全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １３ Ｎｏ ６
Ｎｏｖ ２０１５
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１５ ０６ ００１
收稿日期：２０１４－０７－１４
基金项目：国家固态酿造工程技术研究中心开放课题（ＧＣＫＦ２０１１１２）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２２３０４）
作者简介：徐 晴（１９８３—），女，江苏苏州人，助理研究员，硕士，研究方向：微生物代谢调控；李 霜（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｓｈｕａｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
响应曲面优化秸秆稀酸水解工艺用于发酵产壳聚糖
徐 晴１，袁 瀚２，杨 平２，周 军２，李 霜１
（１ 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００；
２ 国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 ６４６０００）
摘 要：为实现利用秸秆水解产生的五碳糖发酵产壳聚糖，以米根霉为研究对象，研究水解温度、水解时间、酸浓度
等不同预处理方式获得的半纤维素水解液对米根霉发酵产壳聚糖的影响。 结果表明：水解温度、水解时间对水解
液中木糖含量以及甲酸、乙酸、糠醛等抑制剂浓度具有显著影响，并进一步影响后续发酵产壳聚糖的生成量。 利用
响应曲面对稀酸水解预处理条件进行优化，获得最佳工艺条件：Ｈ２ＳＯ４ １３ ６ ｇ ／ Ｌ，９９ ５ ℃，水解时间 １ ９１ ｈ，在此条
件下预测壳聚糖发酵产量为 ０ ７９ ｇ ／ Ｌ，实验验证产量为 ０ ８２ ｇ ／ Ｌ，占菌体生物量的 １５％～１８％。 研究结果为秸秆资
源的高效利用及发酵生产壳聚糖提供新思路。
关键词：米根霉；半纤维素；木糖；壳聚糖；抑制剂
中图分类号：ＴＱ３５２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－０００１－０５
Ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ ｆｏｒ
ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ＸＵ Ｑｉｎｇ１，ＹＵＡＮ Ｈａｎ２，ＹＡＮＧ Ｐｉｎｇ２，ＺＨＯＵ Ｊｕｎ２，ＬＩ Ｓｈｕａｎｇ１
（１ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ⁃Ｓｔａｔｅ Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｌｕｚｈｏｕ ６４６０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＨＨ） ｆｏｒ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ／ ｏｒ ｌｏｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ，ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ｆｕｒｆｕｒａｌ），ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｉｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ），ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｆｏｒ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ９９ ５ ℃，Ｈ２ＳＯ４ １３ ６ ｇ ／ Ｌ，１ ９１ ｈ．
Ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ０ ８２ ｇ ／ Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔ
ｖａｌｕｅ ｏｆ ｍｏｄｅｌ （０ ７９ ｇ ／ Ｌ），ａｎｄ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ １５％⁃１８％ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｕｔｅ ｆｏｒ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ；ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓ；ｘｙｌｏｓｅ；ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
木质纤维素是地球上储量最丰富的生物质可
再生资源，广泛来源于农林废弃物（如玉米秸秆、酒
糟、废木屑等），它主要由纤维素、半纤维素和木质
素组成，其中半纤维素组分约占 ２０％ ～ ３５％［１］。 利
用稀酸水解法对木质纤维素进行预处理，不仅能降
解半纤维素组分，还为后续酶解反应提供了较为疏
松的底物结构，提高酶解效果。 半纤维素组分的水
解产物主要以木糖为主，水解过程中伴生的甲酸、
乙酸、糠醛等副产物对多数微生物具有强抑制作
用，限制了酸解产物的生物利用［２］。
壳聚糖广泛存在于甲壳类动物外骨骼和真菌
细胞壁，是一种高附加值的聚合物，具有良好的生
物可降解性、生物相容性，被广泛应用于化工、医药
等行业［３］。 利用根霉属、毛霉属等真菌发酵法制备
的壳聚糖脱乙酰度较高，具有很高的应用价值，是
壳聚糖产业的重要发展方向之一［４］。 窦畅等［５］在
前期研究中发现米根霉能高效利用木糖积累生物
量，尤其利用秸秆酸解所产的木糖组分时，细胞壁
中壳聚糖含量较高，且酸液中的甲酸、糠醛等“抑制
物”在一定浓度下有利于壳聚糖的积累［６］，因此秸
秆酸解液有望成为优良的壳聚糖发酵原料。
笔者利用响应曲面设计优化半纤维素的酸解
预处理工艺，建立秸秆酸解条件与米根霉发酵生产
壳聚糖的直接关系，以获取最适宜于壳聚糖发酵的
秸秆酸解预处理工艺。
１ 材料与方法
１ １ 菌株
菌种为米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＭＥ Ｆ１２），南京
工业大学代谢工程实验室保藏。
１ ２ 玉米秸秆的酸解处理
将玉米秸秆研磨至粒径不超过 １ ｍｍ 的颗粒，
按固液比为 １ ∶ １０（ｇ ／ ｍＬ）加不同浓度 Ｈ２ＳＯ４ 进行酸
解反应，然后加 Ｃａ（ＯＨ） ２调节 ｐＨ 至 ８ ０，过滤后得
到的清液即为半纤维素水解液。 考察水解温度
（Ｘ１，℃）、Ｈ２ＳＯ４ 质量浓度 （Ｘ２， ｇ ／ Ｌ）和水解时间
（Ｘ３，ｈ）３个因素对酸解效果的影响，以发酵壳聚糖
产量（Ｙ１，ｇ ／ Ｌ）为响应指标，利用 ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ
ｐａｃｋａｇｅ（Ｓｔａｔ⁃Ｅａｓｅ Ｉｎｃ ，ＵＳＡ）软件进行中心复合设
计（ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ，ＣＣＤ），实验条件如表 １
所示，每组实验采用 ３个平行后取均值进行 ＣＣＤ数
据分析。
１ ３ 培养条件
将在 ３５ ℃培养 ６ ｄ 的米根霉用无菌水洗脱孢
子，获得孢子悬浮液，按 ２％（体积分数）的接种量将
孢子悬浮液接种至发酵培养基中。 发酵培养基组成：
秸秆酸水解液 ５０ ｍＬ，ＫＨ２ＰＯ４ ０ ６ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０ ５ ｇ ／ Ｌ，尿素 ２ ｇ ／ Ｌ。 ｐＨ 自然。 在 ３５ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
条件下培养。
表 １ 酸水解条件响应面设计
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎｓ ｆｏｒ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
实
验
号
变量 编码水平
Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３
温度
ｘ１
Ｈ２ＳＯ４
浓度 ｘ２
反应
时间 ｘ３
１ ８０ １０ １ －１ －１ －１
２ ８０ １０ ３ －１ －１ １
３ ８０ ３０ １ －１ １ －１
４ ８０ ３０ ３ －１ １ １
５ １２０ １０ １ １ －１ －１
６ １２０ １０ ３ １ －１ １
７ １２０ ３０ １ １ １ －１
８ １２０ ３０ ３ １ １ １
９ ６６ ２０ ２ －１ ６８ ０ ０
１０ １３４ ２０ ２ １ ６８ ０ ０
１１ １００ ０ ３２ ２ ０ －１ ６８ ０
１２ １００ ３ ６８ ２ ０ １ ６８ ０
１３ １００ ２０ ０ ３２ ０ ０ －１ ６８
１４ １００ ２０ ３ ６８ ０ ０ １ ６８
１５ １００ ２０ ２ ０ ０ ０
１６ １００ ２０ ２ ０ ０ ０
１ ４ 壳聚糖提取
壳聚糖的分析参照文献［７］的方法。 摇瓶培养
获得的菌体经过滤、烘干，加入 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ，使菌
体含量达 ２５ ｇ ／ Ｌ，１２１ ℃处理 １５ ｍｉｎ，冷却，１０ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心，获得碱不溶物，洗涤至中性。 加入 １００
倍体积的 ２％ （体积分数）的乙酸，９５ ℃ 下水解
２４ ｈ，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心，上清用 ＮａＯＨ 调 ｐＨ 至
９ ０，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心，水洗后分别再用乙醇、丙酮
洗涤，获得壳聚糖。
１ ５ 酸解液组分的测定
秸秆酸解液组分测定参照文献［８］的方法，具
体测定条件：戴安 Ｐ６８０，Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ工作站，Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ
Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ 色谱柱 （ ３００ ｍｍ × ７ ８ ｍｍ， ９
μｍ）；流动相 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４；流速 ０ ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ；柱
温 ６０ ℃。 甲酸、乙酸采用 ＲＩＤ 检测器检测，糠醛采
用紫外检测器检测，波长为 ２１０ ｎｍ。
２ 结果与讨论
２ １ 预处理条件对秸秆酸解液成分的影响
根据响应面设计（表 １）的方法，对不同酸解条
２ 生 物 加 工 过 程 第 １３卷
件下的组分进行测定，结果如表 ２ 所示。 由表 ２ 可
知：水解液中的主要成分是木糖为 ８ ２４ ～ ２５ ２４
ｇ ／ Ｌ，其次是葡萄糖（０ ７７ ～ ５ ３４ ｇ ／ Ｌ）和阿拉伯糖
（２ ０２～ ４ ７６ ｇ ／ Ｌ）。 水解液中主要的抑制物为甲
酸、乙酸、糠醛。
较高的水解温度和较长的水解时间对糖的降解
释放和抑制物的产生均具有一定的促进作用。 使用
１０ ｇ ／ Ｌ的 Ｈ２ＳＯ４，１２０ ℃水解 ３ ｈ（第 ６组实验），得到
的木糖质量浓度最大，为 ２５ ２４ ｇ ／ Ｌ；而当温度为 ８０
℃水解 ３ ｈ（第 ２ 组实验），木糖质量浓度仅为 １０ ７５
ｇ ／ Ｌ；当 Ｈ２ＳＯ４ 为 ３０ ｇ ／ Ｌ，１２０ ℃水解 ３ ｈ（第 ８ 组实
验），糠醛质量浓度达最大值，为 ２ ７９ ｇ ／ Ｌ，而当水解
时间缩短为 １ ｈ（第 ７组实验），糠醛为 １ ４３ ｇ ／ Ｌ。
表 ２ 水解条件下对产物组成的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ
ｇ·Ｌ－１
序号 ρ（葡萄糖）
ρ（木
糖）
ρ（阿
拉伯糖）
ρ（甲
酸）
ρ（乙
酸）
ρ（糠
醛）
１ ０ ７７ ８ ４３ ２ ０２ ０ ４６ ０ ９６ ０ ０１
２ １ ３８ １０ ７５ ３ １９ ０ ７６ １ ８８ ０ ０３
３ １ １６ ９ ２１ ２ ７３ ０ ９７６ １ ３７ ０ ４１
４ １ ２９ １０ １２ ２ ９４ ０ ７９ １ ９３ ０ ５２
５ ２ ２５ １９ ８８ ３ ０４ １ ２４ ２ ４７ ０ ９４
６ ５ ３４ ２５ ２４ ２ ８０ １ ５９ ２ ８８ １ ６９
７ １ ３６ ２０ ２６ ２ ７５ １ ７８ ２ ９８ １ ４３
８ ２ ６６ ２３ ５７ ３ １８ １ ９５ ３ ２１ ２ ７９
９ ２ ９３ ８ ２４ ２ ９２ ０ １７ １ ２６ ０ １２
１０ ４ ２２ ２４ ３２ ２ ７１ １ ７２ ２ ８２ １ ８６
１１ ３ ６１ １６ ５４ ４ ３１ ０ ２０ １ ８７ ０ ３２
１２ ３ ９８ １７ ６６ ４ ７６ ２ ３１ ２ ７３ ０ ７７
１３ ２ ６４ ９ ８９ ３ ４４ ０ ３４ １ ８２ ０ ２４
１４ ４ １８ ２２ ３５ ３ ０５ １ ５６ ２ ６８ ０ ８３
１５ ２ ９１ ２２ ４３ ３ ４６ ０ ８３ ２ １７ ０ ５８
１６ ２ ８７ ２１ ５４ ３ ３７ ０ ９１ ２ ３２ ０ ６６
２ ２ 以壳聚糖产量为指标的响应面分析
以不同条件下预处理后获得的秸秆酸水解液
作为碳源，配制培养基用于米根霉发酵制备壳聚
糖，结果如图 １所示。 由图 １可知：酸解液中木糖浓
度高并不意味着壳聚糖产量高，在高木糖浓度（第
６～８组实验，木糖为 ２０ ２６ ～ ２５ ２４ ｇ ／ Ｌ）下，壳聚糖
产量相对较低，仅为 ０ ２５ ｇ ／ Ｌ左右。 壳聚糖的最高
产量（０ ６７ ｇ ／ Ｌ）出现在第 １１组，该酸解液中木糖含
量并不高，为 １６ ３２ ｇ ／ Ｌ。 真核微生物的细胞壁在受
到外界刺激时，会改变多糖等组分以更好地适应环
境［９］。 当一定浓度的甲酸、乙酸、糠醛存在时，米根
霉可能通过合成更多壳聚糖等大分子聚合物增厚
细胞壁，抵御抑制剂对细胞产生的危害。 在第 ６ ～ ８
组实验中，抑制剂甲酸、乙酸、糠醛质量浓度较高
（１～３ ｇ ／ Ｌ），抑制剂的大量存在对微生物细胞产生
了毒害作用，如甲酸会破坏细胞上的疏水位点［１０］，
从而影响了菌体生长和壳聚糖的合成；而第 １１组抑
制剂组分含量有显著下降，其浓度恰好与之前研究
的有效刺激浓度相符合［６］。 因此，仅以木糖浓度为
指标优化秸秆酸解过程用于后续发酵是不合适的。
水解过程中，抑制剂浓度的变化对后续菌体生长与
壳聚糖合成的影响要大于一定范围内糖浓度变化
带来的影响，因此，优化半纤维素水解用于后续发
酵要更多关注抑制剂的生成情况。
图 １ 半纤维素水解液培养基中米根霉菌体
生物量及壳聚糖产量
Ｆｉｇ １ Ｍｙｃｅｌｉａ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
为了获取最佳的秸秆酸解工艺，以壳聚糖的产
量为响应指标，对各预处理条件下的实验结果进行
多元回归拟合，构建响应面模型，得到壳聚糖产量
对水解温度（Ｘ１，℃）、Ｈ２ＳＯ４ 浓度（Ｘ２，ｇ ／ Ｌ）和水解
时间（Ｘ３，ｈ）的二次多项回归模型，见式（１）。
Ｙ１ ＝ ０ ５７６ ２５９ － ０ ０１３ ４１３Ｘ１ － ０ ０６０ ５４２Ｘ２ ＋
０ ００５ ５２５Ｘ３ － ０ ００５Ｘ１Ｘ２ － ０ ０２５Ｘ１Ｘ３ ＋
０ ０２３Ｘ２Ｘ３ － ０ １５１ ０１３Ｘ１ ２ － ０ ０４８ ４８２Ｘ２２ －
０ ０５０ ２５Ｘ２３ （１）
该回归方程 Ｒ２为 ０ ９３２ ６，表明该模型具有良好
的拟合度，可以用来解释 ９３ ３％的响应值变化，各因
子与壳聚糖产率之间存在着较好的线性关系。 水解
温度、Ｈ２ＳＯ４ 浓度和水解时间对壳聚糖产量影响的显
３ 第 ６期 徐 晴等：响应曲面优化秸秆稀酸水解工艺用于发酵产壳聚糖
著性分析如表 ３ 所示。 当置信度为 ９５％时 （α ＝
０ ０５），Ｘ２１对壳聚糖产量有显著性影响（Ｐ＜０ ０５），保
留一次方项 Ｘ１。 当置信度 ９０％（α＝ ０ １０），Ｘ２对壳聚
糖产量亦存在显著性影响（Ｐ＜０ １０）。 因此，可以判
断三因素对壳聚糖产量的影响（从大到小顺序）为
Ｈ２ＳＯ４ 浓度、水解温度、水解时间。
表 ３ 三因素对壳聚糖产量影响的显著性分析
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
因素 均方和 Ｆ 值 Ｐ值
Ｘ１ ０ ００２ ４ ０ ２４５ ６ ０ ６３７ ８
Ｘ２ ０ ０５０ ０ ５ ００４ ５ ０ ０６６ ６
Ｘ３ ０ ０００ ４ ０ ０４１ ７ ０ ８４５ ０
Ｘ１Ｘ２ ０ ０００ ２ ０ ０２０ ０ ０ ８９２ ２
Ｘ１Ｘ３ ０ ００５ ０ ０ ４９９ ８ ０ ５０６ １
Ｘ２Ｘ３ ０ ００３ ２ ０ ３７６ ８ ０ ５５８ ２
Ｘ２１ ０ ２１１ ３ ２１ １２１ ７ ＜０ ０００ １
Ｘ２２ ０ ０２１ ８ ２ １７７ ０ ０ １９０ ５
Ｘ２３ ０ ０２３ ４ ２ ３３８ ７ ０ １７７ １
注： Ｒ２ ＝ ０ ９３２ ６； ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｒ２ ＝ ０ ８２４ １。
此外，１６组实验所生成的响应面如图 ２、图 ３ 所
示，壳聚糖生成量以图中颜色深浅来区分，颜色越
深，壳聚糖浓度越高。 由图 ２和图 ３可知，壳聚糖产
量对于所考察的 ３个因素的变化趋势是一致的。 随
着水解温度、Ｈ２ＳＯ４ 浓度和水解时间的增长，壳聚糖
产量呈现出先增长后减少的趋势，且壳聚糖产量的
最大值落在笔者通过预实验所选取的中心点附近，
表明响应面设计是成功的。
图 ２ 水解温度和 Ｈ２ＳＯ４ 浓度对壳聚糖产量的影响
Ｆｉｇ ２ Ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ３ 水解温度和时间对壳聚糖产量的影响
Ｆｉｇ ３ Ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２ ３ 半纤维素酸解条件优化
为获得最佳的半纤维素水解条件，求解回归方
程的最大值，得到的结果为 Ｈ２ＳＯ４ １３ ６ ｇ ／ Ｌ，９９ ５
℃水解 １ ９１ ｈ，此时预测获得的壳聚糖产量为 ０ ７９
ｇ ／ Ｌ。 按上述条件对木质纤维素进行酸解，水解液
用于壳聚糖的发酵培养以验证模型的准确性。 实
验结果表明，在此条件下，水解液中木糖含量为
２０ ４５ ｇ ／ Ｌ、乙酸为 １ ４４ ｇ ／ Ｌ、甲酸为 ０ ６１ ｇ ／ Ｌ、糠醛
为 ０ ３１ ｇ ／ Ｌ，而此时发酵所获得的米根霉生物量为
５ ４ ｇ ／ Ｌ，产生的壳聚糖达 ０ ８２ ｇ ／ Ｌ，略高于预测值，
能较好验证模型的准确性。
壳聚糖组分约占丝状真菌生物量的 ７％ ～ １０％
左右。 因此，要获得较高的壳聚糖产量，通常需要
优化培养基或培养方式来提高菌体生物量［１１－１２］，或
者添加刺激物如赤霉素［７］、阿洛酮糖［１３］等来促进细
胞壁中壳聚糖的积累。 以工艺优化的秸秆酸解液
作为壳聚糖发酵生产的培养基料，添加尿素、磷酸
盐等组分，培养后获得的壳聚糖组分占菌体生物量
的 １５％～１８％ ，这表明通过控制酸解工艺条件可以
控制伴生的甲酸、乙酸、糠醛等抑制物组分来有效
促进壳聚糖的合成。
３ 结论
秸秆酸水解工艺的水解温度、水解时间、酸浓
度对木糖及抑制剂（甲酸、乙酸、糠醛等）组分具有
较为显著的影响，其中最利于米根霉发酵生产壳聚
糖的秸秆酸水解工艺参数：１３ ６ ｇ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４ 在 ９９ ５
℃下水解 １ ９１ ｈ。 利用该条件处理获得的秸秆酸解
液进行米根霉发酵生产壳聚糖，产量可达 ０ ８２ ｇ ／ Ｌ，
４ 生 物 加 工 过 程 第 １３卷
与模型预测值相近。 结果表明秸秆酸解液有望成
为壳聚糖发酵生产的重要原料，为秸秆等生物质资
源的利用拓展了思路。
参考文献：
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（责任编辑 荀志金）
５ 第 ６期 徐 晴等：响应曲面优化秸秆稀酸水解工艺用于发酵产壳聚糖