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万方数据
·44· 生物加工过程 第4卷第2期
DH5a菌株，利用，17引物PCR鉴定重组质粒。阳性
克隆测序结果所报道的序列一致。
Lane1：pErr-22b(+)一xylA／魄ZⅡ；
L毗1eMarker：DNAMarkerDL2000
L棚el：PCRpIoduct，【加eMarker：DNAMarI，erDL2000 图3 表达重组子pⅡ：22b(+)一xvn的酶切鉴定
图1 葡萄糖异构酶基因(彬)PCR扩增产物 Fig．3纠Ⅱdigest0frecombinantplasrnidp口22b(+)．xyn
Fig．1PCRproductof夥伪gene
2．2表达重组子的构建、筛选与鉴定
从质粒T．vector-姗A上PCR扩增基因础，用限
制性内切酶舭工和№I双酶切基因础和载体
pET。22b(+)，回收结果如图2所示，回收后将酶切过
的目的基因及pET一22b(+)载体连接，然后转化到大
肠杆菌DH5a感受态细胞。提取质粒，经限制性内切
酶喇Ⅱ酶切，电泳结果见图3。结果表明外源片段已
经连接到表达载体上。质粒构建图如图4。
2．3外源基因(菇似)表达产物的分析
取诱导7h后的菌液离心，超声破碎，获取粗酶液
进行sDS。PAGE电泳。与未插入基因的空载体p肌22b
(+)相比，在44如处有特异性表达蛋白条带。
图4表达重组质粒构建图
Fig．4Physical瑚pofI呦mbjnantplasfnidpⅡ二22b(+)一x舭
2．4表达条件的初步优化
2．4．1诱导剂IPllG量的优化
‰1：PCR肿ducti。n；I蛐e2：p肌22b(+)／毗工+№I；在30℃诱导培养7h的情况下，考察不同IPI℃
Lan。M。rke，：DNAM。rke。DL2000 终浓度对重组菌诱导表达的影响。结果如图6所
图2阳-眭克隆(T-vector-班)和p肌22b(+)双酶切示，诱导剂Im终浓度在o．9mol／L和1．5I砌ol／L
Fig．2眺工andⅣo￡工digestof‰PCRpIDduction 间重组菌比酶活迅速升高，然后趋于平缓，在IPllG
fromPositiVeT-Vector肌dpET二22b(+) 终浓度为2．4r砌01／L时比酶活最高为17．774u／1119，
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