全 文 ：Aug．2007
·74·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第5卷第3期
2007年8月
香菇多糖提取分离的研究
缪 建，杨文革，周 彬，陆修涛
(南京工业大学 制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：采用DEAE—cellulose柱层析和SephadexG一200柱层析从香菇子实体热水浸提的粗多糖中分离出两个多糖
组分Lenl—A、Len2一A，经旋光度法、Sepharose4B柱层析、红外光谱等方法检测确定为均一多糖组分，且均为仪．构型
的吡喃糖，苯酚硫酸法i受4得其糖质量分数分别为91．5％和92．3％，旋光度为+5．6。、+11．2。，相对分子质量为
375×103、718×103。
关键词：香菇多糖；DEAE—cellulose；SephadexG-200；Sepharose4B
中图分类号：Q539 文献标识码：A 文章编号：1672—3678【2007】03-0074-04
ExtractionandisolationofLentinanfromoflentinusedodes
MIAOJian，YANGWen—ge，ZHOUBin，LUXiu—tao
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，Nanjin9210009，China)
、
Abstract：强ecrudeL ntinanwasfirstlyextractedbywater-extractingandalcohol-depositing．andwas
furtherd proteinzatedbyp painandSevagemethod．Thepurificationof hepolysaccharidesw scarried
outbyDEAE—cellulosechromatographyandSephadexG-200columnchromatography．Twofractionswere
obtained，namedasLenl—A，LeIl2-A．，11letwofractionswereexaminedbyopticalrotation，Sepharose4B
columnchromatographyandIR，ther sultsshowedthatwofractionswereahomogenouspoly accharide，
Lenl—A，Len2一Aare0【一pyranoses．ThetotalsugarcontentofLenl，kn2were91．5％and92．3％．
Theopticalrotationwere+5．6。and+11．2。．Their肘形were375×105and718×105．
Keywords：Lentinan；DEAE—cellulose；SephadexG-200；Sepharos4B
香菇是药食两用菌类，由于其营养丰富，历来
受到人们的喜爱，其含有香菇多糖、香菇嘌呤¨J、氨
基酸等多种有效成分而备受药物研究工作者的关
注，特别是其中的香菇多糖(Lentinan)具有显著的、
独特的抗肿瘤活性，并能够减轻放疗和化疗的毒性
反应旧J。临床医学证明香菇多糖安全无毒副作用，
其抗肿瘤的药理作用并非直接杀伤细胞或抑制细
胞生长，而是表现在增强人体免疫调节作用。它通
过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善人体机体
平衡，达到恢复和提高人体细胞对淋巴因子、激素
及其他生理活性因子的反应，因此，人们常称香菇
多糖为生物反应修饰剂∞1。本实验以香菇子实体
为材料，提取纯化得到香菇Lenl—A、Len2一A，并对其
性质进行了初步研究。
1材料和方法
1．1实验仪器及材料
1．1．1实验仪器
紫外分光光度计(752型)(上海精密科学仪器
收稿日期：2006-06-05
作者简介：缪建(1982一)，男，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：天然产物研究。
联系人：杨文革，副研究员，E—mail：chemywg@126．con
万方数据
2007年8月 廖建等：香菇多糖提取分离的研究 · 75·
有限公司)；(上海精宏实验设备有限公司)；离心机
(GL．21M型)(上海市离心机械研究所)；TH-500梯
度混合器(上海青浦护西仪器厂)；BSZ一100自动部
分收集器(上海青浦沪西仪器厂)；HL一2恒流泵(上
海青浦沪西仪器厂)；WZZ．2A型自动数显旋光仪
(上海宇隆仪器有限公司)；MX一1E傅利叶变换红外
光谱仪(美国)。
1．1．2 原料与试剂
香菇子实体(购于南京市农贸市场，去柄，烘
干，粉碎成粉末)、木瓜蛋白酶(北京化学试剂公
司)、DEAE．52(Whataman)、SephadexG一200(Phar-
macia)、Sepharose4B(Pharmacia)，其他试剂均用国
产分析纯。
1．2方法
1．2．1提取
香菇子实体粉碎，低温烘干，准确称量，乙醚回
流脱脂，乙醚提取物回收处理，香菇子实体粉末加
入20倍量水，温度50℃，反应时间为80min提取
香菇多糖粗品，活性炭脱色【5】，离心除去沉淀，上清
液中加入95％乙醇，使乙醇终体积分数为75％，离
心取沉淀即得香菇多糖粗品。
1．2．2酶法结合Sevage法脱蛋白
见参考文献[6—7]。
1．2．3糖含量测定
测定方法见参考文献[4]。
1．2．4香菇多糖粗品的分离纯化
1．2．4．1DEAE-52柱层析
香菇多糖粗品水溶解后过DEAE-52层析柱(3
cm×60cm，柱高52cm)，DEAE-52层析柱先用pH
5．8的磷酸盐缓冲液平衡，样品溶于此缓冲液后
上柱。
洗脱程序如下：首先用蒸馏水进行洗脱，洗脱
400mL，然后用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，洗脱800
mL，流动相A：0．01moL／L的磷酸盐缓冲液(pH
5．8)，流动相B：0．01mol／L的磷酸盐缓冲液(pH
5．8，含1moL／LNaCl)，梯度洗脱：0—400min，A
100％～15％，B0％～85％。控制流速为2
mL／min，每10mL收集一管。测定其中的多糖含
量，以490nm处吸光度(A。∞)为纵坐标，洗脱管数
为横坐标得到多糖的洗脱曲线，收集主要吸收峰中
间部分，透析，冷冻干燥。
1．2．4．2葡聚糖凝胶G-200柱层析
SephadexG-200凝胶湿法装柱(2．5cm×60
cm)，用0．05mol／LNaCI(0．25斗m微滤膜过滤)作洗
脱液，在流速5mlJh下平衡72h。把DEAE-23层析
柱分离出的多糖组分分别溶于尽量少的水中，上柱，
用恒流泵控制流速(15mL／h)，自动部分收集器收
集，用苯酚一硫酸法测定各洗脱液490nm处吸光度，
由吸收曲线得到两个峰，收集主要吸收峰，冷冻干燥。
1．2．5纯度鉴定
1．2．5．1比旋度法
将分离得到的两种多糖分别用水溶解，在加乙
醇至醇体积分数为40％析出沉淀，继续加乙醇至醇
体积分数为70％的析出沉淀，将两次沉淀干燥后测
定其相同条件下水溶液的比旋度，如比旋度相同，
证明该多糖为均一组分旧』。
1．2．5．2蛋白质去除效果
多糖中蛋白质的检测常用考马斯亮蓝G-250染
色法‘9|。
1．2．5．3Sepharose4B柱层析
Lenl．A、Len2．A各10mg溶于尽量少的蒸馏
水，分别上Sepharose4B柱，以质量分数1％的
NaCl溶液洗脱，自动部分收集器收集，0．21
InjVm氓苯酚-硫酸法检测洗脱糖溶液的490nm处
吸光值。
1．2．6相对分子质量的测定¨叫
用Sephamse4B柱(1．2cm×85cm，柱高75
cm)，分别称取蓝色葡聚糖2000和标准葡聚糖(相
对分子质量分别为1．1×104，4．1×104，7．1×104，
2．67×105，5．80×104)各2mg，分别溶
cm)，分别称取蓝色葡聚糖2
00和标准葡聚糖(相 对
分子质量分别为1．1×104，4．1×104，7．1×104， 2．67×105，5．80×104)各2
mg，分别溶解于0．1mol／L
NaCl溶液中，各自在Sepharose 4B层析柱上以0．1moL／L
NaCl溶液洗脱，洗脱液流速为5 m
L／h，苯酚．硫酸法检测，测得外水体积(K)和各标
lg
M形为横坐标(z)，绘制标准曲线，再以2 mg样品上
柱洗脱，得洗脱体积，对照标准曲线得出样品的 相 对分子质量。1
．2．7红外光谱分析分
别称取Lenl—A、Len2一A各2 mg，以KBr研匀后
压片，于4
000～500 am。1的红外区进行光谱扫
万方数据
· 76· 囊物加工过程 第5卷第3期
巍蓝法测得蛋白藤质量分数为0．29％，蛋白去除率
为93。3％。
2．2 DEAE-52层析桂洗滕
粗多糖经DEAE-52层析柱后分离得到Lenl、
Len2两个组分(见图1)，Lenl在蒸馏水洗脱阶段被
洗脱，Len2在磷酸盐缓冲液梯度洗脱阶段被洗脱。
O 2∞4006∞ 800lⅨ殓 l2∞
矿《浼藐)／mL
圈1 誊菇多糖的DEAE-52柱层析结果
Fig．1Resultsofpolysaccharidefromlentinusedodesby
DEAE—cellulosechr matography
2．3香菇多糖Lenl、Len2酌SephadexG-200柱
层析
香菇多糖Lenl、Len2分别经过SephadexG-200
槛层析(见墼2、躁3)，各得到一个主峰，霉錾主獠冷
冻干燥，得到自色絮状的香菇多糖Lenl—A、kn2．A。
管数
注：每管容积tmL
霾2 Lenl豹SephadexG-200柱层辑缝栗
Fig．2ResultsofLenabySephadexG-200
columnchromatography
2。4纯度鉴定
2。4．1毖旋度法鉴定多糖
多糖组分Lenl-A、I七112-A溶于水后分别在乙醇
管数
注：每管容积ImL
图3 Len2的SephadexG-200棱藤耩结果
’●
Fig．3ResultsofLen一2bySephadexG一200
columnchromatography
体积分数为30％，6◇％酶溶液中沉淀，将两次沉淀
干燥盾测定其相同条件下水溶液的比旋度，比旋度
分别为+5．6。，+11．2。，证明该多糖为均一组分。
2．4．2残留蛋白质含量检测
对Lenl—A、kn2。众分男I用考马麓嶷蓝G-250染
色并在595nln下测定吸光度，通过牛舷清蛋白质标
准曲线计算蛋白质质量分数分别为0．06％、
0．1l％，表明Lenl—A、hIl2_A中蛋白质已基本除尽。
2．4．3Sepharose4B桂层析
Lenl—A、kn2一矗的Sepharose4B柱层柝洗巍酶
为单峰(见图4、图5)，并且峰形较为狭窄对称，证
明Lenl—A、Len2：A的棚对分子质量分布较为均一。
O lO 20 30 40 50 60 70
管数
淀：每管容积ImL
图4 Lenl—A的Sepharose4B柱层析结果
Fig．4ResultsofLenl—AbySepharose4B
columnchromatography
5
4
3
2
1
O
0
O
e
0
万方数据
2007年8月 廖建等：香菇多糖提取分离的研究 · 77·
0．5
0．4
O．3
0．2
O．1
0 10 20 30 40 50 60 70
管数
注：每管容积lmL
图5 IJen2-A的Sepharose4B柱层析结果
Fig．5ResultsofLen2一AbySepharose
4Bcolumnchromatography
2．5总糖含量的测定
以苯酚．硫酸法测得Lenl-A、Len2一A糖质量分
数为91．5％和92．3％。
2．6相对分子质量的测定
Sepharose4B柱层析测得Lenl．A的洗脱体积
为42mL，LeIl2．A的洗脱体积为36mL，外水体积圪
为32mL，根据测得的标准曲线Y=5．02136—
0．6653戈计算，Lenl—A的相对分子质量为
375×105，Len2-A的相对分子质量为718X105。
2．7红外光谱分析
Lenl．A的红外光谱显示Lenl—A在3376cm。1
的吸收峰为0一H伸缩振动，2922cm。1和1416
cm以的吸收峰为c—H伸缩振动和c—H变角振
动，有了以上3种峰，就可以判断Lenl．A为多
糖¨1I。1 54cm一、1078cm一和1026cm。1是吡喃
环的C一0一C和c一0一H的伸缩振动特征吸收。
843m。1为a一构型的典型吸收，说明Lenl—A为0【-构
型的吡喃糖¨“。
Len2一A的红外光谱显示Len2一A在3384cm。的
吸收峰为0一H伸缩振动，2921cm。1和1411cm。
的吸收峰为C．H伸缩振动和C—H变角振动，有了以
上3种峰，就可以判断Len2-A为多糖。1162cm～，
1 071cm。1和1042cm。是吡喃环的C—O—C和C一
0一H的伸缩振动特征吸收。817cm‘1为o／．．构型的典
型吸收，说明Len2．A为仅一构型的吡喃糖‘111。
3结论
从香菇中提取的粗多糖经过DEAE-52层析柱、
SephadexG-200层析柱进一步分离纯化，得到两个
香菇多糖组分Lenl—A、Len2．A，糖质量分数达到
91．5％和92．3％，经过比旋度法、残留蛋白质检
测、Sepharose4B柱层析鉴定Lenl—A、Len2．A均为
均一组分，相对分子质量分别为375×103、718×
103，红外光谱显示Lenl．A、Len2一A均有多糖的特征
吸收峰，且均为O／．一构型的吡喃糖。
对于这两种香菇多糖的结构及性质分析，有待
于进一步的研究。
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