全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ００１
收稿日期：２０１３－０９－１８
基金项目：国家自然科学基金（３０８７１９９２）；江苏省科技支撑计划（ＢＥ２０１０７３２）；江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介：吴　 昊（１９８７—），女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：生物燃料乙醇；宋向阳（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｎｇｙａｎｇｓｏｎｇ＠ ｈｏｔｍａｉｌ􀆰 ｃｏｍ
里氏木霉与米根霉混合固态发酵产纤维素酶
吴　 昊，宋向阳，吴文浩，欧阳嘉，勇　 强
（南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京 ２１００３７）
摘　 要：以里氏木霉及米根霉单菌固态发酵为对象，考察不同混合发酵形式对里氏木霉与米根霉混合固态发酵产
纤维素酶的影响。 结果表明：同时接种里氏木霉与米根霉，试验考察的两菌种接种量比 １ ∶ １（以孢子个数计）及 ５ ∶ １
条件下，两菌未产生明显协同产酶作用。 米根霉延时（２４ ｈ）接种且菌种量比 ５ ∶ １以及米根霉延时（４８ ｈ）接种且菌
种量比１ ∶ １，２种发酵形式产酶情况类似，滤纸酶活（ＦＰＡ）及羧甲基纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ）酶活相对米根霉单菌发酵有
所提高，而 β 葡萄糖苷酶（β ＧＡ）酶活相对里氏木霉单菌固态发酵结束时分别增加 ４􀆰 ６６ 及 ４􀆰 ４０ 倍，可以发现两
菌产生一定协同作用。 在米根霉延时（４８ ｈ）接种且菌种量比 ５ ∶ １的发酵形式下，ＦＰＡ 及 ＣＭＣａｓｅ 在发酵第 ７ 天酶
活分别达到 ４４􀆰 ０４ ＩＵ ／ ｇ、６２７􀆰 １４ Ｕ ／ ｇ（以 １ ｇ干曲计），分别是里氏木霉固态单菌发酵产酶达到稳定期时酶活的 １􀆰 ３６
和 １􀆰 ６３倍，两菌产生了有效的协同作用。
关键词：里氏木霉；米根霉；混合固态发酵；纤维素酶
中图分类号：ＴＳ２０１􀆰 ３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－０００１－０５
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｉｎ ｍｉｘｅｄ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ａｎｄ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｂｙ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＷＵ Ｈａｏ，ＳＯＮＧ Ｘｉａｎｇｙａｎｇ，ＷＵ Ｗｅｎｈａｏ，ＯＵＹＡＮＧ Ｊｉａ，ＹＯＮＧ Ｑｉａｎｇ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉｘｅｄ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ａｎｄ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎｃｌｕｄｅ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ． ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｇｉ （ｓｐｏｒｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）． Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｎｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ ｏｒ
Ｒ． ｏｒｙｚａｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｓｙｎｅｒｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｆｕｎｇｉ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｈｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ
ｍｉｘｅｄ ｆｕｎｇｉ ａｔ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ １ ∶ １ （ｓｐｏｒｅｓ） ａｎｄ ５ ∶ １ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｒ． ｏｒｙｚａｅ ｆｏｒ ２４ ｈ ａｔ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｒａｔｉｏ ｏｆ ５ ∶ １ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｓｉｍｉｌａｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｅｌａｙｉｎｇ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｆｏｒ ４８ ｈ ａｔ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｒａｔｉｏ ｏｆ １ ∶ １． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ＦＰＡ） ａｎｄ ＣＭＣａｓｅ
ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｍｏｎｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ． ｏｒｙｚａｅ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ （β⁃ＧＡ）
ｒａｉｓｅｄ ａｂｏｕｔ ４􀆰 ６６ ａｎｄ ４􀆰 ４０ ｔｉｍｅｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ．
Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｔｈｅ ｓｙｎｅｒｇｙ ｗａｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｆｕｎｇｉ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ． ｏｒｙｚａｅ．
Ｗｈｅｎ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ． ｏｒｙｚａｅ ｆｏｒ ４８ ｈ ａｔ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｒａｔｉｏ ｏｆ ５ ∶ １， ＦＰＡ ａｎｄ ＣＭＣａｓｅ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ
４４􀆰 ０４ ＩＵ ／ ｇｒａｍ ｄｒｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ， ６２７􀆰 １４ Ｕ ／ ｇ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ １􀆰 ３６ ａｎｄ １􀆰 ６３ ｔｉｍｅｓ ａｓ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｍｏｎｏ⁃
ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｌｓｏ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｎｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｒ． ｏｒｙｚａｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ；ｍｉｘｅｄ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
　 　 纤维素酶的制备技术是全球性的研究热点之
一，提高纤维素酶产量和活性一直是核心问题所
在。 采用单菌产纤维素酶再用酶降解纤维素的工
艺，由于存在酶系不完整和个别酶活不高的缺陷，
在实践中被证明有很大的局限性。 纤维素的降解
需要 ３ 种酶系协同作用。 因此，利用混合菌发酵
技术提高纤维素酶酶活的研究日益成为一个重要
的发展方向。 产纤维素酶真菌混合发酵的微生态
原理主要有 ３ 点［１－３］ ：①减弱酶的反馈抑制作用；
②酶系互补；③互利共生。 目前，国内外对混合发
酵菌种研究较多的是木霉、青霉和曲霉［４－９］ 。 根霉
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）是一类广泛分布于自然界中的真菌，有
多种活性强大的酶系［１０］ 。 张帅等［１１］研究发现米
根霉可作为纤维素酶生产的优良菌种，但国内外
对米根霉用于混合菌发酵生产纤维素酶的研究
较少。
里氏木霉 ＲＵＴ Ｃ ３０ 被认为是目前公认纤维
素酶最好的生产菌株之一，为进一步提高其产酶效
率，笔者以农林废弃物玉米秸秆及麸皮为底物，首
次将相对高产 β 葡萄糖苷酶（β ＧＡ）的菌种米根
霉 ＡＳ３􀆰 ８１９与里氏木霉 ＲＵＴ Ｃ ３０进行混合培养，
参考已有对里氏木霉与黑曲霉混合发酵形式的研
究［１２］，选取里氏木霉与米根霉接种量比（以孢子个
数计）为 １ ∶ １及 ５ ∶ １，研究米根霉延迟接种时间及不
同混合发酵形式对混合菌固态发酵产纤维素酶的
影响，以期为高效产纤维素提供理论依据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
里氏木霉 ＲＵＴ Ｃ ３０、米根霉 ＡＳ３􀆰 ８１９，由南京
林业大学生物化工研究所保藏。
１􀆰 １􀆰 ２　 原料
玉米秸秆产自内蒙古呼和浩特、麸皮产自江苏
东台，风干储存。 原料粉碎后过 ０􀆰 ６３ ｍｍ筛。
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基
菌种保藏斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养
基（ＰＤＡ）。
固态发酵培养基：绝干玉米秸秆 ７􀆰 ５ ｇ，绝干麸
皮 ７􀆰 ５ ｇ，（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ５％（质量分数，下同），ＫＨ２ＰＯ４
０􀆰 ３％，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ０５％，ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０５％，Ｍａｎｄｅｌｓ
微量元素溶液 ０􀆰 ０５ ｍＬ，吐温 ８０ １ 滴，含水率 ７０％，
初始 ｐＨ ５􀆰 ０。
１􀆰 １􀆰 ４　 主要试剂
３，５ 二硝基水杨酸试剂（ＤＮＳ）、Ｎａ２ＨＰＯ４ 缓冲
液、柠檬酸 ＮａＯＨ缓冲液、吐温 ８０、对硝基苯酚 β
Ｄ 葡萄糖苷溶液（ｐＮＰＧ）、１ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＣＯ３溶液、羧
甲基纤维素（ＣＭＣ）悬浮液，国产市售分析纯。
１􀆰 ２　 培养方法
以无菌蒸馏水冲洗斜面培养基制成孢子悬浮
液，控制里氏木霉与米根霉孢子悬浮液浓度，使总
孢子接入量为 １×１０８个，将孢子悬浮液按照不同接
种量及不同接种时间接入 ５００ ｍＬ锥形瓶，搅拌至其
与固态培养基混合均匀，置于 ３０ ℃恒温箱培养
１６８ ｈ，每隔 ２４ ｈ拌曲 １次。
１􀆰 ３　 粗酶液提取方法
称取 ５ ｇ固体曲，按照 １ ∶ １０（ｇ ／ ｍＬ）加入 ５０ ｍＬ
ｐＨ ４􀆰 ８的柠檬酸 ＮａＯＨ缓冲液，１滴吐温 ８０，３０ ℃
静置浸提 １ ｈ 后，４ ℃、４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下离心 ２０
ｍｉｎ，收集上清液即为粗酶液。
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １　 滤纸酶（ＦＰＡ）和 β ＧＡ测定方法
采用国际理论和应用化学协会（ ＩＵＰＡＣ）推荐
的标准方法［１３］测定。
１个滤纸酶（ＦＰＡ）活力的国际单位（ＩＵ）定义为
在标准反应条件下每分钟生成 １ μｍｏｌ 葡萄糖所需
的酶量。 １个 β 葡萄糖苷酶活力国际单位（ ＩＵ）定
义为标准条件下每分钟生成 １ μｍｏｌ 对硝基苯酚所
需要的酶量。
１􀆰 ４􀆰 ２　 ＣＭＣ酶活测定方法
在 ２５ ｍＬ试管中加入 ０􀆰 ５ ｍＬ适当稀释的酶液和 ２
ｇ ／ Ｌ羧甲基纤维素悬浮液 １􀆰 ０ ｍＬ。 于恒温水浴器中振
幅 ８０ ｒ ／ ｍｉｎ、温度 ５０ ℃下保温 ３０ ｍｉｎ后立即取出再加
入 ３ ｍＬ ＤＮＳ试剂，在 １００ ℃沸水中煮沸 ５ ｍｉｎ，冷却到
室温后，加水定容至 ２５ ｍＬ，充分摇匀后于 ５５０ ｎｍ波长
下测定吸光度值。 反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖
标准曲线求得。 １个 ＣＭＣ酶活力单位（Ｕ）定义为每分
钟生成 １ μｍｏｌ葡萄糖所需的酶量。
１􀆰 ４􀆰 ３　 里氏木霉、米根霉孢子接种量的测定方法
采用血球计数板及 ＯＬＭＰＵＳ ＣＸ４０ 型显微镜
（奥林巴斯公司）观测计数。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 单菌固态发酵产纤维素酶
２􀆰 １􀆰 １　 里氏木霉单菌固态发酵产纤维素酶
图 １（ａ）为里氏木霉单菌固态发酵产纤维素酶
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
历程。 由图 １（ａ）可知：发酵前 ４ 天 ＦＰＡ 及 ＣＭＣａｓｅ
酶活快速增长，趋势明显，酶活分别在第 ４ 天达到
３２􀆰 ４９ ＩＵ ／ ｇ及 ３８４􀆰 １２ Ｕ ／ ｇ（以 １ ｇ干曲计）。 继续发
酵，ＦＰＡ酶活变化不大，开始呈稳定趋势，ＣＭＣａｓｅ
酶活增长缓慢，发酵第 ６ 天的比酶活比第 ４ 天的只
增长 １􀆰 １％。 β ＧＡ 酶活始终呈增长趋势，但涨势
相对平缓，在第 ６ 天酶活达到 １８􀆰 ６４ ＩＵ ／ ｇ。 从培养
状态观察，发酵第 ２ 天，培养基开始出现结块现象，
这是由于霉菌孢子落在适宜的基质上后发芽并产
生菌丝［１４］，导致培养基凝结成块。 培养基结块状态
于第 ４天开始缓解，至第 ５天培养基完全松散，并开
始出现大量里氏木霉孢子，说明里氏木霉菌丝体大
量衰亡。 在此情况下，ＦＰＡ 及 ＣＭＣａｓｅ 酶活分别在
第 ４天达到 ３２􀆰 ４９ ＩＵ ／ ｇ、３８４􀆰 １２ Ｕ ／ ｇ 后酶活基本保
持稳定。
２􀆰 １􀆰 ２　 米根霉单菌固态发酵产纤维素酶
图 １（ｂ）为米根霉单菌固态发酵产纤维素酶历
程。 由图 １（ｂ）可知：发酵前 ２天 ＦＰＡ及 ＣＭＣａｓｅ 酶
活增长明显，发酵第 ２ 天酶活分别达到 ４􀆰 ７６ ＩＵ ／ ｇ、
５１􀆰 ５４ Ｕ ／ ｇ，之后一直到发酵第 ６ 天结束，酶活均无
太大增长，基本保持稳定。 β ＧＡ 酶活始终呈增长
趋势，在第 ６天酶活达到 １４８􀆰 ７４ ＩＵ ／ ｇ。 从培养状态
观察，培养基从发酵第 ２天开始产生大量白色菌丝，
结块现象严重，培养至第 ４天白色菌丝体明显减少，
培养基结块现象缓解，至第 ５天白色菌丝完全消失，
培养基松散。 与里氏木霉单菌发酵相比，米根霉单
菌发酵产 ＦＰＡ 及 ＣＭＣａｓｅ 能力大大低于里氏木霉，
但其产 β ＧＡ能力远高于里氏木霉。
图 １　 里氏木霉及米根霉单菌固态发酵产纤维素酶历程
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｎｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ （ａ） ａｎｄ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ （ｂ）
２􀆰 ２　 不同混合发酵形式对混合菌固态发酵产纤维
素酶的影响
２􀆰 ２􀆰 １　 不同孢子接种比情况下同时接种混合菌发
酵产酶历程
主要考察在里氏木霉与米根霉孢子接种量比
（以孢子个数计）分别为 １ ∶ １及 ５ ∶ １时，同时接种混
合菌的产酶情况，结果见图 ２。 由图 ２（ａ）可知：ＦＰＡ
酶活在发酵第 ３天达到 ５􀆰 ８３ ＩＵ ／ ｇ，继续发酵酶活变
化不大； ＣＭＣａｓｅ 酶活在发酵第 ４ 天达到最大值
（７６􀆰 ４５ Ｕ ／ ｇ），其后随着菌丝体的衰亡，酶活有所下
降并在发酵后期保持基本稳定；β ＧＡ 酶活自第 ２
天开始持续增长，在第 ７ 天酶活达到 １５１􀆰 ６０ ＩＵ ／ ｇ。
由图 ２（ｂ）可知：ＦＰＡ 酶活在第 ３ 天达到 ４􀆰 ９０ ＩＵ ／ ｇ
后，继续发酵酶活变化不大；ＣＭＣａｓｅ 酶活自第 ４ 天
达到 ５１􀆰 ５８ Ｕ ／ ｇ 后，继续发酵酶活基本保持不变；
β ＧＡ酶活同样自发酵第 ２ 天开始快速增长，发酵
第 ７天酶活达到 １５３􀆰 ９６ ＩＵ ／ ｇ。 比较这两种不同接
种比发酵形式，可以发现，两者产酶情况类似，并都
与米根霉单菌固态发酵产酶情况基本一致，说明在
同时接种混合菌，在接种量比 １ ∶ １及 ５ ∶ １的情况下，
米根霉都在发酵中占据种群优势，导致里氏木霉无
法正常生长并主导发酵产 ＦＰＡ，发酵过程中以产 β
ＧＡ为主，并且相对米根霉单菌发酵并无优势。 此
实验结果说明这 ２ 种发酵形式下，里氏木霉与米根
霉并没有形成有效的协同作用。
２􀆰 ２􀆰 ２　 不同孢子接种比情况下米根霉延时接种
２４ ｈ混合菌发酵产酶历程
主要考察在里氏木霉与米根霉孢子接种量比
分别为 １ ∶ １及 ５ ∶ １时，米根霉延时接种 ２４ ｈ 的产酶
情况，结果见图 ３。 由图 ３（ ａ）可知：当接种量比为
１ ∶ １时，ＦＰＡ 和 ＣＭＣａｓｅ 比酶活分别在第 ３ 天达到
４􀆰 ８９、４７􀆰 ８９ Ｕ ／ ｇ，继续发酵酶活基本保持稳定；β
ＧＡ酶活于第 ２ 天随着米根霉的接入开始持续增
长，在第 ７天酶活达到 １４２􀆰 ２８ ＩＵ ／ ｇ。 与米根霉单菌
３　 第 ６期 吴　 昊等：里氏木霉与米根霉混合固态发酵产纤维素酶
发酵相比，ＦＰＡ及 ＣＭＣａｓｅ酶活均没有明显增长，而
β ＧＡ酶活有了明显下降，说明此发酵形式下，里
氏木霉的存在对米根霉产 β ＧＡ 造成一定负面影
响，两菌仍未达到有效的协同作用效果。 由图 ３（ｂ）
可知，当接种量比为 ５ ∶ １时，ＦＰＡ 及 ＣＭＣａｓｅ 酶活在
前 ４ ｄ快速增长，分别达到 １０􀆰 １０ ＩＵ ／ ｇ、１２２􀆰 ７３ Ｕ ／ ｇ；
β ＧＡ酶活在发酵第 ３ 天开始快速增长，到第 ５ 天
酶活达到 ９９􀆰 ３８ ＩＵ ／ ｇ 后增长减缓，在第 ７ 天达到
１０５􀆰 ５３ ＩＵ ／ ｇ。 在此发酵形式下 ＦＰＡ 及 ＣＭＣａｓｅ 酶
活虽然远低于里氏木霉单菌发酵，但β ＧＡ相对于
里氏木霉单菌发酵酶活增长约 ４􀆰 ６６倍。 同样，与米
根霉单菌发酵相比，β ＧＡ 酶活虽然有所降低，但
ＦＰＡ及 ＣＭＣａｓｅ酶活均有较大提高。 此实验结果说
明在此发酵形式下以产 β ＧＡ 为主，产 ＦＰＡ 及
ＣＭＣａｓｅ为辅，里氏木霉与米根霉产生了一定协同
作用。
图 ２　 同时接种，里氏木霉与米根霉的接种量比分别为 １ ∶ １和 ５ ∶ １时混合固态发酵产纤维素酶历程
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｘｅｄ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ １ ∶ １ （ａ） ａｎｄ ５ ∶ １ （ｂ），
ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ
图 ３　 米根霉延时接种 ２４ ｈ，里氏木霉与米根霉接种量比分别为 １ ∶ １与 ５ ∶ １时混合固态发酵产纤维素酶历程
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｘｅｄ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ １ ∶ １ （ａ） ａｎｄ ５ ∶ １ （ｂ），
ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｆｏｒ ２４ ｈ
２􀆰 ２􀆰 ３　 不同孢子接种比情况下米根霉延时接种
４８ ｈ混合菌发酵产酶历程
主要考察在里氏木霉与米根霉孢子接种量比分
别为 １ ∶ １及 ５ ∶ １时，米根霉延时接种 ４８ ｈ 的产酶情
况，结果见图 ４。 由图 ４（ａ）可知：当接种量比为１ ∶ １
时，ＦＰＡ和 ＣＭＣａｓｅ酶活分别在第 ４天达到 ８􀆰 ３４ ＩＵ ／ ｇ
和 ８１􀆰 ２１ Ｕ ／ ｇ，继续发酵酶活基本保持稳定；β ＧＡ酶
活随着米根霉的接入于第 ３天开始持续增长，在第 ６
天酶活达到 １００􀆰 ５９ ＩＵ ／ ｇ后有所下降。 此结果与接种
量比 ５ ∶ １，米根霉延迟时接种 ２４ ｈ发酵形式下产酶结
果类似，说明在此发酵形式下仍以产 β ＧＡ为主，产
ＦＰＡ及 ＣＭＣａｓｅ为辅，里氏木霉与米根霉产生了一定
协同作用。 由图 ４（ｂ）可知：当接种量比为 ５ ∶ １时，
ＦＰＡ、ＣＭＣａｓｅ以及 β ＧＡ自发酵开始持续增长，产酶
速度在第 ６ 天减缓，在第 ７ 天酶活分别达到 ４４􀆰 ０４
ＩＵ ／ ｇ、６２７􀆰 １４ Ｕ ／ ｇ 和 １７􀆰 １４ ＩＵ ／ ｇ。 此结果与里氏木霉
单菌发酵相比，产酶达到稳定期的时间由于米根霉的
延迟接入而延长，但 ＦＰＡ 与 ＣＭＣａｓｅ 均有了显著提
高，β ＧＡ酶活基本与里氏木霉单菌发酵相同。 此结
果说明在这种发酵形式下，里氏木霉与米根霉形成有
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
效的协同作用，互利共生，米根霉的存在促进了里氏 木霉产纤维素酶。
图 ４　 米根霉延时接种 ４８ ｈ，里氏木霉与米根霉接种量比分别为 １ ∶ １与 ５ ∶ １时混合固态发酵产纤维素酶历程
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｘｅｄ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ １ ∶ １ （ａ） ａｎｄ ５ ∶ １ （ｂ），
ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｆｏｒ ２４ ｈ
３　 结　 论
１）在同时接种里氏木霉与米根霉的发酵形式
下，实验考察的 ２ 种菌种量比 １ ∶ １及 ５ ∶ １均以米根
霉主导发酵产 β ＧＡ为主，发酵情况与米根霉单菌
固态发酵基本一致，里氏木霉与米根霉未产生明显
协同产酶作用。
２）米根霉延时接种 ２４ ｈ 且菌种接种量比 ５ ∶ １
以及米根霉延时接种 ４８ ｈ 且菌种接种量比 １ ∶ １
２种发酵形式产酶情况类似，ＦＰＡ及 ＣＭＣａｓｅ酶活相
对米根霉单菌发酵有所提高，而 β ＧＡ 酶活相对里
氏木霉单菌固态发酵结束时分别增加 ４􀆰 ６６ 及 ４􀆰 ４０
倍，里氏木霉与米根霉产生协同作用，但仍以米根
霉产 β ＧＡ为主，里氏木霉产纤维素酶为辅。
３）在米根霉延时接种 ４８ ｈ且菌种接种量比５ ∶ １
的发酵形式下，ＦＰＡ 及 ＣＭＣａｓｅ 在发酵第 ７ 天酶活
分别达到 ４４􀆰 ０４ ＩＵ ／ ｇ、６２７􀆰 １４ Ｕ ／ ｇ，分别是里氏木霉
固态单菌发酵产酶达到稳定期时酶活的 １􀆰 ３６ 和
１􀆰 ６３倍。 说明在此发酵形式下，里氏木霉与米根霉
产生了有效的协同作用，米根霉的存在促进了里氏
木霉生产纤维素酶。
综合上述试验结果表明，里氏木霉与米根霉混
合固态发酵产纤维素酶是可行的，通过对接种时间
及接种比等发酵形式的调整可使混合菌产生有效
的协同作用，促进纤维素酶的生产，从而更好地应
用于大规模生产纤维素酶的工业发展中。
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（责任编辑　 荀志金）
５　 第 ６期 吴　 昊等：里氏木霉与米根霉混合固态发酵产纤维素酶