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·26· 生物加工过程 第5卷第4期
由木霉制备的纤维素酶含有高活力的内切葡
聚糖酶和外切葡聚糖酶，但口一葡萄糖苷酶活力较
低”1。在利用该类纤维素酶水解纤维素的过程中，
纤维二糖不断积累，而纤维二糖的大量存在导致内
切和外切葡聚糖酶的催化活性受到强烈的反馈抑
制”】。stemberg等”1为了解决木霉中的伊葡萄糖
苷酶水解效率低下，首先将黑曲霉的口．葡萄糖苷酶
添加到木霉分泌的纤维素酶制剂中，发现水解活力
显著提高，并提出该协同作用的机制是由于卢一葡萄
糖苷酶解除了纤维二糖对术霉中纤维素酶的抑制。
随后口-葡萄糖苷酶的研究便广受关注。Du丘”1利用
里氏木霉和米曲霉混合培养技术来提高纤维素酶
制剂中口．葡萄糖苷酶的活力及其酶解纤维素的能
力。stochton等”1研究了利用商品纤维素酶有效降
解两种不同来源的纤维素为葡萄糖时母一葡萄糖苷
酶的适宜添加量。zhao等”。在研究同时糖化发酵
造纸厂废弃纤维制备酒精的工艺中，通过添加适量
的黑曲霉口．葡萄糖苷酶与青霉纤维素酶协同作用，
结果与单独采用青霉纤维索酶相比，纤维素的降解
率提高了33．9％，酒精得率提高了42．1％；沈雪亮
等”1固定化黑曲霉固态发酵后的孢子，并与r一一
”i纤维素酶协同降解纤维原料，酶解得率比单独采
用zⅧf纤维素酶提高了31％。所以，添加外源
的肛葡萄糖苷酶是提高酶解效率的一种有效途径。
但如何降低添加卢一葡萄糖苷酶所增加的使用成本
以及建立一个合理、可行的水解模式成为一个新的
研究主攻方向。
与游离酶相比，固定化酶可以较长时间内反复
分批反应和装柱连续反应，从而能提高酶的使用效
率，增加产物的收率，降低生产成本；在反应完成
后，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工
艺，提高了产物的质量”1。基于这些显著特点，本
文以海藻酸钠为固定化材料，研究了固定化_；B一葡萄
糖苷酶的方法及其条件，并利用固定化卢一葡萄糖苷
酶进行了分批和连续酶解试验。研究结果既验证
了固定化酶的效果，叉为建立固定化口一葡萄糖苷酶
辅助降解纤维原料酶解液的新模式或新工艺提供
了理论依据。
1材料和方法
1rl口一葡萄糖苷酶
来源于黑曲霉(A胖增Ⅱ沁却．NL一1)产卢-葡萄
糖苷酶发酵液的上清液。上清液经过超滤浓缩后
贮于一20℃冰箱中保存备用。木霉纤维素酶购于
南京博全科技有限公司，生化试剂级，产地美国，滤
纸酶活力为150u／g。
1．2海藻酸钠固定化口-葡萄糖苷酶
直接包埋法：将质量分数3．5％海藻酸钠(或质
量分数3．5％海藻酸钠与质量分数3．O％明胶混合
物)和酶液(酶用量为100u／g绝干海藻酸钠)按一
定比例混合，在37℃水浴中使海藻酸钠溶化，并使
海藻酸钠溶液与酶溶液充分混匀。用5mL注射器
(5号针头)吸取载体与酶的混合液，以lOcm左右
的高度逐滴注入质量分数2％氯化钙溶液中，立即
形成光滑的凝胶小球。滤出凝胶小球，更换氯化钙
溶液，在4℃冰箱中静置硬化2h。再次滤出凝胶小
球，用质量分数0．9％NaCl(生理盐水)洗涤后，用
吸水纸吸干表面水分。贮存于4℃冰箱中。
包埋交联法：凝胶小球在氯化钙溶液中硬化2h
(4℃)后，用体积分数o．3％戊二醛交联凝胶小球
后3h。其他条件及步骤均与直接包埋法相同。
交联包埋法：在海藻酸钠溶液与酶溶液充分混
匀后，加人体积分数1％的戊二醛，在振荡器上振荡
30min，并于4℃冰箱中静置交联3h。步骤与直接
包埋法相同。在优化固定化条件时，以交联一包埋的
方式进行固定化。其中，海藻酸钠质量分数为1％
一5％，给酶量为50—200U／g绝干载体，氯化钙质
量分数为0．5％一4％，固定化时间为l一6h，交联
剂用量为O．5％一1．25％。
1．3 固定化酶水解纤维二糖
1．3．1 固定化肛葡萄糖苷酶重复分批酶解
在150mL三角瓶中加入50mL、5g／L的纤维
二糖底物和一定量的固定化酶，在pH4．8，50qc，80
一120r／min条件下反应一定时间(以水解液中葡萄
糖浓度不再变化为准，一般为12h)。酶解结束后，
移出反应液，取样测定其葡萄糖含量。加入新鲜底
物进行下一轮的降解反应。
1．3．2固定化口_葡萄糖苷酶连续酶解
在240mL柱式反应器中装填固定化酶，填充系
数为70％，底物在蠕动泵作用下由底部进料(5g／L
的纤维二糖)，顶部出料。研究不同进料速度(O．5，
1．o，1．5，2．0，2．5，3．0mI／mjn)下固定化酶的催
化效率。定时取样测定出口处的葡萄糖含量并计
算酶解得率。
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2007年11月 赵林果等：海藻酸钠固定化芦-葡萄糖苷酶的研究
l_4固定化口一葡萄糖苷酶与木霉纤维素酶协同作
用水解纤维素
分别以新华定量滤纸(粉碎至60目)和微晶纤
维素为底物，加入一定量的木霉纤维素酶及固定化
的口．葡萄糖苷酶，在PH4．8，50℃，120r／IIlin条件
下反应60h。反应体系中，木霉纤维素酶滤纸酶活
力为2，ou／mL，其中口．葡萄糖苷酶活力为0．25
u／mL。添加的固定化口．葡萄糖苷酶在的活力分别
为0．25，O．5，O．75u／mL，同时以不添加固定化酶为
空白对照。
1．5酶的固定率测定
分别测定固定化过程中加人游离酶的总活力
^矗以及固定化后上清液中酶的总话力蛆或固定化
凝胶所含的总酶活鸩。固定率=(％一肼。)／^如×
100％或固定率=幔／％×100％
1．6 固定化酶稳定性的测定
通过测定一定量的固定化酶在pH4．8，50℃，
80～120r／IIlin条件下数次酶解5g／L纤维二糖底
物的酶解得率来表示。每轮酶解结束后，滤出凝胶
小球并用蒸馏水洗涤2—3次，然后再用于下一轮的
酶解试验。通过酶解轮数的多少和酶解得率的大
小来判断固定化酶稳定性的好坏。
1．7口一葡萄糖苷酶酶活的测定
以水杨素(nuka公司)为底物，采用DNs法测
定”1。固定化口．葡萄糖苷酶酶活的测定是将测定
游离酶酶活方法中的0．5mL适当稀释的酶液用
O．5mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余
步骤同游离酶酶活的测定。
1．8葡萄糖含量的测定
采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色
法⋯j。葡萄糖浓度(mm彤L)=测定管吸光度／校
准管吸光度×5．6x稀释倍数。
1．9酶解得率的计算
酶解得率(％)=(葡萄糖的浓度×O．9×loo)／
纤维二糖或纤维素的浓度。
2结果与讨论
2．1海藻酸钠固定口一葡萄糖苷酶的固定方式
海藻酸钠是糖醛酸的钠盐聚合物，在酸性条件
下可形成凝胶。是一种常用的固定化材料。试验
以海藻酸钠为主要固定材料，选用了直接包埋、包
埋-交联、交联一包埋不同方式固定口一葡萄糖苷酶。
通过测定各自固定化小球的酶活力及2g固定化酶
在相同条件下降解5∥L纤维二糖的前三轮酶解得
率，比较了它们的固定率、稳定性。结果如表1所
示。从表l可知，直接包埋效果不好，其中单一的
海藻酸钠直接包埋效果最差，固定率为26．5％。其
稳定性也很差，存在大量酶的流失现象。第三轮的
酶解得率从第一轮的51．05％下降到11．91％。加
人明胶以后，由于明胶是一种多肽聚合物，在一定
pH条件下，带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成
聚合物，在形成聚合物的过程中，能将游离酶包埋
起来”“。所以，在将海藻酸钠与明胶按一定比例混
合后，其固定率有了一定程度的提高，增加到36％。
但固定化酶的稳定性未得到明显改善，随着酶解轮
数的增加，酶解得率大幅度下降。当采用包埋和交
联同时固定口一葡萄糖苷酶时，由于使用的戊二醛是
一种双功能交联剂，可以使海藻酸钠分子发生交
、联，同时也可以使酶交联在载体上，强化海藻酸钠
的机械强度和固定化酶的稳定性“⋯，所以，无论是
先交联还是后交联，酶的固定率都有了明显提高，
酶的稳定性也得到了明显的改善。其中，交联一包埋
法可能比包埋一交联法更有利于酶与载体的交联，因
而效果更好些，其固定率达到51．7％，一到三轮酶
解得率分别为87．13％，88．25％，82．83％。因此，
在优化固定化条件时，确定以交联·包埋的方式为固
定化方式。
表l不同固定方式对口一葡萄糖苷酶固定效果的影响
1铀le1 E如cts0fdiHerenIimmobil城ngmethods
ont上lemte0fim巾obilizedB—gluc08ld蛆e蛐d
Btability0fimIIlobilizedB—glu∞sid∞e
2．2海藻酸钠凝胶固定卢-葡萄糖苷酶条件优化
2．2．1海藻酸钠浓度对酶的固定率的影响
配制不同浓度的海藻酸钠溶液，在相同的条件
下制成固定化酶，并测定酶的固定率。结果见图l。
结果表明，酶的固定率随着海藻酸钠的浓度的增大
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2007年11月 赵林果等：海藻酸钠固定化口一葡萄糖苷酶的研究 ·29·
凝胶的机械强度也有重要的影响。将氯化钙质量
分数分别调整为0．5％，1％，1．5％，2％，2．5％，
3％，3．5％，4％进行固定化，测定酶的固定率。结果
见图3。实验数据表明，氯化钙质量分数从O．5％增
加到l％时，酶的固定率显著提高；从1％增加到
2％时，固定率增加幅度减缓，并于2％时达到最大
值；之后，随着氯化钙浓度的增加，酶的固定率开始
下降。显然，过低的钙离子浓度形成的凝胶网状孔
径比较大，截留住的酶比较少，而过高的钙离子浓
度又会使网状孔径过小，高分子联结较紧密，在酶
促反应时，底物扩散阻力增加。所以，质量分数2％
的氯化钙较适宜。
表2戊二醛对酶固定率厦其稳定性的影响
Table2 E艉ctof∞眦emmtionofdutar丑ldehydeonthe
mtc“iⅢobilized口·一uc嘣dase∞d
BfabnI【y0fi唧obibzed肛gluc0$id啪
国3氯化钙浓度对酶固定率的影响
Fig．3E如ctofcor屺e『I仃Btion0fcacl2ontheraIe
0fimmobiu∞d口一gIuc0Bid㈣
2．2．5固定化时间对酶固定率的影响
固定化时间是海藻酸钠与酶的混合液滴落到
氯化钙后的反应时问。固定化时问对酶固定率的
影响见图4。从图4中可知，固定化时间在1—2h
之间时，时间越短，酶的固定化率越低；但超过2h
后，随着时间的延长，酶的固定率逐步下降。这是
因为海藻酸钠与氯化钙形成凝胶是ca2+通过海藻
酸钠胶囊由外向内置换Na+而形成海藻酸钙，因而
需要一定量的置换时间。但如果固定化时间太长，
交联程度高，形成的凝胶结构太紧密，从而影响到
酶促反应时的反应速率，检测到的固定化酶的活力
就会下降。所以，cacl：固定化时间选择为2h。
圈4固化时间对酶固定率的影响
Fi94E如ctofi唧obihzcd6me加ther且t
0fimmobiIized卢-duc∞jd鸽e
2．3 固定化口-葡萄糖苷酶在酶解纤维二糖中的应用
植物纤维原料经木霉产生的纤维素酶水解后。
水解液中含有较大量的纤维二糖。利用外源的纤
维二糖酶能将水解液中的纤维二糖降解成可发酵
性的单糖。为了进一步验证口．葡萄糖苷酶的固定
化效果，以及初步探索固定化口．葡萄糖苷酶在植物
纤维原料酶水解液中应用模式及其工艺。试验以5
∥L纤维二糖为底物，设计了重复分批酶解试验和
连续酶解试验。
2．3．1重复分批酶解纤维二糖
在150mL三角瓶中加入5∥L的纤维二糖底
物50mL和湿重为10g的固定化凝胶珠(口一葡萄糖
苷酶活力为每g凝胶珠2．5u，湿重)，在pH4．8，50
℃，120r／min条件下反应12h。酶解结束后，取样
测定其葡萄糖含量。同时，将分离出来的固定化口．
葡萄糖苷酶加入新鲜底物进行下一轮的降解反应。
如此重复共进行23轮的酶解试验，结果如图5所
示。从图5中可知，随着酶解轮数的增大，水解液中
葡萄糖浓度、酶解得率均呈下降趋势，但变化幅度
很小。所以，通过固定化条件的优化，制备的固定
化口一葡萄糖苷酶催化性能相当稳定，且催化效率较
高，重复利用17次仍能保持95％以上的酶解得率。
重复利用20次仍能保持90％以上的酶解得率。这
一结果对于提高酶的利用率，降低植物纤维原料生
物制备燃料酒精的成本具有重要的意义。
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一但使用术霉纤维素酶．反应体系中B一葡萄糖苷酶活力为O．25Ufmlz十添加固定化酶，反应体系中13一葡萄精苷酶总活力为0．5Utah．；
+掭加田定化酶，反应体系中B一葡萄糖苷酶总活力为075U／mL一掭加固定化酶．反应体系中p一葡萄塘苷酶总恬力为loU／mL
圈7添加固定化口-葡萄糖苷酶对术霉纤维素酶水解滤纸纤维素(A)和微晶纤维素(B)的影响
Fig．7Effectoftheaddition口fi,mtwbilizcd．S-glucosidaseollthesacchammtion0ffilterpaperandAviedby￡6rideeeUulase
到96．7％和99．0％。
(3)固定化口一葡萄糖苷酶与木霉纤维素酶协同
作用能显著提高纤维素的水解程度。与单独采用
术霉纤维素酶水解结果相比，在口一葡萄糖苷酶总活
力与滤纸酶活之比为0．5(FPA为20U／mL)的条
件下酶解滤纸纤维素和徽晶纤维素60h，他们的得
率分别增加了20．4％和29．3％。
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