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万方数据
2006年5月 黄志华等：微生物法生产l，3一丙二醇的基因工程研究进展 ·3·
讹调节子受三个因子调控。首先，妣调节
子被讹R编码的抑制子抑制，该抑制子作用为转
录水平从而抑制妣系统酶的合成。在DHA存在
下抑制子失活，其机理可能是与抑制因子结合并使
其失活H¨。其次，氧对如n系统有负调节作用。当
细胞厌氧代谢甘油时，氧将引起甘油脱氢酶和1，3一
PD氧化还原酶不可逆失活-9J。第三个调节讹系
统的因子是环化磷酸腺苷(cAMP)。当在K．p聊“一
瑚n池厌氧生长培养基中加入底物葡萄糖时，甘油
脱氢酶和1，3．PD氧化还原酶活性丧失一半。cAMP
的存在消除了葡萄糖的代谢抑制，说明葡萄糖和
cAMP的调控作用。cAMP的正调节作用可能是因
为它能够刺激RNA聚合酶和启动子结合从而激活
rIlI矾A的合成‘12I。
2构建基因工程菌株的5种思路
为了提高生物法生产1，3．PD的产量和产率，降
低原料成本，提高生物法生产1，3一PD的竞争力，需
要得到高产量、高产率和高转化率的菌株。利用基
因工程方法构建基因工程菌株，就是一个很好的选
择。
基因工程菌的构建策略主要有5种实验方案，
见图2。
(1)通过基因工程方法强化还原途径中限速酶
(如甘油脱水酶)的表达以及阻断副产物代谢途径，
并多克隆表达编码激活因子的基因；
(2)将1，3．PD生产菌的如oB、抛T基因克隆
到甘油生产菌中，以希望获得能将葡萄糖转化为
1，3．PD的基因工程菌；
(3)将甘油生产菌的蹦R1、GPP2基因克隆到
1。3．PD生产菌中，以希望获得能将葡萄糖转化为
1，3．PD的基因工程菌；
(4)将1，3。PD产生菌的妣调控子调控的基因
克隆到E．co尻中，获得能转化甘油为1，3一PD的基因
工程菌；
(5)将1，3一PD的抛B、妣T基因和甘油生产
菌的D解1，GPP2基因克隆到E．c0如中，从而获得
能将葡萄糖转化为1，3．PD的基因工程菌。
2．1原始生产菌株中1，3．PD代谢途径的改造
Aherens等¨3o和Menzel等¨40发现在K．p，zeu一
啪凡i伽内，甘油脱水酶和丙酮酸激酶分别是还原途
径和氧化途径的限速酶。酶活分析表明甘油脱水酶
在C．6埘仍c啪中也是1，3．PD生产的限速酶。Men．
zel等人【14J对K．p珊姗oni僦的代谢工程改造做了大
量研究，他们构建了含有编码甘油脱水酶和1，3．PD
氧化还原酶基因的质粒，将其插入野生菌种中，结果
证明这两个酶的活性得到了大幅度提高。但是在实
际的发酵过程中，该工程菌并未产出高浓度的1，3．
PD。原因可能有两个方面，一是所构建质粒的稳定
性差，二是最终产物1，3一PD对如。调节子的基因表
达有着强烈的反馈抑制作用。
④ @
图2基因工程菌的构建策略
Fig．2Strate百esofgeneticre onlbinantsn
1，3一pIDpanediolbiosy lthesis
甘油脱水酶很容易在发酵的过程中失活¨“，从
而降低1，3．PD的合成效率。Tomya等人的研究表
明，向甲苯处理后的K．p，ze啪ni伽和K．眦脚m细
胞中加入ATP、M孑+(或Mn2+)及辅酶B1：时，可以使
失活的脱水酶复活【16|。当将K．咧o∞中二醇脱水
酶基因与其37一末端的两段读码框共同在E．c0如中
表达后，再加入A耶、M92+及辅酶B，：，其感受态细胞
能使自杀性失活的脱水酶恢复催化活性，也能激活
脱水酶一氰钴氨素的复合体。因此认为这两个读码
框编码能使二醇脱水酶复活的蛋白因子(简称复活
因子)，分别命名为拙A和鼢B基因¨7I。现在，脱
水酶复活因子已经分别在K．pne啪n妣u5|、C．咖一
M以护83中发现并得到证实。目前对复活因子的应
用研究大多集中在其复活调控功能上(如表2所
示)，而其对1，3．丙二醇合成影响的研究开展较少，
此这方面还有很大的研究空间。
此外，编码甘油脱水酶的DNA序列具有高度的
保守性，这非常有利于利用分子生物学筛选技术来
开展相关微生物的识别工作。KnietschA等u引建立
了一个相关的DNA文库，他们利用DNA探针等基
因操作方法分离出了一系列甘油脱水酶的自然突变
体，这些突变体对于甘油和l，3．PD具有高的耐受
·I生。
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·4· 熏物加工过程 第4卷第2期
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翻蒯勉s 幺趣勰蒎 西Slll 豆．∞菇麟109pCsl2；0(兹勰嬲)诱导表达，使失活的酶复活n83
最近，Rayllaud等人[2lj从分子和生化的角度对
编码g。6翰嘞聪瓣V磁1718酶l，3一P矜操缎子的基因
进行了分析。这个操纵子由妣Bl，讹B2和抛T
组成。当在以甘油为碳源，不含有维生素B1：的培养
基上培养表达该操纵子的露．∞鑫时，能产生l，3．羚
并且袭达出很离的甘油脱水酶和1，3。PD氧化还原
酶的话性。妣Bl和妣溉分别编码了一种新的
类型的甘油脱水酶和其复活蛋白，与所有已知的依
赖辅酶B，：的甘油脱水酶没有同源性，却非常类似于
丙酮酸甲酸裂勰酶和其复活蛋白以及它们的同类
物。发现不依赖辅酶Bn的甘油脱水酶，将极大地促
进发展一个经济的、不依赖辅酶B，：的并可利用再生
资源来合成l，3。鞫的生物过程。
2．2在1，3．PD生产菌株和甘油生产菌株中构建利
用葡萄糖合成l，3．PD的基因工程菌C删瞄1穰王硒融若23‘等将趸。黼8班黝强泌编码
甘油歧化所需酶的基因，转入了产甘油的酿酒酵母
&c玩rom删s∞删妇池中。研究发现利用该真核工
程蘸将葡萄糖转化为l，3+转是非常豳难昀，C粼艘．
on等人所构建的工程菌．s．∞聊蠡池YP}1500，在以葡
萄糖为底物发酵48h后，虽然相关的酶得以表达，
但是活性毒基常低并且没鸯检测到l，3一糟。对予在
K．pM姗on妇，G．6m俩c“m等1，3．PD生产菌株中表
达甘油合成基因的研究思路，虽然Biebl等人⋯提出
了既方案的可行性，但还没有迸一步研究报道。
2．3在E．co如中表达妣调节子调控的基因
sp嫩lger[12]和Ton一矧分别将甘油歧化途径中编
码GD融和蕊D程酶的基因转入到了蟊。耐i中，
GDHt和PDOR得以成功表达，但是酶活性比较低，
l，3．翔的最终发酵质量浓度只有6．5∥L。Sk曲啪3
将蹴B和蹴T构建在网一个操纵子中，妣B程
砒T由同一个启动子控制。该操纵子含有特异酶
切位点，从丽使于置换窟动子或者进行其他修饰，适
于不同的宿主。含有该操纵子的嚣．∞菇AGl在甘
油和葡萄糖的混合底物发酵过程中，l，3．m发酵终
笈量浓度为6。33∥己，结果也不理想。
周文广等人滔]从克氏肺炎杆菌中成功提取了
l，3．PD氧化还原酶基因妣T，并将其在大肠杆菌中
进行克隆穰表达，褥到了与天然纯l，3．鼬氧化还原
酶相同的产物蛋白。迟乃玉等人瞄]则克隆了巴氏
梭菌中编码l，3一PD氧化还原酶的妣T，并完成了
抵T基因{荑||序、表达载体构建稀在霪。∞磊中表达
的工作。张晓梅等人∞3从大肠杆菌中扩增出编码
l，3．丙二醇氧化还原酶同工酶的基因融D，再将含
甘油脱水酶基因执B和含l，3。丙二醇氧化还原酶
同工酶基因础D的重组质粒共转化大肠杆菌
臌l鹕褥到重组大肠杆菌JMl09(puCtac一蠢酝B，
pEtac一励D)，该菌株在好氧条件下，以1．Ommol鹰
IPl’G诱导可将50g／L甘油转化为38．1g／L1，3一丙二
醇。
2．4在E．∞菇中构建利用葡萄糖合成l。3．PD的基
因工程菌
墨兹构造成功基因工程菌株采用了此方案。
DuPont公闭和Geneneor公司合作，已经获得能够将
葡萄糖转化为1，3．PD的基因工程菌株，并已经完成
中试实验。&‰￡的基因工程蒽拣是建立在互。碱
K12的基础上的汹】。层．c0魔K12本身只有很弱的产
生甘油的能力，没有合成1，3．PD的能力，因此基因
工程菌主要依赖予外来的碳源代谢途径，该途径碳
源从DHAP转到l，3．PD的途径，D姒P是碳源代谢
的主要的节点。
该碳源代谢途径穰嗣从s。扰赫泌中褥至l的
3磷酸甘油脱氢酶和3一磷酸甘油磷酸酶来合成甘
油，利用从K．p删妇中获碍的甘油脱水酶
(抛Bl，谶口B2，蹴糙)帮其复活因子(蹴BX，
o掇)将甘油转化为3。HPA，利用一个大肠杆菌中以
前未确定的氧化还服酶嫩D褥不是l，3。pD氧化
还原酶磁靠T完成了整个途径，基因工程菌的示意
万方数据
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生物加工过程 第4卷第2期
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ll：i鏊蠢薹薹!垂黧薹!篓开始进行转化，一边冉继续培养。该转化
工艺忽视了后盼段——转化反应阶段介质体系的优
化问题 。
当前，有一种很具吸引力的取代生长细胞进行
微生物转化技术，郄应用细胞悬浮法又称置换培养
或静息细胞培养(replacementorrestingcellculture)，
它将微生物的生长培养同生物转化严格地分开进
行。邵徽生物酶菌丝缨胞借助二级发酵臻莽程序产
生，然后通过采用过滤或离心的方法收获细胞物，细
胞物彻底洗涤，然后悬浮在合适的缓冲液介质
中陵o。通常可将细胞物浓度较生长塘养阶段增高2
～3倍。然后投加底物进行非生长细胞悬浮培养的
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