全 文 ：乳杆菌 !"#$%&"#’(()* !" #$%"发酵高产 !&乳酸研究
赵 博，周 帅，马翠卿，杨春玉，许 平!
（山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 ’()*))）
摘 要：筛选得到一株乳杆菌 !"#$%&"#’(()* !" #，进行发酵生产高浓度 !&乳酸的研究。考察了种龄、接种量、温度和不 同 "+调节剂对乳酸发酵的影响。结果表明：最佳种子培养时间为 *( ,；最佳接种量为 *(-；最适培养温度为.’ /； 与氨水和氢氧化钠相比，碳酸钙更适于作为发酵过程的 "+ 调节剂；以葡萄糖为碳源，添加豆粕水解液和玉米浆作 为辅料，’ 0罐培养 *’) ,，!&乳酸质量浓度可达 ’)’ 1 2 0，糖转化率 3* 45-，!&乳酸占发酵液中总酸含量 36-以上。 关键词：!&乳酸；发酵；乳杆菌 中图分类号：783’* #5 文献标识码：9 文章编号：*:;’ < 5:;6（’))(）). < ));. < ). !"#$% &’ ()*( %)+,$!-,./")/ ./)$ 0+12+’".")&’ 3% . !"#$%&"#’(()* 45 4 =+9> ?@，=+>A B,CDE，F9 GCE&HEI1，J9KL G,CI&MC，NA OEI1 （BPDPQ RQM 0DS@TDP@TM 4 @U FEVT@SED$ 7QV,I@$@1M，B,DIW@I1 AIEXQT!EPM，YEIDI ’()*))，G,EID） 634"1./"：OT@WCVPE@I @U !&$DVPEV DVEW SM D !"#$%&"#’(()* !" 4 ZD! !PCWEQW # 7,Q QUUQVP! @U !QQW EIVCSDPE@I PE[Q， EI@VC$DPE@I D[@CIP，PQ["QTDPCTQ DIW WEUUQTQIP "+ TQ1C$DP@T @I !&$DVPEV DVEW "T@WCVPE@I ZD! EIXQ!PE1DPQW # 7,Q
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乳酸（$DVPEV DVEW）又名二羟基丙酸，是一种传统 的多用途精细化学品，乳酸可作为酸味剂、芳香剂、 防腐剂、植物生长调节剂、生物可降解性材料、药物 和农药等，应用于食品、制药、酿造、制革、纺织、环保 和农业中［*，’］。随着对乳酸研究利用的不断深入， 以 !+乳酸为原料制取聚乳酸（O09），作为高强度、热 塑性的生物可降解材料引起世界各国的广泛重视， 被认为是最具发展前途的生物可降解高分子材料之 一［5］。 !+乳酸以其更广泛的用途和更高的安全性， 成为国内外乳酸行业的研究热点，但成本过高仍然 是制约 !+乳酸应用的主要因素。发酵法生产 !+乳 酸的菌种主要有细菌和根霉两类，与根霉相比，虽然 细菌乳酸发酵营养要求较复杂，但其大多属于厌氧 或微耗氧发酵，动力消耗小，产酸量高，糖酸理论转 化率可达 *))-，更有利于降低成本。目前文献报 道细菌乳酸发酵的较高水平有天津大学白冬梅等分 别采用分批发酵和流加发酵进行实验，分批发酵周 期 *;. ,，!+乳酸产量达到 ’*; 1 2 0，流加发酵周期 3: ,，!+乳酸产量达到 ’*) 1 2 0［.］；9ICTDW,D等人采用 同时糖化发酵技术（BB\），以 ’() 1 2 0 淀粉为底物发 ! 收稿日期：’))(&)6&’) 作者简介：赵 博（*3;3&），男，山东济南人，硕士研究生，研究方向：资源与环境微生物。 联系人：许 平（*3:*&），男，教授，研究方向：环境化学生物学与环境友好生物技术；]&[DE$："EI1%C^ !WC4 QWC4 VI
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生 物 加 工 过 程
G,EIQ!Q Y@CTID$@U ?E@"T@VQ!! ]I1EIQQTEI1 第 5 卷第 . 期 ’))( 年 ** 月 万方数据 酵 !"" #产乳酸 !$% & ’ (［)］；*+,&-./, 0/,等人采用分
批发酵，以 1"" & ’ ( 葡萄糖为碳源，添加适量酵母
粉，发酵 )" # 产 !"乳酸 !$) & ’ (［2］。本试验采用一 株乳杆菌分批发酵生产 !"乳酸，获得了较高的 !"乳 酸浓度。 ! 材料与方法 ! 3! 菌株及培养方法 ! 3! 3! 菌 株 本实验室筛选分离得到一株菌，经生理生化鉴 定，确认为乳杆菌属菌株，命名为 !#$%&’#$())*+ 45 3 675 进一步鉴定到种的工作正在进行中。 ! 3! 31 培养基 斜面培养基（& ’ (）：葡萄糖 1"，酵母膏 )，大豆蛋 白胨 !"，牛肉膏 !"，氯化钠 !"，醋酸钠 )，柠檬酸 铵 1，8&.9:·;<19 " 31，8,.9:·:<19 " 3")，琼脂 !)。 种子培养基（& ’ (）：葡萄糖 :"，蛋白胨 1"，酵母 膏 !"，硫酸铵 )，磷酸二氢钾 !，碳酸钙 !)。 发酵培养基：工业葡萄糖 1"" & ’ (，自制豆粕水 解液 1"" & ’ (，玉米浆 1) & ’ (，!"" & ’ ( 轻质碳酸钙， 或通过流加 !"=氨水、!" >+6 ’ ( 氢氧化钠调节发酵 液 5<。 ! 3! 3? 培养方法 种子培养：三角瓶装液量 !"" >( ’ 1)" >(，:1 @ 静置培养。 发酵培养：三角瓶装液量 !"" >( ’ 1)" >(，:1 @静 置培养。AB9.CDC A 1 (（A3AEF/,）发酵罐，装液量 !3$ (，发酵温度 :1 @，间歇搅拌，搅拌转速 1"" E ’
>G,。
! 31 豆粕水解液的制备［;］
称取适量豆粕，加入 ) 倍质量的 1=硫酸，%) @
水浴加热 1" #。
! 3? 分析方法
! 3? 3! 葡萄糖、!"乳酸含量检测
发酵液稀释、离心后采用生物传感分析仪 .AD-
:"H测定。
! 3? 31 总酸含量检测
发酵液经稀释、过滤后，采用 IJCD 定钙法［$］测 定钙含量，根据钙与总酸的对应关系换算成总酸量。 ! 3? 3? 菌体量检测 发酵液用去离子水稀释 !" 倍，再用 " 31) >+6 ’ ( 盐酸稀释 ) 倍，采用 ;11 光栅分光光度计于 21" ,> 处测定吸光度。 " 结果与讨论 1 3! 种子培养时间对发酵过程的影响 种龄是种子质量的重要指标，不论种子扩大培 养还是发酵，种龄都应选择在生长旺盛阶段，一般是 对数生长期末期。如果种子生长过度，菌体老化，接 入发酵培养基后菌体生长缓慢，延迟期长，菌体过早 自溶；如果种子生长不足，亦会减缓菌体生长速度， 延长发酵周期。由图 ! 可见 !#$%&’#$())*+ 45 K 675 种 子生长的对数期持续约 !" #，在 1? # 菌体量达到最 高。 图 ! 乳杆菌 675种子生长曲线 LG& 3! ME+NO# P/EQR +S !#$%&’#$())*+ 453 675 实验中参照种子生长曲线，选择 !1、!)、!$、1!、
1: # ) 个不同的种子培养时间，其它条件完全相同，
发酵 ;1 #，测定 !"乳酸、残糖、菌体浓度（,-21"），结
果如图 1 所示。
—!—残糖；—"— !-乳酸；—#—菌体质量浓度
图 1 种子培养时间对发酵的影响
LG& 31 ISSRPO +S 4RRT G,P/UFOG+, OG>R +, !" 6FPOGP FPGT 5E+T/POG+,
由图 1可知，种龄 !) #，发酵液中 !"乳酸含量最
高。种龄大于 !) # 所得菌体量逐渐下降。残糖在种
龄 !) #达到最小值，减少或增加种龄残糖都有所增
加。由图 !可知 !) #处于菌体对数生长中后期，此时
菌体活性较高，所得菌体量接近最大值。因此最佳种
1"") 年 !! 月 赵 博等：乳杆菌 !#$%&’#$())*+ 45 K 675 发酵高产 (-乳酸研究 ·;)·
万方数据
龄为 !" #。
$%$ 接种量对发酵过程的影响
发酵过程中采用较大的接种量可以缩短延迟
期；但接种量过大会带入过多代谢废物。为了确定
最佳接种量，选取了 "&、!’&、!"&、$’&、$"&、
(’& ) 个不同的接种量水平，其它条件完全相同，发
酵时间 *$#，检测 !"乳酸、残糖、菌体浓度（#$)$’）， 结果见图 (。 —!—残糖；—"— !+乳酸；—#—菌体质量浓度 图 ( 接种量对发酵的影响 ,-. %( /00123 40 -5426783-45 894653 45 !" 7823-2 82-: ;<4:623-45 由图 ( 可知，随着接种量的增加，菌体量基本呈 递增的趋势，接种量小于$’&，菌体量增势缓慢；接
种量大于 $’&，菌体量增势加快。而接种量为 !"& 时发酵液中乳酸含量达到最大值；接种量大于 !"&，乳酸含量有所降低。加大接种量可以促进菌 体生长，但并不能使发酵液的乳酸含量的增长，反而 对乳酸的产生有所抑制。由此可知，最佳接种量为 !"&。$ %( 培养温度对发酵过程的影响
对于乳杆菌 !%&’()%&*++*,- =; > 7?;，实验中选取
(’、(*、@$、@"、"’ A " 个不同温度发酵，发酵结束检 测 !"乳酸、残糖和菌体浓度（#$)$’），结果如图 @ 所 示。 由图 @ 可知，乳杆菌 7?; 发酵生产 !"乳酸的最 适温度是 @$ A，此时，!"乳酸含量达到约 $’’ . B C， 菌体量亦达到最大值，残糖含量最低。 图 @ 培养温度对发酵的影响 ,-. %@ /00123 40 319;1<836<1 45 !" 7823-2 82-: ;<4:623-45$ %@ 不同酸中和剂对发酵过程的影响
乳酸发酵过程中，随着乳酸的产生，发酵液 ;D
不断下降，最终会抑制菌体生长和乳酸的进一步积
累，为此需要加入酸中和剂［E，!’］。本试验在 $C 发 酵罐中分别采用氨水、氢氧化钠和碳酸钙作为 ;D 调节剂，使发酵液 ;D 稳定在 ) %’ 左右，考察其对发 酵过程的影响，结果如图 " 所示。 —!—残糖；—"— !+乳酸；—#—菌体质量浓度 图 " 以氨水（F）、氢氧化钠（G）和碳酸钙（H）作为 ;D调节剂发酵过程曲线 ,-. %" I<40-71= 40 .7624=1 245=69;3-45，!" 7823-2 82-: ;<4:623-45 85: #$)$’ 4J38-51: -5 !" 7823-2 82-: 01<915383-45 K-3# LD(·D$M（F），L8MD
（G）85: H8HM(（H）8= ;D <1.67834<
由图 " 可知，在菌体量增值方面，以氢氧化钠为
酸中和剂时，菌体增值量较低，后期还有所下降；以
氨水为 ;D调节剂时菌体增值量较高且很快，达到
最大值后有所下降；以碳酸钙为 ;D 调节剂时，菌体
·*)· 生物加工过程 第 ( 卷第 @ 期
万方数据
增值量相对最大，且达到最大值后下降不多。糖的
消耗方面，流加氢氧化钠时，残糖降至 !" # $% 便不 再降低，说明以氢氧化钠作为 &’ 调节剂时菌体活 性较低，从而使产酸量降低；流加氨水时残糖可降至 接近零，但氨水使菌株过快生长，同样不利于产酸； 以碳酸钙为酸中和剂，当残糖降至零时，!"乳酸仍有 上升趋势，因此补加少量葡萄糖，发酵结束时 !"乳 酸生产速率还保持在较高的水平。实验结果表明， 碳酸钙更适于作为发酵过程的 &’ 调节剂，其 !"乳 酸终质量浓度可达 ()( #$ %，转化率 *+ ,-.，产率
*) ,/!.；另两者的 !"乳酸终质量浓度只有 +)) # $% 左右。 ! 结 论 以乳酸菌 !#$%&’#$())*+ 0& 1进行厌氧发酵，获得 了较高的 !"乳酸终浓度。实验优化了操作条件：接 种量 +/.，种龄 +/ 2，培养温度 "( 3。以葡萄糖为 碳源发酵 / 4，!"乳酸质量浓度超过 ()) #$ %，产率
*) ,/!.，!"乳酸占发酵液质量中总酸含量 *!.以
上。
参考文献：
［+］ 汪多仁 1 !"乳酸的开发与应用进展［5］1化工中间体，())"，（6）：
67+" 1
［(］ 钱志良，胡 军，雷肇祖 1乳酸的工业化生产、应用和市场［ 5］1
工业微生物，())+，-+（(）："*7/- 1
［-］ 刘伟雄 1乳酸和聚乳酸的最新进展［5］1食品与发酵工业，()))，
(6（-）：8+78/ 1
［"］ 9:; <=，>?; @，A:B C’1 D?479:EF2 G?HI?BE:E;JB JG !#$%&’#$())*+ )#$" %(+ GJH 2K&?H7&HJ4LFE;JB JG !" M:FE;F :F;4［5］1 9;JE?F2BJM %?EE，())-，(/： + !--7+ !-/ 1 ［/］ NBLH:42: O，PLH?02 NQ，R?BS:E?02 QR 1 P;ILME:B?JL0 0:FF2:H;G;F:E;JB :B4 G?HI?BE:E;JB JG 0E:HF2 EJ M:FE;F :F;4［5］1 THJF?00 9;JF2?I，+***， -/：-867-6/ 1 ［8］ ALB 5P，>?? A5，OKL ’>1 THJ4LFE;JB JG J&E;F:MMK &LH? !（ U ）7M:FE;F :F;4 GHJI V:H;JL0 F:HWJ2K4H:E?0 WK W:EF2 G?HI?BE:E;JB JG ,-%./&$&$$*+
0#.$#)(+ OQA+［5］1 XBYKI? =;FHJW Z?F2BJM，())-，--："+87"(- 1
［6］ 沈晓东 1脱脂豆粕酸法水解条件的研究［ 5］1江南学院院报，
()))，+/（"）：!87!! 1
［!］ 金其荣，张继民，徐 勤 1有机酸发酵工艺学［=］1北京：中国轻
工业出版社，+**6，")(7")" 1
［*］ 卢金照，高年发，杨 枫，等 1乳酸的发酵与提取耦合工艺［ 5］1
广州食品工业科技，())"，()（(）：+67+* 1
［+)］ %L4I;M: T，[?JH#K T 1 N B?\ I?E2J4 GJH &’ 0E:W;M;Y:E;JB JG E2? M:F7
EJ:F;4;F G?HI?BE:E;JB［5］1 XBYKI? =;FHJW Z?F2BJM，+**6，(+：+687+!+ 1
())/ 年 ++ 月 赵 博等：乳杆菌 !#$%&’#$())*+ 0& 1 M]& 发酵高产 %7乳酸研究 ·66·
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