):天津
常福晨试剂有限公司。
1.3 实验仪器
UV765紫外分光光度计、FA1004B型电子天平、PH-
SJ-3F实验室pH计:上海精密仪器有限公司;800型离心机:
火棘果酒在酿制过程中化学成分及其抗氧化特性的变化
蒋春兰,庄 洋,朱定国,程 超,李 伟*
(湖北民族学院 生物科学与技术学院,湖北 恩施 445000)
摘 要:以火棘果为原料,选用安琪酵母进行发酵,监测发酵过程中发酵醪中黄酮、pH值、酒精度、多酚及抗氧化指标的变化,结果发
现:发酵过程中不同化学成分变化趋势不同,多糖含量逐渐下降,酒精体积分数逐渐增加,pH值变化不明显;蛋白质含量随发酵时间
和发酵液pH值变化而变化,游离氨基酸含量逐渐上升,黄酮和多酚含量先上升后下降。此外火棘果酒发酵液对ABTS自由基清除作
用和TEAC值随发酵时间延长逐渐增加。
关 键 词:火棘果;果酒;发酵;化学成分;酒精度;抗氧化
中图分类号:TS261.4 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2013)08-0080-04
Changes of chemical contents and their antioxidant activities during wine processing of
Pyracantha fortuneana (Maxim.) Li
JIANG Chunlan, ZHUANG Yang, ZHU Ding-guo, CHENG Chao, LI Wei*
(Biological Scientific and Technical College, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)
Abstract: Using the fruit of Pyracantha fortuneana (Maxim.) Li as raw material, the wine was fermented with angel yeast, and changes of pH value,
alcohol degrees, flavonoides, polyphenols and antioxidant activities of fermentation mash were focused on during different fermentation process. The
results were as follow, change trend was different for different chemical composition during fermentation, polysaccharide content decreased gradual-
ly, the volume fraction of ethanol gradually increased, and pH value did not change significantly. Protein content changed with fermentation time and
pH value, and free amino acid content increased while contents of flavonoids and polyphenols increased and then decreased. In addition, the elimina-
tion rate on ABTS radical scavenging and TEAC values of fermentation mash increased with prolonged fermentation.
Key words: Pyracantha fortuneana (Maxim.) Li; wine; fermentation; chemical compositions; alcohol content; antioxidant activities
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2013年 第 32卷 第 8期
总第 257期
上海手术器械厂;GZC-9140MBE电热鼓风干燥箱:上海博
讯实业有限公司;DL-5低速大容量离心机:上海安亭科学
仪器厂;FSH-2多功能匀浆机:武汉轻工业公司。
1.4 实验方法
1.4.1 火棘果酒发酵工艺
将采集的新鲜火棘果实称取适量,匀浆,加入20%白
砂糖、1%安琪酵母和162.5mg/L亚硫酸氢钠,混匀后分装发
酵。在测定各成分之前先取发酵液在4000r/min离心15min,
然后再每隔24h进行与之重复的试验。
1.4.2 指标测定
(1)pH值测定:酸度计测定。
(2)酒精体积分数的测定。
按照参考文献[7],酒精计法测定火棘果酒样品的酒
精体积分数。
(3)黄酮含量测定
采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH方法[8],以芦丁标准品为
标样,以其质量(mg)为横坐标,吸光度值A510nm为纵坐标绘
制标准曲线,得回归方程为y=0.3991x-0.0178,R2=0.9922。
发酵液中黄酮含量测定:移取0.5mL发酵上清液,按
标准曲线方法测定A510吸光度值,黄酮含量计算公式:
发酵液中黄酮含量(mg/mL)= A510nm+0.0178
0.3991×V
式中:V为发酵液的测定体积,mL。
(4)多酚含量测定
FC法[9]:以没食子酸为对照品,以其质量(mg)为横坐
标,吸光度值A765nm为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程
为:y=1.2676x+0.0149,相关系数R2=0.9998。
发酵液中多酚含量测定:移取0.25mL发酵上清液,按
标准曲线测定A765nm,多酚含量计算公式:
发酵液中多酚含量(mg/mL)= A765-0.0149
1.2676×V
式中:V为发酵液的测定体积,mL。
(5)总糖含量测定
苯酚-硫酸法[10]测定发酵液中总糖含量,以葡萄糖为标
样,以其质量(mg)为横坐标,吸光度值A485nm为纵坐标绘制标
准曲线,得回归方程为:y=0.0086x-0.0175,相关系数R2=0.9991。
发酵液中总糖含量测定:移取适宜浓度发酵上清液,
加入1mL 9%苯酚,摇匀,加5mL浓硫酸,摇匀,静置30min,
测定A485nm。
发酵液中总糖含量(mg/mL)= A485nm+0.0175
0.0086×V
×n
式中:V为发酵液的测定体积,mL;n为稀释倍数。
(6)蛋白质含量测定
G-250法测定发酵液中蛋白质含量[10],以牛血清白蛋白标
样为对照品,以其质量(μg)为横坐标,吸光度值A595nm为纵坐
标绘制标准曲线,得回归方程为:y=0.0060x-0.0092,R2=0.9927。
发酵液中蛋白质含量测定:移取0.5mL发酵上清液,按
标准曲线测定A595nm。
发酵液中蛋白质含量(mg/mL)= A595nm+0.0092
0.0060×V
式中:V为发酵液的测定体积,mL。
(7)游离氨基酸含量测定
OPA法[11]:精确称取标准品邻苯二甲醛(Ortho-pathalade-
hyde,OPA)40mg溶于1mL甲醇,加入2.5mL 20%的SDS溶
液,再加入0.1mol/L四硼酸钠25mL,β-巯基乙醇100μL,蒸
馏水定容至50mL(现配现用)。分别取0mL、0.04mL、0.08mL、
0.12mL、0.16mL、0.20mL标准氨基酸溶液,再加入0.20mL、
0.16mL、0.12mL、0.08mL、0.04mL、0.00mL蒸馏水,再分别
加入4mL OPA溶液,摇匀。静置3min,在波长340nm处测定
吸光度值,以氨基酸浓度为x轴,吸光度值为y轴绘制曲线,
算得回归方程:y=0.0122x-0.0146,相关系数R2=0.9978。
发酵液中游离氨基酸的测定:移取0.1mL发酵上清液,加
入0.1mL蒸馏水,摇匀,加入4mLOPA试剂,摇匀。静置3min,
测定A340nm。
发酵液中蛋白质含量(μg/mL)= A340nm+0.0146
0.0122×V
式中:V为发酵液的测定体积,mL。
1.4.3 抗氧化指标测定
(1)发酵液对ABTS自由基的清除作用
用2.45mmol/L过硫酸钾配制7mmol/L ABTS储备液,
将此用10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)稀释至波长734nm处
吸光度值为0.7+0.02,取4mL ATBS测试液,加60μL对应的
样品提取液,反应6min后测定A732nm,即为A对照,取4mLATBS
测试液,加60μL样品溶液摇匀后,反应6min后,测定A732nm,
即为A样品[12]。
清除率 =[(A 对照 -A 样品)/A 对照] ×100%
(2)发酵液在FRAP体系中的还原作用
蒸馏水1mL,1.8mL TPTZ溶液,60μL样品溶液混匀,
37℃反应10min,测定A593nm,结果以μmol/L Trolox等量抗氧
化能力(TEAC)表示[12]。
2 结果与分析
2.1 火棘果酒酿制过程中化学成分的变化
2.1.1 pH值和酒精度的变化
在不同发酵阶段分别取发酵液进行酸度和酒精度测
定,pH值和酒精度随发酵时间的变化见图1。
由图1可见,发酵初期,发酵液的pH值有轻微下降的
趋势,但发酵进行到第2d时发酵液pH值开始回升,最后基
本稳定在pH3.8~4.0之间。此外随发酵过程的进行,果酒酒
精体积分数不断增大,尤其是在发酵的第2d,火棘果酒的
酒精体积分数增幅较大,之后酒精体积分数开始小幅上升。
这主要是由于酵母利用糖类物质产生乙醇。
图2显示火棘果酒发酵液中总糖含量逐渐下降,尤其
是发酵的第1d,总糖含量大幅下降,这与发酵液中的酒精
度增加是相对应的。由图3可以看出,随发酵液中多糖含
研究报告 81· ·
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图5 蛋白质和游离氨基酸含量随发酵时间的变化
Fig. 5 Changes of protein and free amino acid content during
the fermentation
量降低,发酵液的酒精度逐渐增加,二者具有对数相关性。
2.1.2 黄酮和多酚含量变化
黄酮和多酚的变化趋势很相似,均在发酵的1d后达到
最高值,之后有轻微下降,但是在发酵第4d和第7d黄酮含
量均有所回升,主要原因可能是火棘果中黄酮和多酚大部
分为醇溶性,随发酵时间延长酒精体积分数增加,黄酮和多
酚浸出量逐渐增加,同时火棘果发酵过程中采用通风摇瓶
发酵,这有可能导致发酵液中已经浸提出的黄酮、多酚的
氧化,因此在后期导致二者含量略有下降。这与许亮等[13]的
研究结果不同,主要原因可能是不同原料中黄酮种类不同。
2.1.3 蛋白质和游离氨基酸的含量变化
图2 多糖含量随发酵时间的变化
Fig. 2 Changes of polysaccharides content during the fermentation
图3 多糖含量与酒精度关系
Fig. 3 Relation between polysaccharides and alcohol content
图4 黄酮和多酚含量随发酵时间的变化
Fig. 4 Changes of flavonoides and polyphenoles content
图1 pH值和酒精体积分数随发酵时间的变化
Fig. 1 Changes of pH value and alcohol content during the fermentation
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总第 257期
由图5可见,发酵液中游离氨基酸含量逐渐上升,可
能有以下两方面原因引起,一是火棘果原料本身的游离氨
基酸在发酵过程中由于浸泡作用逐渐游离出来;二是蛋白
质降解产生新的游离氨基酸。
蛋白质含量在发酵的2d中达到最高值,主要是火棘果
发酵过程中蛋白质溶出量的增加导致;在发酵第3d~4d,其
含量快速下降,此时发酵液的pH值维持在3.7,这有可能是
此pH值达到了火棘果中部分蛋白质的等电点而导致蛋白
质沉淀,致使蛋白质含量快速下降;5d以后呈现下降趋势,
这可能是由于蛋白质分解释放出游离氨基酸而导致的。
2.2 发酵液抗氧化特性的变化
ABTS和FRAP法操作简单,适合于常规实验室大规模
采用[14-15],因此本文主要采用了这2种抗氧化指标。由图6可
以看出,发酵液对ABTS自由基的抑制率随发酵时间的延
长逐渐增加,但是发酵液在FRAP体系的还原作用却在1d后
达到最高值,之后呈现缓慢下降的趋势。由于火棘果酒发
酵液中成分复杂,因此在不同抗氧化体系中具体发挥作用
的成分不同,导致不同抗氧化体系中发酵液的抗氧化功能
的变化不同。同时由表1可看出,在FRAP体系中与发酵液
的TEAC值最相关的化学成分是多酚和黄酮,达到了极显
著水平(二者prob>F分别是0.000,0.004),发酵液的TEAC
值与多糖含量呈显著负相关,这主要是由于多糖降解产生
乙醇类物质,而乙醇类物质提高了黄酮和多酚的含量。发
酵液对ABTS自由基的清除能力最相关的化学成分是多
肽,达到了极显著水平(prob>F=0.000),其次是与黄酮和
多酚相关性,其相关性的显著性仅有0.104和0.111,未达到
显著水平,这说明火棘果酒发酵液中有可能产生了一些功
能性的多肽类物质,因此有待于进一步进行研究。
3 小结
综上所述,火棘果在发酵过程中,经酵母发酵作用,将
大部分糖转化为酒精;其中黄酮、多酚虽为醇溶,但因为火
棘果酒发酵液酒精度并不是很高,并且因其易氧化,在发
酵过程中其含量在发酵一天后缓慢下降,直至保持不变;
通过蛋白质和游离氨基酸的实验结果,可知部分蛋白质分
解为游离氨基酸。另外,对其抗氧化性的研究,表明火棘
果的发酵液具有很强的抗氧化作用,在整个发酵过程中对
ABTS自由基的清除作用和TEAC值保持持续上升的趋势。
参考文献:
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图6 火棘果酒发酵过程中抗氧化作用的变化
Fig. 6 Changes of antioxidation activities during the fermentation
注:“**”表示在0.01水平极显著相关;“*”表示在0.05水平显著相关。
表1 发酵液的抗氧化能力与其化学成分的偏相关
Table 1 Pearson correlation between antioxidant activities and
chemical contents of ferment solution
项目 黄酮 多酚 多肽 总糖 蛋白 ABTS FRAP
黄酮
偏相关 1 0.948** 0.346 -0.867** 0.257 0.615 0.877**
显著性 0.000 0.402 0.005 0.540 0.104 0.004
多酚
偏相关 0.948** 1 0.321 -0.890** 0.464 0.606 0.953**
显著性 0.000 0.438 0.003 0.247 0.111 0.000
多肽
偏相关 0.346 0.321 1 -0.669 0.450 0.941** 0.063
显著性 0.402 0.438 0.070 0.264 0.000 0.883
总糖
偏相关 -0.867** -0.890** -0.669 1 -0.452 -0.874** -0.769*
显著性 0.005 0.003 0.070 0.261 0.005 0.026
蛋白
偏相关 0.257 0.464 0.450 -0.452 1 0.467 0.339
显著性 0.540 0.247 0.264 0.261 0.243 0.411
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