全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ００７
收稿日期：２０１４－１２－１５
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２１５０５）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１１１５８）
作者简介：赵如奎（１９８９—），男，山东德州人，硕士研究生，研究方向：发酵工学；吴剑荣（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｋｉｎｏｗｕ７＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
α 环糊精葡萄糖基转移酶催化合成 α 熊果苷
赵如奎１，吴剑荣１，詹晓北１，朱　 莉２
（１． 江南大学 生物工程学院糖 化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；
２． 无锡格莱克斯生物科技有限公司，江苏 无锡 ２１４１２５）
摘　 要：以对苯二酚和麦芽糊精为底物，通过 α 环糊精葡萄糖基转移酶和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应体系催
化合成 α 熊果苷。 优化后的催化条件：以葡萄糖当量（ＤＥ）值为 ８％～１０％的麦芽糊精作为供体底物，麦芽糊精 ６０
ｇ ／ Ｌ，对苯二酚 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，缓冲液 ｐＨ ６􀆰 ０，在 ４０ ℃下反应 ２４ ｈ。 在此反应条件下，α 熊果苷的产量为 ３􀆰 １７ ｇ ／ Ｌ，
对苯二酚转化率为 ７􀆰 ７７％。 通过萃取法对 α 熊果苷进行了初步分离，再经高效液相色谱 电喷雾串联质谱技术进
行了结构测定，确定产物为 α 熊果苷。
关键词：α 熊果苷；酶催化；生物合成；对苯二酚；麦芽糊精
中图分类号：Ｑ５５５＋ 􀆰 ４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００３６－０６
α⁃Ａｒｂｕｔｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ α⁃ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
ＺＨＡＯ Ｒｕｋｕｉ１，ＷＵ Ｊｉａｎｒｏｎｇ１，ＺＨＡＮ Ｘｉａｏｂｅｉ１，ＺＨＵ Ｌｉ２
（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｗｕｘｉ Ｇｒａｍｅｅｎ Ａｌｅｘ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｗｕｘｉ ２１４１２５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：α⁃Ａｒｂｕｔｉｎ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ α⁃ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， ｗｉｔｈ
ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ａｎｄ ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｉｎ ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ａｓ ａｃｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ａｓ ｄｏｎｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ａ ｔｗｏ⁃ｓｔｅｐ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ α⁃ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｈｅｌｐｅｄ ｔｏ ａｔｔａｉｎ ａ
ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ：ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ （ＤＥ） ｖａｌｕｅ ｂｅｔｗｅｅｎ
８％ ａｎｄ １０％ ａｓ ｄｏｎｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ， ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ， ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ６０ ｇ ／ Ｌ， ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ ６􀆰 ０，
ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ａｔ ４０ ℃ ｆｏｒ ２４ ｈ． Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ ｗａｓ ３􀆰 １７ ｇ ／ Ｌ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ｗａｓ ７􀆰 ７７％． α⁃Ａｒｂｕｔｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ⁃ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：α⁃ａｒｂｕｔｉｎ； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃａｆａｌｙｓｉｓ； ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ； ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ
　 　 熊果苷（ａｒｂｕｔｉｎ）属氢醌苷化合物，化学名为 ４
羟基苯基 Ｄ 吡喃葡萄糖苷，存在于熊果、越橘等
植物中，是一种新兴的无刺激、无过敏、配伍性强的
天然美白活性物质［１－２］。 熊果苷具有显著的抑制酪
氨酸酶活性，可减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对
皮肤有美白、防色变和祛斑的功效［３］。 另外，熊果
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苷具有两种同分异构体，分别是 α 熊果苷和 β 熊
果苷。 相关应用研究表明，α 熊果苷的美白效果是
β 熊果苷的 １０倍以上［４－７］。 α 熊果苷的美白机制
是直接抑制酪氨酸酶活性，从而减少黑色素的生
成，而不是通过抑制细胞生长或酪氨酸酶基因表达
的方式来达到减少黑色素生成的目的。 由于 α 熊
果苷是一种更高效、更安全的美白活性物质，国内
外许多家化妆品公司已采用 α 熊果苷代替 β 熊果
苷作为美白添加剂［８－９］。
与 β 熊果苷可通过植物提取、植物细胞培养和
化学合成等方法来获得的方式不同，α 熊果苷一般
只能通过微生物细胞或者酶进行催化葡萄糖基糖
转移到氢醌上形成单一的 α 熊果苷［１０ １２］。 已报道
用于合成 α 熊果苷的酶包括从酿酒酵母中分离的
α 葡萄糖苷酶［１３］，从肠膜明串珠菌分离的葡聚糖
蔗糖酶［１４］以及淀粉蔗糖酶等［１５］；葡萄糖基供体包
括蔗糖、麦芽糖、滤纸粉、葡萄糖和对硝基葡萄糖苷
等，α 熊果苷最高产量仅为 ２􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ［１６ １９］。 另外，野
油菜黄单胞菌由于含有转葡萄糖苷酶，其冻干细胞
或者细胞破碎悬液也可以用于催化 α 熊果苷合
成，产量分别为 ０􀆰 ４２ ｇ ／ Ｌ 和 ６􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ，但是细胞质
量浓度达到 ８０ ｇ ／ Ｌ，底物糖浓度比较高，糖转化率
低，给后续提取造成困难［４，２０］。 为了提高转葡萄糖
苷酶作用效率，Ｗｕ 等［２１］将野油菜黄单胞菌的转葡
萄糖苷酶基因表达并锚定在大肠杆菌表面，全细胞
催化后，α 熊果苷产量可达 ２１ ｇ ／ Ｌ，氢醌转化率为
７６％。 另外，刘春巧课题组以嗜麦芽黄单胞菌为催
化剂，尝试采用发酵法和游离细胞进行催化反应，
α 熊果苷可达 １２～１６ ｇ ／ Ｌ；进一步采用固定氢醌在
树脂方后进行全细胞催化，最终产量可达到 ６５􀆰 ９
ｇ ／ Ｌ，氢醌转化率为 ９５􀆰 ２％［２２－２５］。 虽然发酵法或全
细胞催化能够得到较高浓度产物，但是发酵液复杂
的成分给后续提取造成困难，且培养细胞和催化反
应都需要较长时间。
环 糊 精 葡 萄 糖 基 转 移 酶 （ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ
ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ， ＣＧＴ酶，ＥＣ２􀆰 ４􀆰 １􀆰 １９）是一种胞外酶，
可以分成 α 、β 和 γ ３种类型，多用于制备α 、β
和 γ 环糊精［２６］。 ＣＧＴ酶是一种多功能型酶，它能催
化 ４种不同的反应：３种转糖基反应（歧化反应、环化
反应和偶合反应）和水解反应［２７］。 研究发现 α ＣＧＴ
酶还可以通过转糖基反应催化转苷，生成如维生素 Ｃ
葡萄糖苷、α 熊果苷等产物［２８－３１］。 相比其他用于催
化合成 α 熊果苷的酶，α ＣＧＴ酶底物专一性较广，
转葡萄糖基过程不需要耗能。
本文中，笔者尝试利用国产安琪酵母公司的
α ＣＧＴ酶为催化剂，以廉价麦芽糊精为葡萄糖基供
体进行合成，再通过淀粉葡萄糖苷酶水解获得 α
熊果苷，为以商品化 α ＣＧＴ酶生产制备 α 熊果苷
提供理论基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 主要材料
α ＣＧＴ酶，安琪酵母公司；淀粉葡萄糖苷酶，
无锡杰能科生物工程公司；对苯二酚（ＨＱ）、麦芽
糖、ＣａＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ、柠檬酸，国药集团化学
试剂有限公司；麦芽糊精为市售产品 （ ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ值（ＤＥ）分别 ４％ ～ ６％、８％ ～ １０％、１０％ ～
１５％）；α 熊果苷标准品，Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ公司。
１􀆰 ２　 α 熊果苷的合成
转葡萄糖糖基反应：在 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ６􀆰 ０ 的柠
檬酸 磷酸盐缓冲液体系中加入 ＣａＣｌ２（５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），对
苯二酚（１５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），麦芽糊精 ６０ ｇ ／ Ｌ 和 ０􀆰 ０２５
ｍｇ ／ ｍＬ α 环糊精葡萄糖基转移酶，于 ４０℃、１００
ｒ ／ ｍｉｎ水浴摇床中反应 ２４ ｈ，样品沸水浴 ５ ｍｉｎ灭活。
水解反应：高温灭活后的样品中加入淀粉葡萄
糖苷酶，于 ４０℃、１００ ｒ ／ ｍｉｎ 水浴摇床中反应 ４ ｈ后，
再次沸水浴 ５ ｍｉｎ 灭活，离心后经高效液相色谱
（ＨＰＬＣ）分析。
１􀆰 ３　 α 熊果苷的分析
取 ０􀆰 ８ ｍＬ 样品，加入 ０􀆰 ２ ｍＬ 甲醇，在 ８ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ条件下离心 １０ ｍｉｎ，上清液用 ＬＣ ２０１０Ａ型高
效液相色谱检测（日本岛津）。 色谱条件：色谱柱为
岛津 Ｃ１８柱（４􀆰 ６ ｍｍ×２５ ｃｍ，５ μｍ）；柱温为 ３０ ℃；
流动相为 Ｈ２Ｏ ＣＨ３ＯＨ 溶液，其体积比为 ８０ ∶ ２０；
流速为 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ；检测器为紫外检测器；检测波
长为 ２８０ ｎｍ；进样量为 １０ μＬ。
１􀆰 ４　 对苯二酚转化率计算
对苯二酚的转化率计算见式（１）。
对苯二酚转化率 ＝ ｎ２ ／ ｎ１ × １００％ （１）
式中：ｎ１为加入到发酵液中对苯二酚物质的量，ｎ２为
反应后发酵液中转化为 α 熊果苷的对苯二酚物质
的量。
１􀆰 ５　 α 熊果苷的纯化
样品经 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，取上清液加入
２倍体积乙酸乙酯，收集水相，再加入 ２ 倍体积正丁
醇，收集水相，分别萃取 ３ 次，通过旋转蒸发仪蒸干
７３　 第 ４期 赵如奎等：α 环糊精葡萄糖基转移酶催化合成 α 熊果苷
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
后收集样品，即得初步纯化的 α 熊果苷。
１􀆰 ６　 α 熊果苷的结构测定
通过高效液相色谱 电喷雾串联质谱技术（ＬＣ
ＥＳＩ ＭＳ ／ ＭＳ， ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＥＭＲ， Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）对产物进行鉴定。
色谱条件：色谱柱为 Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ１８（１００ ｍｍ×
２􀆰 １ ｍｍ，１􀆰 ９ μｍ），柱温为 ３０ ℃；流动相为水（Ａ）
甲醇（Ｂ）溶液。 梯度洗脱（０ ～ ２ ｍｉｎ １０％ Ｂ、２ ～ １０
ｍｉｎ ２０％ Ｂ、１０～１３ ｍｉｎ ８０％ Ｂ、１３～１５ ｍｉｎ １０％ Ｂ）；
流速为 ０􀆰 ２ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进样量为 １ μＬ。 质谱条件：ＥＳＩ
离子源，正离子监测模式检测；喷雾电压为 ３􀆰 ２ ｋＶ；
雾化器压力为 ０􀆰 ２０８ ＭＰａ；辅助气压力为 ０􀆰 ２０８
ＭＰａ；离子传输毛细管温度为 ３５０ ℃；数据采集扫描
时间为 ０􀆰 ５０ ｓ；分辨率 Ｑ１ 和 Ｑ３ 均为 ０􀆰 ７ ａｍｕ
（ＦＷＨＭ）；碰撞能量为 １５ ｅＶ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 对苯二酚的转糖基反应
考察安琪酵母的 α ＣＧＴ 酶催化对苯二酚与麦
芽糊精的转糖基反应，结果如图 １ 所示。 由图 １ 可
知：α ＣＧＴ酶能够使对苯二酚糖基化，形成具有不同
葡萄糖基的糖苷混合物（ＨＱＧｎ），其葡萄糖基的数量
不等，保留时间均小于对苯二酚。 首先，麦芽糊精作
为供体与 α ＣＧＴ酶的活性位点结合形成中间酶，通
过水解不同的糖苷键，释放出单糖、双糖或低聚糖。
然后，中间酶又与对苯二酚结合，对苯二酚的羟基与
单糖、双糖或低聚糖结合生成 ＨＱＧｎ。 同样，ＨＱＧｎ也
可以作为供体底物。 当 ＨＱＧｎ作为供体底物，对苯二
酚（ＨＱ）作为受体底物时，α ＣＧＴ 酶切断不同的糖
苷键，从而也可生成ＨＱＧ１ ～ＨＱＧ４ ［３１］。
图 １　 α ＣＧＴ酶催化对苯二酚转糖基反应的
产物液相色图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ
ｗｉｔｈ α⁃ＣＧＴ ｂｙ ＨＰＬＣ
２􀆰 ２　 糖苷的水解反应
淀粉葡萄糖苷酶（糖化酶）可以切断 α 糖苷
键，将该酶加入上述转糖基反应混合液中，可以将
长链的葡萄糖切除，使得 ＨＱＧｎ生成 ＨＱＧ１（α 熊果
苷）。 液相色谱分析结果如图 ２所示。 由图 ２可知，
图中的峰分别为 ＨＱＧ１和未反应的对苯二酚 ＨＱ。
因此，通过 α ＣＧＴ 酶和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶
法反应体系，可以用于合成 α 熊果苷。
图 ２　 糖化酶催化糖苷水解反应的产物液相色图谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｂｙ ＨＰＬＣ
２􀆰 ３　 催化反应条件的优化
２􀆰 ３􀆰 １　 不同供体底物对反应的影响
分别考察葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精（ＤＥ值４％～
６％、８％～１０％、１０％ ～１５％）作为 α 熊果苷的供体底
物对反应的影响，结果见表 １。 由表 １可知：所选底物
中除葡萄糖外，麦芽糖、麦芽糊精均可作为供体底物
生成 α 熊果苷，其中采用 ＤＥ值 ８％～１０％麦芽糊精
的 α 熊果苷产量最高，达到 ２􀆰 ６１ ｇ ／ Ｌ。 ＤＥ 值 ４％～
６％麦芽糊精水溶性较差，水溶液黏度高，溶于水易形
成凝胶。 采用 ＤＥ 值 １０％～１５％麦芽糊精时，低分子
葡萄糖较多，高分子葡萄糖较少，α 熊果苷产量要低
于 ＤＥ值 ８％～１０％麦芽糊精；麦芽糖仅由 ２个葡萄糖
基组成，α ＣＧＴ也能催化糖基转移反应形成少量α
熊果苷，表明该 α ＣＧＴ 的底物专一性不强，底物选
择范围较大。 作为参照，葡萄糖做为单糖无法被 α
ＣＧＴ识别［４］，未能检测到 α 熊果苷。 相比多数研究
以蔗糖、麦芽糖为葡萄糖基供体的酶催化反应［１６ １９］，
本研究使用的麦芽糊精价格更低廉，并且 α 熊果苷
产量较高，但对苯二酚的转化率要低很多。
２􀆰 ３􀆰 ２　 麦芽糊精浓度对反应的影响
考察不同质量浓度的 ＤＥ值为 ８％～１０％麦芽糊
精为底物对催化反应的影响，结果如图 ３ 所示。 由
图 ３可知：在一定麦芽糊精浓度范围内，α 熊果苷
的产量随着麦芽糊精浓度的升高而增加，当麦芽糊
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
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精达到 ６０ ｇ ／ Ｌ 时，α 熊果苷的产量达到最大值
２􀆰 ５８ ｇ ／ Ｌ，对苯二酚转化率为 ６􀆰 ３４％，生产速率为
０􀆰 １１ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），继续增加麦芽糊精用量，由于底物抑
制作用，α 熊果苷产量基本不变，所以较适的麦芽
糊精为 ６０ ｇ ／ Ｌ。 该底物浓度与 Ｓｈｉｍｏｄａ 等［３０］所用
的 ５％的滤纸粉用量相差不大。
表 １　 不同供体底物对 α ＣＧＴ酶催化反应的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ α⁃ＣＧＴ
供体底物 ρ（α 熊果苷） ／ （ｇ·Ｌ－１） 对苯二酚转化率 ／ ％ 生产速率 ／ （ｇ·Ｌ－１·ｈ－１）
葡萄糖 ０ ０ ０
麦芽糖 １􀆰 ０７±０􀆰 ０６ ２􀆰 ６２±０􀆰 １４ ０􀆰 ０４±０􀆰 ００
麦芽糊精（ＤＥ值 ４％～６％） １􀆰 ８５±０􀆰 ０４ ４􀆰 ５３±０􀆰 １０ ０􀆰 ０８±０􀆰 ００
麦芽糊精（ＤＥ值 ８％～１０％） ２􀆰 ６１±０􀆰 ０８ ６􀆰 ４０±０􀆰 １９ ０􀆰 １１±０􀆰 ００
麦芽糊精（ＤＥ值 １０％～１５％） ２􀆰 １１±０􀆰 ０２ ５􀆰 １７±０􀆰 ０５ ０􀆰 ０９±０􀆰 ００
图 ３　 麦芽糊精浓度对催化合成 α 熊果苷的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ
２􀆰 ３􀆰 ３　 对苯二酚浓度对反应的影响
图 ４　 对苯二酚浓度对催化合成 α 熊果苷的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ
由于对苯二酚对酶具有抑制作用，当缓冲液中
对苯二酚浓度超过一定量时，酶活性会下降。 图 ４
为对苯二酚浓度对催化合成 α 熊果苷的影响结
果。 由图 ４可知：在一定对苯二酚浓度范围内，α
熊果苷的产量随着对苯二酚浓度的增加而增加，最
高产量为 ２􀆰 ６７ ｇ ／ Ｌ， 此时对苯二酚转化率为
６􀆰 ５４％，生产速率为 ０􀆰 １１ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 但当对苯二酚
浓度超过 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，α 熊果苷的产量开始下
降。 这可能是由于对苯二酚的羟基比较活泼，对酶
的活性中心和结构会产生影响，浓度过高会导致部
分 α ＣＧＴ酶活性下降甚至失活，最终导致 α 熊果
苷产量下降。 与全细胞催化、细胞破碎悬液和发酵
法制备 α 熊果苷相比而言，商品化的 α ＣＧＴ酶对
对苯二酚的耐受性大大提高［１９－２０，２２－２３］。
２􀆰 ３􀆰 ４　 温度对反应的影响
考察反应温度对催化反应的影响，结果如图 ５
所示。 由图 ５可知：α 熊果苷的最适反应温度为 ４０
℃，此时产量达 ２􀆰 ５９ ｇ ／ Ｌ，对苯二酚转化率为
６􀆰 ３５％，生产速率为 ０􀆰 １１ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 在一定温度范
围内，提高温度有利于提高酶的活性，当反应温度
过高时，会导致酶的催化能力下降。 同时，随着温
度的升高，对苯二酚氧化速度加快，反应体系中对
苯二酚浓度下降，最终导致 α 熊果苷产量下降。
图 ５　 温度对催化合成 α 熊果苷的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ
９３　 第 ４期 赵如奎等：α 环糊精葡萄糖基转移酶催化合成 α 熊果苷
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
２􀆰 ３􀆰 ５　 缓冲溶液 ｐＨ对反应的影响
其他条件不变，考察不同 ｐＨ的柠檬酸 磷酸盐缓
冲溶液反应体系对酶催化反应的影响，结果如图 ６所
示。 由图 ６可知：当柠檬酸 磷酸盐缓冲溶液的 ｐＨ在
６􀆰 ０时，α 熊果苷的产量最高为 ２􀆰 ６２ ｇ ／ Ｌ，对苯二酚转
化率为 ６􀆰 ４２％，生产速率为 ０􀆰 １１ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），这说明 α
ＣＧＴ酶在 ｐＨ为 ６􀆰 ０的缓冲溶液体系中活性达到最大。
图 ６　 缓冲液 ｐＨ对催化合成 α 熊果苷的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ
２􀆰 ３􀆰 ６　 反应时间对反应的影响
图 ７为反应时间对催化反应的影响结果。 由图
７可知：α 熊果苷产量随着反应时间的延长先升高
后降低，当反应时间为 ２４ ｈ 时，α 熊果苷产量达到
最高 ２􀆰 ６５ ｇ ／ Ｌ，对苯二酚转化率 ６􀆰 ５０％，生产速率
为 ０􀆰 １１ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 随着反应时间的延长，α 熊果苷
产量有所下降，这是因为 α 熊果苷存在一个缓慢
的水解过程。 所以最佳反应时间为 ２４ ｈ。 相比以往
酶催化反应所需时间（４８～９６ ｈ）和生产速率（８􀆰 ３３×
１０－４ ～１􀆰 ５３×１０－２ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）），本研究的反应时间大大
缩短，而生产速率提高一个数量级［２２－２５］。
图 ７　 反应时间对催化合成 α 熊果苷的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ
２􀆰 ４　 α 熊果苷的纯化与鉴定
把反应所得到的样品首先经乙酸乙酯萃取，再
经正丁醇萃取，通过旋转蒸发仪蒸干收集，得到的
样品再经过离心，上清液用 ＨＰＬＣ 进行分析，并与
α 熊果苷标准品的 ＨＰＬＣ色谱图进行比较，发现样
品与 α 熊果苷有相同的保留时间，所以初步推断
样品中含有 α 熊果苷。 再把萃取纯化后的产物通
过 ＬＣ ＥＳＩ ＭＳ ／ ＭＳ 的正离子模式进行鉴定，结果
如图 ８所示。 由图 ８ 可知：α 熊果苷实际相对分子
质量为 ２７２，产物相对分子质量与 α 熊果苷标准品
相对分子质量均为 ２９５，这是由于形成阳离子加合
物［Ｍ＋Ｎａ］ ＋的结果，所以，可以确定产物为 α 熊
果苷。
图 ８　 α 熊果苷的 ＬＣ ＥＳＩ ＭＳ谱图
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ α⁃ａｒｂｕｔｉｎ ｂｙ ＬＣ⁃ＥＳＩ⁃ＭＳ
３　 结论
１）通过实验证明了 α ＣＧＴ酶能催化将麦芽糊
精上葡萄糖转糖基到对苯二酚上，合成 α 熊果苷。
较优反应条件：ＤＥ ８％ ～ １０％的麦芽糊精作为供体
底物，对苯二酚 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，麦芽糊精 ６０ ｇ ／ Ｌ，ｐＨ
６􀆰 ０，在 ４０ ℃下反应 ２４ ｈ。 通过对产物的分离提取、
结构鉴定，确定该产物为 α 熊果苷。
２）单纯利用 α ＣＧＴ 酶也可催化合成 α 熊果
苷，但产量相对较低，并且副产物较多，给分离纯化
带来困难。 α ＣＧＴ 酶和淀粉葡萄糖苷酶的双酶催
化法，不仅提高了 α 熊果苷的产量，减少了副产物
的生成，并且降低了分离纯化难度，独具优势。
３）酶法催化原料简单，生产周期短，提取纯化
方便，但酶无法重复利用。 下一步可考虑采用固定
化酶催化合成 α 熊果苷，固定化酶可重复利用，节
约生产成本。
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Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ［Ｊ］ ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｊ，２０１３，７９：１８７⁃１９３．
（责任编辑　 荀志金）
１４　 第 ４期 赵如奎等：α 环糊精葡萄糖基转移酶催化合成 α 熊果苷
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８