全 文 ：第6卷第1期
2008年1月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Jan．2008
·47·
脂肪酶发酵过程中的油脂利用
张 亮，王炳武，谭天伟，朱耀光，武晓文
(北京化工大学 生命科学与技术学院北京市生物加工过程重点实验室，北京100029)
摘要：对假丝酵母Cand／dasp．99—125发酵生产脂肪酶的过程中油脂代谢情况进行了研究。分析了发酵过程中
甘油酯、油酸、棕榈酸等物质浓度随发酵时间的变化趋势，以及它们与茵体生长和产酶之间相互影响关系，结果发
现油酸的消耗能够显著地促进脂肪酶的合成(油酸质量浓度从30g／L降低到10g／L)，并且细胞对油酸和棕榈酸
的利用没有选择性，最终发酵脂肪酶活力可达8oooU／mL。
关键词：发酵；甘油酯；脂肪酶；油酸；棕榈酸
中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)01—0047—04
Theutilizationofdifferentoilsinlipaseproductionbyfermentation
ZHANGLiang，WANGBing-Wll，TANTian—wei，ZHUYao—guang，WUXiao—wen
(CollegeofLifeScienceandTechnology，BeijingUniversityofChemicalTedmology，Beijing100029，China)
Abstract：ThemetabolismoflipidsinCandidasp．99-125fermentationwasnvestigated．Theconsump．
tionofglyceride，oleicacidandpalmicacidinthefermentationprocess，thechangesintheirrespective
concentration，theirrelationshipwithcellgrowthandlipaseproductionweretheaims，whichindicated
theconsumptionofoleica idsignificantlyeontributedtothesynthesisoflipase．Oleicacidcontentwas
reducedfrom30s／Lto10s／L．neCandidasp．99—125utilizedoleica idandpalmicacidwitllnose·
lectivity．nefinallipaseactivityreached8000U／mL．
Keywords：fermentation；glyeefide；hpase；oleicac ；palmicacid
脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3)是一种特殊的
酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，将甘油
三酯降解为甘油二酯、单甘酯、脂肪酸。脂肪酶在
生物体内有着相当重要的生理功能，在动植物的各
种组织及许多微生物中都普遍存在。脂肪酶由于
来源不同可以分为动物脂肪酶、植物脂肪酶和微生
物脂肪酶。而微生物脂肪酶由于种类多、易于大量
生产及提纯等优点，是工业用脂肪酶的重要来源，
常见的包括假丝酵母u。2]、根霉L3】、青霉【41和假单
胞菌[51等产生的脂肪酶，其中假丝酵母(Candida
妒．)是国内外研究较多的产脂肪酶菌种。
对于脂肪酶的发酵工艺研究№’有一些报道，但
目前为止还没有见到有关脂肪酶发酵工艺中油脂
代谢利用情况的报道，因此本文通过选用自己筛选
的一株高产酶的菌株Candidasp．99—125进行发酵
实验，得到脂肪酶发酵生产工艺中油脂代谢为脂肪
酸且进一步被利用的结论。
收稿日期：2007-04-05
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20576013)；国家973资助项目(2003cw716002)；北京市自然基金资助项目(2071002)；北京市
科技计划资助项目(册205004040211)；国家杰出青年基金资助项目(20325622)
作者筒介：张亮(1982一)，男，山西晋中人，硕士研究生，研究方向：发酵工程。
联系人：谭天伟，教授，博士生导师，E-mail：twtan@mail．buct．edu．cn
万方数据
·48· 生物加工过程 第6卷第1期
1材料与方法
1．1 菌种
假丝酵母(Cand／dasp．99-125)，本实验室选育
保存。 、
1．2培养基
1．2．1斜面培养基
酵母粉2g／L，蛋白胨5∥L，葡萄糖lO∥L，琼
脂20g／L。
1．2．2摇瓶培养基
豆油40g／L，豆粕40g／L，K2HP04l g／L，
KH2P041 g／L。
1．2．3发酵培养基
豆油60∥L，豆粕80g／L，K2HP042g／L，
KH：PO。0．1g／L。加入适量消泡剂。
1．3发酵条件
1．3．1摇瓶培养
250mL锥形瓶中装摇瓶培养基50mL，从斜面
上接种，放置于旋转式摇床中在26℃下培养120h，
转速220r／mino
1．3．25L发酵罐培养
将发酵培养基(按2L装液量)配好并装入发
酵罐内，121℃下灭菌30min，冷却至26℃后接种，
搅拌转速400r／min，通风量1L／(L·rain)。
1．3．330L发酵罐培养
将发酵培养基(按12L装液量)配好并装入发
酵罐内，121℃下灭菌30rain，冷却至26℃后接种，
搅拌转速400r／min，通风量1L／(L·rain)。
1．4脂肪酶酶活的测定
采用橄榄油乳化液测定法。
1．5脂肪酸的分析
将1mL发酵液加入小烧杯中，使其均匀分布在
烧杯底部，放人烘箱内60℃烘干，取出后加入正己
烷密封萃取，将萃取液定容1mL后作为样品进行气
相色谱分析。
2结果与讨论
2．1油脂代谢成分的分析
按照“1．2．3”中的发酵培养基配方配置12L发
酵液在30L发酵罐中进行发酵实验，按时取样测定
发酵液的酶活等参数。通过气相色谱分析发现发
酵初期发酵液中的成分比较复杂，含有单甘酯、二
甘酯、三甘酯以及不同碳链长度的脂肪酸。各成分
中含量最多的是油酸，其次是二甘酯、棕榈酸、单甘
酯、三甘酯。
2．2发酵前期豆油成分变化
按照上述发酵条件，选取发酵36h前的样品进
行气相色谱分析，通过内标法定量分析发酵液中甘
油酯和脂肪酸的浓度变化，结果如图1所示。
S÷S
覆
吾重鼍
ca．
t／h
—D—palmicacid；+biglyceride；+m_onoglyceride；
—--一triglyeeride；一o-oleieadd
图1发酵前期甘油酯和脂肪酸浓度的变化曲线
Fig．1Changesinglyciatesndfattyacidsconcentration
intheearlystageoffermentation
从图1可知，初始培养基中含有大量的单甘酯、
二甘酯、三甘酯，油酸和棕榈酸。在发酵初期甘油
酯被水解为脂肪酸，因此发酵液中的单甘酯、二甘
酯、三甘酯浓度都在下降，18h以后发酵液中甘油
酯的浓度降低到较低水平，说明甘油酯被水解完
全，同时水解产生的脂肪酸(主要是油酸和棕榈酸)
量达到最大值(分别为30g／L，2．4∥L)。说明菌体
细胞对豆油的利用过程是首先将其水解成脂肪酸，
再利用脂肪酸。
2．3发酵过程中pH、酶活、生物量，油酸的变化规律
在上述发酵过程中定时取样，测定其中的pH、
酶活、生物量，以及油酸等物质的含量，并对其随发
酵时间的变化规律进行研究，结果如图2所示。
由图2可以看出，12h后油酸被菌体生长所利
用含量逐步降低，菌体生物量逐渐增加，发酵12—
18h油酸含量明显的升高，pH随之迅速下降。当
发酵18—36h时，由于甘油酯已经大量被水解，油
酸生成速率提高，同时细胞浓度大量增加，对油酸
的消耗速率也在增加，两者趋于相等，因此油酸含
量基本保持稳定。
一_-1．∞≤PI譬。馏I【BcDq
万方数据
2008年1月 张亮等：脂肪酶发酵过程中的油脂利用 ·49·
30
S25
望20
罨15
蛋lo
3
气5
0 20 4060 80100120140
一a—oleicacid；—o—pH；一-一酶活；-o-biomass
图2发酵过程中pH、酶活、生物量以及
油酸随时间的变化曲线
Fig．2Ch锄缈inpH．1ipaseactivity，biomassandoleic
acidconcentrationdur ngfermentation
发酵40～120h期间，生物量基本保持在130
g／L左右，油酸浓度的变化主要为菌体消耗，导致油
酸含量迅速降低，同时菌体大量合成脂肪酶并分泌
到胞外，酶活以较高速度增长，可达6000U／mL以
上。从图中这一阶段的酶活增加曲线和油酸消耗
曲线可以看出，两者存在一定的反比关系，即此时
油酸以比较恒定的速度被消耗，酶活以比较恒定的
速度在增加，因此说明油酸的消耗促进脂肪酶的
生成。
2．4油酸和棕榈酸随时间变化
在上述30L发酵实验中，发酵液中脂肪酸的含
量以油酸和棕榈酸为主，因此采用气相色谱的方法
进一步分析了两者之间的变化趋势，结果见图3。
t／h
一-一palmicacid；——o—oleicac d
图3油酸和棕榈酸浓度随时间变化
Fig．3Changesinoleica idandpalmic
acidconcentrationaf er20h
由图3可知菌体在生长和产酶是同时利用油酸
和棕榈酸，且油酸和棕榈酸随发酵时间的消耗规律基
本一致，并不存在选择性和先后次序之分。另外由于
油酸含量要远大于棕榈酸含量(比例大约为10：1)，
因此影响脂肪酶合成的主要因素是油酸。
2．5油酸浓度的影响
按照“1．3．2”实验条件，分别选取三个5L发酵
罐(编号l，2，3)进行对比实验，通过流加油酸控制发
酵液中油酸质量浓度大约在10g／L，20g／L，30g／L
范围内，比较最终发酵液脂肪酶的活力，结果见图4。
30
25
■20
∞
15
鼍lo
5
0
l 2 3
编号
I油酸浓度；臣勿酶活
图4油酸浓度对脂肪酶活力的影响
Fig．4Theffectofoleica idconcentrationonlipaseactivity
由图4可见，发酵培养基中油酸质量浓度将影响
脂肪酶的产酶，控制油酸浓度在30g／L左右，脂肪酶
活力最终可达6000U／mL；油酸质量浓度在20g／L
左右时酶活则略微降低，活力不到5000U／mL；当油
酸质量浓度在lOg／L以下时对我们发酵产酶影响较
大，酶活只有2450U／mL，不利于脂肪酶的合成。因
此发酵后期控制发酵液中油酸质量浓度在10g／L到
20g／L之间有利于脂肪酶活力的提高。
2．6流加油酸实验
在发酵过程中采用流加油酸的方式提高脂肪
酶的活力。按照“1．3．3”实验条件，在30L发酵罐
t／h
q—oleicacid；-o--pH；一I_酶活；+biomass
图5流加豆油实验中pH、酶活、生物量以及
油酸随时问的变化曲线
Fig．5ChangesinpH。lipaseactivity，biomassandoleic
acidconcentrationwhenoleica idWaSfed
一_-1．∞暮警g。邑q
例
脚
∞
∞
∞
o
—I_—昌．m，￡o_【×蜒髓
8
7
6
5
4
3
2●O
一_龟．n)香H
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6
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3
2
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协
∞
∞
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一_-1暑．量￡o一×挈{溢
8
7
6
5
4
3
2
1
O
—I-1．望勺召哥q售IB鼍
万方数据
·50· 生物加工过程 第6卷第1期
中实验，结果见图5。
从图5可知，各个参数的变化规律基本符合前
面所述，当发酵进行到78h时发酵液中油酸的含量
迅速下降，当发酵时间到90h时开始逐步流加油酸
其含量有所上升，由于此时生物量已基本趋于稳
定，菌体迅速利用油酸，96h后油酸含量逐渐下降，
酶活不断的增长，从6000U／mL增长到800013／
mL。从以上数据验证了脂肪酸特别是油酸对脂肪
酶菌体生长和产酶能起到明显的促进作用。
3结论
(1)菌株Cand／dasp．99-125假丝酵母发酵过
程中菌体对豆油的代谢利用过程是甘油酯首先被
分解生成油酸和棕榈酸等脂肪酸(主要为油酸)，再
以脂肪酸的形式被利用。
(2)菌体对于油酸和棕榈酸的利用规律基本保
持一致，不存在选择性。
(3)比较了流加不同浓度油酸对产酶的影响，
较高浓度的油酸对产酶有利，但脂肪酶活力提高并
不显著。因此将油酸质量浓度控制在10g／L到20
g／L之间，最终发酵生产脂肪酶的活力可达8000
U／mL。
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研究[J]．生物工程学报，2004，20(6)：918-921．
澳大利亚开发出玉米淀粉制成的塑料包材
澳大利亚的种植工艺技术(PlanticTechnologies)公司已经研究开发成功一种用后可以舍弃的塑料包装新
容器。研究人员开发的是一种在外形和手感上与日本化成公司生产的塑料材料完全一样，而且同样可以进
行彩色印刷的生物分解性新包装材料。这种以玉米淀粉为原料加工制成的包装材料同样可以进行裁切和
成形的加工处理。新生物分解性包装材料的原料是玉米淀粉，其结构适合于塑料制作。这就是需要特殊栽
种的高直链淀粉——具有长链分子结构的直链淀粉。新包装材料不仅可以加工成对环境保护有利的塑料
制品，而且其相对价格也比较低廉，有利于推广使用。
应用试验说明，这种新材料作为巧克力和饼干等干燥食品的包装材料是稳定而又稳妥的。新包装材料
一旦投放在水中，就可以立即开始分解，直到最终完全分解而消失。
(张春鹏)
万方数据