全 文 ：Mar．2008
·48-
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第2期
2008年3月
产S．酰胺酶培养基统计学筛选与响应面优化
王宝峰，郑裕国，沈寅初
(浙江工业大学 生物2--程研究所，杭州310014)
摘要：利用DesignExpea软件中的两水平实验设计和响应面法，对发酵生产5-酰胺酶(可用于拆分2，2-二甲基环
丙甲酰胺外消旋体)的培养基进行了优化。采用Plackett．Burman(PB)设计对培养基中相关影响因素的效应进行评
价并筛选出了有显著效应的葡萄糖、酵母粉及2，2一二甲基环丙甲酰胺浓度，其他因素对酰胺酶产量的影响不显著。
然后用旋转中心组和实验设计及响应面分析确定了主要影响因素的最佳条件，在优化的培养基中，酰胺酶产量达
到168U／L。比优化前的80U／L提高了llO．O％。
关键词：2，2一二甲基环丙甲酰胺；Plaekett-Burman设计；旋转中心组和设计(CCRD)；响应面法(RSM)
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0048—05
Optimizationofmediumco ponentsforS—amidaseproduction
usingresponsesurfacemethodology
WANGBao—feng，ZHENGYu—guo，SHENYin—chu
(InstituteofBioengineering，ZhejiangUnivers tyofTechnology，Hangzhou310014，China)
Abstract：Theferm ntationmediumforamidaseproductionforki eticresolutionof2。2-dimethyl．cyclo．
propanecarboxamidewasoptimizedusingDesignExpertsoftwarecombinedwiththePlackett-Burman
designa dResponseSurfaceMethodology．Firstly，aPlackett—Burmandesignw susedtoevaluatethe
influenceofrelatedfactors．rI}leesultsshowedthatglucose，yeast，2，2-dimethylcyclo-propanecarbox-
amidew rethemainaffectingfactorswhiletheotheradditiveshadnosignificanteffectontheamidase
production．ThentheCentralCompositeRo atableDesignandresponsesurfacenalysiswereusedto
determinetheoptimizelevelsofthemainfactors．Byolvingtheregressionequationandalsobyanaly—
zingtheresponsesurfacecontourplots，theoptimalprocessconditionsweredetermined：undercondi-
tionsofglucose15．8s／L，yeast17．89s／L，2，2-dimethylcyclopropane—carboxamide3．47g／L，the
predictionofenzymeactivityofamidasewas163．098U／L．Thesepr dictedvalueswerealsoverifiedby
validationexperiment．Underheoptimalconditions．theenzymeactivityncreasedby110．O％from
80IJ／L．to】68I，／I。
Keywords：2，2-dimethylcyclopropanecarboxamide；Plackett-Burmandesign；CentraCompositeno at·
ableDesign(CCRD)；ResponseSurfaceMethodology(RSM)
收稿日期：2007-09-27
基金项目：国家973计划课题资助项目(2003CB716005)；国家863计划课题资助项目(2006AA022241)
作者简介：王宝峰(1981一)，男，河北高ItaA．，硕士研究生。研究方向：生物转化。
联系人：郑裕国，教授，博士生导师，E-mail：zhengyg@zjut．edu．ell
万方数据
2008年3月 王宝峰等：产s．酰胺酶培养基统计学筛选与响应面优化 ·49·
光学纯S-2，2一二甲基环丙甲酸是西司他
丁¨。1列合成的关键手性中间体，因此，提高动力学
拆分外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺S一立体选择性
酰胺酶的活力显得尤为重要。本实验室筛选保藏
的芽孢杆菌Bacillussp．DBl2，能选择性水解外消旋
(尺，．s)-2，2一二甲基环丙甲酰胺的s-单体制备S-2，2．
二甲基环丙甲酸。反应过程如下式：
X—X，+X＼ ＼ 。7，／，，
CONH2 COOH ’CONH2
国内外已有一些涉及拆分(R，S)-2，2-二甲基环丙甲
酰胺消旋体机理和应用方面的研究【4“J，但生产工
艺研究较少。本文对实验室保藏的对(R，S)-2，2-二
甲基环丙甲酰胺有高效转化能力的微生物菌株芽
孢杆菌Bacillussp．DBl2发酵生产s一酰胺酶的条件
进行研究，采用Plackett—Burman(PB)设计"．1们和
旋转中心组和实验设计¨1-12]对其培养基进行优化，
为S-2，2一二甲基环丙甲酸生产打下基础。
1材料与方法
1．1化学试剂与主要仪器
(R，S)-2，2-二甲基环丙甲酰胺购自上海吉泰科
技有限公司。气相色谱仪GC-14C，日本岛津；高压
蒸汽灭菌锅mLS-3780，日本三洋；回转式恒温调速
摇瓶柜DKY-1，上海杜科自动化设备有限公司；生化
培养箱250B，常州国华电器有限公司；高速离心机
X-22Centrifuge，美国BeckmanCoulter；全波长分光
光度计DU-800，美国BeckmanCoultero
1．2菌种
芽孢杆菌Bacillussp．DBl2，该菌由本实验室
从土壤中筛选得到。保藏于中国典型培养物保藏
中心，菌种保藏号为CCTCCM207139。
1．3培养基
斜面培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
原始产酶培养基葡萄糖10g／L，酵母浸出粉
13g／L，KH2P04l g／L，K2HP041 g／L，NaCl1 g／L，
MgS04·7H2O0．2g／L，FeS04·7H2O0．03g／L，
2，2一二甲基环丙甲酰胺1．5g／L，pH7．0。
1．4菌体培养
斜面培养30℃培养24h。
种子培养从培养好的斜面中，挑取一环接入
装有40mL培养基的250mL的三角瓶中，30℃，
150r／min，培养20h。
1．5酰胺酶活力的测定
酰胺水解活性酶活定义：35℃下，每分钟催化
1 p。mol的(R，5)-2，2一二甲基环丙甲酰胺生成相应
的S-2，2一二甲基环丙甲酸所需的酶量定义为一个酶
活力单位。
1．6分析方法
反应液中酰胺和酸的含量由气相色谱法测定。
气相色谱型号为GC．14C(Shimadzu，Japan)，所用毛
细管柱型号为UA-5(FrontierLab，Japan)，进样口和
检测器的温度均为220oC，柱温140℃。载气为氮
气，流速1．5mL／min。酸和酰胺的保留时间分别为
2．3min和2．9min。
2实验结果与讨论
2．1全因子实验设计结果
实验采用N=12Plackett-Burman实验设计对
影响产酰胺酶的8个因素(其中诱导剂为2，2一二甲
基环丙甲酰胺)进行了研究。8个考察因素及其代
码、编码水平见表1，其实验设计与结果见表2，借助
实验设计软件DesignExpert(Design—Expertversion
7．1softwarefoexperimentdesign)进行数据分析，其
结果如表3所示。
表1 全因子实验设计因子编码水平与取值表
Table1 Codelevelandvaluesoffullfactorsexperimentdesign g·L一1
万方数据
．50． 生物加工过程 第6卷第2期
表2全因子实验设计与结果
Table2 Thefullfactorialdesignandresult
实验号 葡萄糖 酵母粉 诱导剂 NaCI K2I-IeO,FeS04MgS04KH2P04酶活／(U·L。1)
表3全因子实验因子变量分析结果
Table3 Theanalyticresultofvariableofthefullfactorialdesign
变异源 平方和 自由度 均方 F值P值(Prob>F)
Model
葡萄糖
酵母粉
诱导剂
NaCI
l(2HP04
FeS04
MsS04
KH2P04
误差项
误差项
误差项
曲率
误差
3849．1900
2122．680O
1045．3330
406．0033
6．750O
122．8800
6．453
32．670O
75．000O
O．0033
0．0533
3I．3633
2．9227
16．3120
349．9264
2122．6800
1045．3330
406．0033
6．7500
122．8800
6．453
32．6700
75．000O
O．003
0．053
31．3633
2．9227
4．0780
85．8083
520．5199
256．3348
99．5594
1．6552
30．1324
1．5825
8．0113
18．3914
O．Ooo8
0．0131
7．6908
0．7167
0．0003
<0．0001
O．267
0．0054
0．2768
0．0473
0．0128
O．9786
0．9145
O．0502
0．4449
显著性
不显著
总和 3868．4250 16
l
1
1
1
1
1
1
l
1
1
1
l
1
4
万方数据
2008年3月 王宝峰等：产S一酰胺酶培养基统计学筛选与响应面优化 ·51·
通过Designexpert软件对实验数据进行分析，
获得多元一次回归方程：Rl=-73．4944+6．65A+
3．1ll111B+11．63333C+ ．75D+10．6667E+
73．333F+16．5G+8．333333H+0．016667J一
0．06667K+1．616667L
式中：R，为酶活的预测值；A，B，C，D，E，F，G，日分别
为葡萄糖、酵母粉、诱导剂、NaCl、K：HPO。、FeSO。、
MgS04、KH2P04的真实值；．，，K，￡分别为误差项。
由表3可知，回归模型P=0．0003< ．05说明
该模型显著。各因素显著性按从大到小的顺序为
葡萄糖、酵母粉、诱导剂、K2HPO。、KH2P04、MgS04、
NaCl、FeSO。；而葡萄糖(P<0．0001)、酵母粉(P<
0．0001)、诱导剂(P=0．0006)是主要影响因子
(P
酵母粉、诱导剂为主要因素进行以下实验。
2．2响应曲面(RSM)实验设计与分析
本阶段实验辅助软件为DesignExpert软件。实
际考察的变量及其实验水平编码见表4，采用多元
回归技术，采用旋转中心组合设计(CentralCompos—
iteRotatableDesign，CCRD)法，拟合二次多项模型
的设计。
表4旋转中心组合设计实验因素水平及其编码
TableLevelandcodeofvariableschosenforCCD
编码值与真实值之间的关系为：X。=(茗。一
14)／4，X2=(菇2—19)／3，X3=(墨一3)／1．5
通过Designexpert软件对实验数据进行二次多
项回归拟合，获得酶活对葡萄糖、酵母粉，诱导剂的
真实值二次多项式回归方程为R2=一499．13+
51．26439xl+34．57162x2—30．0456x3—0．99792
髫1茗2+1．354167戈l菇3+2．183333x2髫3—1．20566x：一
0．73704x；一4．38596x；式中尺：为酶活的预测值。
该二次回归方程及其各项的方差分析结果见表5。
表5二次多项模型及其各项的方差分析
Table5 Analysisofvariance(ANOVA)forthefittedquadraticpolynomialmodel
万方数据
· 52· 生物加工过程 第6卷第2期
由该方程的方差分析(表5)可见，该模型极显
著(p
拟合度，方程与实际情况比较相符，并能做出相对
准确的预测。
如果模型中项P<0．05，则说明模型中项的影
响是显著的。回归方程各项的方差分析表明，葡萄
糖和诱导剂对酶活的线性效应皆显著，而酵母粉对
酶活的线性影响不显著(P=0．0635>0．05)，且葡
萄糖和酵母粉对酶活的交互作用极显著(P<
0．0001)，酵母粉和诱导剂对酶活的交互作用也极
显著(p<0．0001)，而葡萄糖和诱导剂的交互作用
(p=0．0003< ．05)小于上述交互作用，但也是显
著的。
2．3 酶活最佳值的获取与验证
为了确证各因素的最佳点，对已回归的非线性
模型方程求一阶偏导，并令其等于零，可以得到曲
面的最大点，求导方程整理求解得髫，=15．8，菇：=
17．89，戈，=3．47。求得最适质量浓度分别为：葡萄
糖15．8g／L、酵母粉17．89∥L、诱导剂3．47g／L，酶
活R=163．098U／L。
为了检验模型预测的准确性，在最佳发酵条件
进行发酵试验，所得发酵液酶活为168U／L，可见该
模型能较好地预测实际产酶情况。
3结论
在葡萄糖为15．8g／L、酵母粉17．89g／L、诱导
剂为3．47g／L时最大预测值为163．098U／L，即为
实验优化值。通过验证酶活达到168U／L，比优化
前的80U／L提高了110．0％。
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