全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%$ 年 & 月
生"物"加"工"过"程
38GH=-=S?FBHDE?AbG?.B?J=--LHIGH==BGHI
c?E/! 4?/#
UDB/#$%$
@?G$%$/&)+)5T/G--H/%+2# *&+2!/#$%$/$#/$$,
收稿日期$#$$) *$, *$,
作者简介$邵玲莉"%)2%#&女&山东莱阳人&讲师&研究方向$生物物质的制备与分析&L1辅酶 [
CB
产生菌发酵条件的优化
邵玲莉&石玲玲
"金华职业技术学院"生物制药技术教研室&金华 &#%$$2#
摘"要$ 对辅酶(
%$
生产菌株鞘氨醇单胞菌]Q$!$& 的发酵条件进行优化&确定发酵时间为 )$ 8&#$ 量为 &$ ,
#
#
NV
,
$ij&4D3E
$i$&j& e
#
K9V
,
$i$#j&UINV
,
$i$$j( 优化后的辅酶 (
%$
产量达到 %)# 关键词$ 辅酶(
%$
发酵优化正交试验
中图分类号$(!%""""文献标志码$;""""文章编号$%+2# *&+2!"#$%$#$# *$$%! *$
+9F.E.V5F.2/27704E0/F5F.2/:2/G.F.2/1724942G3:F.2/27,2[
CB
NK;VZGHI1EG& NK0ZGHI1EGHI
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"4K
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#
NV
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#
K9V
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B=DJ8=@ %)# GH=B=D-=@ &)i%&j >8DH >8D>FH@=B>8=?BGIGHDEJ?H@G>G?H-/
J0K L24G1$3?(
%$
A=B<=H>D>G?H ?.>GG?H ?B>8?I?HDE@=-GIH
""辅酶 (
%$
"3?(
%$
#又称为泛醌&是一种脂溶性醌
类化合物&是呼吸链中的重要递氢体&亦在动物+植
物+微生物等细胞体内与线粒体内与膜相结合&具
有抗氧化性+清除自由基和提高机体免疫力等重要
的生理作用)% *#* &近年来已被广泛应用于糖尿病+肝
炎+心脏病+癌症+帕金森症和病毒性心肌炎等疾病
的治疗)&* (
辅酶(
%$
的制备方法有动植物组织提取法+化
学合成法和微生物发酵法( 动植物组织提取法主
要是从动物的脏器或植物的组织中提取产物&辅酶
(
%$
在动植物组织中含量较低&又受原材料来源限
制&因此产品成本高&规模化生产受到一定制约化
学合成法条件苛刻+步骤繁多+副产物含量多且具
有提纯成本高等缺点( 相比之下利用微生物发酵
生产辅酶(
%$
具有不受原材料限制+分离过程简单+
生物活性好等优点而受到广泛关注( 日本在 #$ 世
纪 2$ 年代就完善了 3?(
%$
的发酵法工业化生产技
术&全球 )$j的3?(
%$
产量来自日本( 目前&国内利
用发酵法生产 3?(
%$
的产量不高&远不能满足市场
需求), *+* ( 笔者以]Q$!$& 为菌种&对 3?(
%$
的生产
进行了发酵条件的优化实验&提高了 3?(
%$
的产量&
对其实际生产具有一定的借鉴意义(
C?材料与方法
C=C?菌种
鞘氨醇单胞菌 ]Q$!$&"-24/,1&+&,"]Q$!$&#
购自中科院微生物研究所&经诱变筛选后获得(
C=@?仪器
;IGE=H>%%$$ 型高效液相色谱仪"惠普公司#(
C=M?培养基
斜面培养基"质量分数&j#$牛肉膏 $i$&&蛋白
胨 $i%&4D3E$i$&琼脂 #( .K2i#(
种子培养基"质量分数&j#$玉米浆 %&葡萄糖
#i&黄豆饼粉 #i&e
#
K9V
,
$i$#&4D3E$i$#&UINV
,
$i$$,( .K2i#(
基础发酵培养基"质量分数&j#$葡萄糖 #i&
黄豆饼粉 #i&e
#
K9V
,
$i$#& 4D3E$i$#&UINV
,
$i$$,( .K2i#(
C=P?方法
%/,/%"菌种的培养与发酵
将冰箱中保存的斜面菌种接种到新鲜斜面上
活化&&$ g静置培养 #, 8将活化后的斜面菌种接
入种子培养基&在 &$ g下以 #$$ B5养 #, 8(
从种子培养基中吸取适量种子液&按照体积分
数 %$j的接种量接种到发酵培养基后在 &$ g下以
#$$ B5%/,/#"培养基的优化
采用单因素实验及正交实验)2*确定不同 3源+
4源及无机盐的适宜浓度(
%/,/&"菌体体积分数的测定
取 %$ 条件下离心 %$ 体积( 菌体体积分数k"%$ *A上清液#5%$ l%$$j(
%/,/,"3?(
%$
的提取与测定方法
取 ) 超声波振荡 % 析)!* ( 色谱条件$#$ <柱&填料为十八烷基硅烷键合硅胶&直径为 %$
!
<
流动 相 A"甲醇#hA"无水乙醇# k& h+ 流 速
% #$
!
Z(
@?结果与分析
@=C?发酵时间的确定
微生物在发酵过程中&随着时间的延长&菌体
体积分数+形态及培养基的组成和 .K等都会发生
一定的变化&而这些变化又会对菌体的生长和产物
的形成产生直接或间接的影响( 实验以菌浓和目
的产物产量为指标&以确定 3?(
%$
的最佳发酵时间&
结果见图 %(
图 C?发酵时间对,2[
CB
产量的影响
N.;=C?#70:F27704E0/F5F.2/F.E02/,2[
CB
942G3:F.2/
""由图 % 可知$发酵前 % 8 菌体生长缓慢&从第
% 8开始到第 &$ 8 菌体进入对数生长期&之后&菌
体进入生长稳定期&这期间&3?(
%$
产量继续升高&一
直到 )$ 8后&产量已基本不再上升&并且通过镜检
发现菌体开始自溶&因此&选择最佳的发酵时间为
)$ 8(
@=@?装液量的确定
由于实验中所用菌株鞘氨醇单胞菌为专性需
氧菌&所以摇瓶中的装液量通过影响发酵介质的溶
氧水平而对菌体生长和产物合成产生一定的影响(
实验中&向 #$ 和 +$ 酵的影响&结果见图 #(
图 @?装液量对,2[
CB
产量的影响
N.;=@?#70:F2729045F.2/56H263E02/,2[
CB
942G3:F.2/
""由图 # 可知$装液量为 &$ 和3?(
%$
的产量均较高( 装液量继续增大&菌体质
量浓度和 3?(
%$
产量都会进一步降低&这可能是因
为装液量多了造成溶氧不足而影响了菌体的生长
)%
"第 # 期 邵玲莉等$辅酶(
%$
产生菌发酵条件的优化
和产物的合成(
@=M?不同,源对,2[
CB
产量的影响
3源是构成菌体细胞成分的碳架&也是代谢产
物的主要组成元素&又是提供微生物生命活动中所
需能量的来源( 葡萄糖是 3源中最容易利用的单
糖&几乎所有的微生物都能利用葡萄糖( 蔗糖+玉
米淀粉和甘油也是发酵中常用 3源( 保持基础发
酵培养基中其他成分不变&考察不同 3源对发酵的
影响&结果如图 & 所示(
图 M?不同,源对,2[
CB
产量的影响
N.;=M?#70:F27:54I2/1234:012/,2[
CB
942G3:F.2/
""由图 & 可知$甘油和蔗糖的作用较差&作为速
效 3源的葡萄糖浓度过高后会影响微生物的生长
和产物的合成&而淀粉对菌体后期代谢起了很大
的作用( 因此选择葡萄糖和淀粉搭配作为适宜的
3源(
@=P?葡萄糖和淀粉的加入量对,2[
CB
产量的影响
将葡萄糖和淀粉一起作为3源进行 3源优化&
结果见图 ,(
图 P?葡萄糖和淀粉的加入量对,2[
CB
产量的影响
N.;=P?#70:F27;63:2105/G1F54:-2/,2[
CB
942G3:F.2/
""由图 , 可知$当 % Z培养基中所含葡萄糖和淀
粉分别为 % I和 # I&即以质量分数为 %ij的葡
萄糖和 #ij的淀粉搭配作 3源最有利于 3?(
%$
的
发酵( 原因可能是质量分数为 %ij的葡萄糖能有
效地促进菌体的生长&并防止初级代谢过于旺盛&
质量分数为 #ij的淀粉能为后期的代谢提供足够
的3源(
@=S?不同$源对,2[
CB
产量的影响
4源物质主要功能是构成菌体细胞结构"氨基
酸+蛋白质+核酸等#及合成含4代谢产物( 常用的
4源有黄豆饼粉+花生饼粉+蛋白胨+ "4K
,
#
#
NV
,
等( 其中有机4源除含有丰富的蛋白质+多肽和游
离氨基酸外&还含有糖类+脂肪+无机盐+维生素及
某些生长因子&是微生物的良好营养物质&而无机4
源一般情况下可作为发酵的辅助 4源( 实验以质
量分数为 %ij的葡萄糖和质量分数为 #ij的淀
粉搭配作3源&考察不同4源对发酵的影响( 实验
结果如图 所示(
图 S?不同$源对,2[
CB
产量的影响
?N.;=S?#70:F27/.F42;0/1234:012/,2[
CB
942G3:F.2/
""由图 可知$作为速效 4源的"4K
,
#
#
NV
,
在低
浓度下发酵效果较好&浓度升高后由于其对菌株代
谢的抑制作用&目的产物的产量反而降低&而黄豆
饼粉正好与之相反&因此选用"4K
,
#
#
NV
,
和黄豆饼
粉搭配作为适宜的4源(
@=U?黄豆饼粉和"$"
P
#
@
!+
P
的加入量对 ,2[
CB
产
量的影响
""将黄豆饼粉和"4K
,
#
#
NV
,
结合作为 4源进
行实验&考察其加入量对发酵单位的影响( 其中
供试的黄豆饼粉和 "4K
,
#
#
NV
,
的水平如表 %
所示(
极差分析表明$因素 ;对实验指标的影响大于
因素b&而根据其 E值的大小可知&;"黄豆饼粉#+
b""4K
,
#
#
NV
,
#质量分数各为 #ij+$ij时&菌体
生长及3?(
%$
的合成情况最好(
$# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 C? 黄豆饼粉+"$"
P
#
@
!+
P
\]"M
P
#正交实验
D5I60C?D-024F-2;2/56F01F27I05/:5O05/G"$"
P
#
@
!+
P
实验号
因素
;
9"黄豆饼粉#5j
b
9""4K
,
#
#
NV
,
#5j
%
"3?(
%$
#5
"*%
#
% "% "#i$# "% "$i,# "%%2
# "% "# "$i# "%#%
& "% "& "$i+# "%#
, "# "#i# "% "%&%
"# "# "%+#
+ "# "& "%,$
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%
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#
"%,,i& "%&)i&
E
&
"%#!i& "%&#i$
3 " #&i& " %2i$
@ X^?无机盐的加入量对,2[
CB
产量的影响
在确定了3源+4源种类和浓度的基础上&通
过正交实验&考察无机盐对 3?(
%$
发酵的影响( 其
中各因素的水平如表 # 所示( 结果表明&e
#
K9V
,
+
4D3E+UINV
,
质量分数各为 $i$#j+$i$&j+$i$$j
时&最有利于3?(
%$
产量的提高(
""通过以上一系列的单因素及正交实验&确定了
适宜的发酵时间为 )$ 8 较装液量为 #$ 中加入 &$ "质量分数#$葡萄糖 %ij+淀粉 #ij+黄豆饼粉
#ij+ "4K
,
#
#
NV
,
$ij+4D3E$i$&j+ e
#
K9V
,
$i$#j+UINV
,
$i$$j&在此条件下进行摇瓶发酵&
最终的发酵单位可达 %)# 养基3?(
%$
产量仅有 %&! %$
的
产量提高了 &)i%&j(
表 @?无机盐的\]"MP#正交实验
D5I60@?D-024F-2;2/56F01F27./24;5/.:156F"J
@
"_+
P
+$5,6+ A;!+
P
#
实验号
因素
9"e
#
K9V
,
#5j
9"4D3E#5j
9"UINV
,
#5j
%
"3?(
%$
#5"*%
#
% % "$i$%# % "$i$## % "$i$$,# %%+
# % # "$i$&# # "$i$$# %&+
& % & "$i$,# & "$i$$+# %#!
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M?结?论
以经过传统诱变的菌株 ]Q$!$& 为发酵菌种&
对辅酶 (
%$
合成的影响因素如发酵时间+摇瓶装液
量+3源种类和浓度+4源种类和浓度+无机盐种类
和浓度等进行了探讨&在优化后的培养条件下&辅
酶(
%$
的产量达到了 %)# 高了 &)i%&j(
参考文献$
)%*"P?EX=B-e& _?EDHGFX ;/ =^-=DBJ8 ?H J?=H7W<=(
%$
GH JEGHGJDE
<=@GJGH=DH@ GH G<G?H )S*/\BFI-L[. 3EGH =^-&
%#
"第 # 期 邵玲莉等$辅酶(
%$
产生菌发酵条件的优化
%)!&%%$&)1,/
)#*"顾觉奋&陈光明&李淑珍/微生物转化法合成辅酶 (
%$
)S*/药
学进展&#$$%&#"+#$&&)1&,&/
RF SF=A=H&38=H RFDHI8=-G-?A3?(
%$
6WBDH-A?BG?H)S*/9B?I98DB"+#$&&)1&,&/
)&*"P?EX=B-e&V->=B6?BI;&_F QFAF/;J>GCG>G=-?ACG>D%$
GH DH1
GG=H>-YG>8 JDHJ=B)S*/
bG?J8=),*"袁静&魏泓/微生物发酵生产辅酶(
%$
的研究进展)S*/氨基酸
和生物资源&#$$,&#+"%#$#1,/
]FDH SGHI& _=GK?HI/ =^J=H>.B?IB=--?A3?(
%$
.B?@FJ>G?H 6W
D>G?H )S*/;GJ =^-?FBJ=-&
#$$,&#+"%#$#1,/
)*"蒋世云&余龙江&简艳/沼泽红假单胞菌 S$$% 产辅酶 (
%$
摇瓶
发酵条件优化)S*/中国生物工程杂志&#$$!&#!")#$!)1)!/
SGDHIN8GWFH& ]F Z?HITGDHI& SGDH ]DH/V.>GG?H ?A-8DXGHI1
AED-X JFE>FB=J?H@G>G?H-A?B3?(
%$
.B?@FJ>G?H 6W34&%&2"#$%&+&,"
2($)*/"S$$%)S*/38GHDbG?>=J8H?E?IW&#$$!&#!")#$!)1)!/
)+*"吴祖芳&堵国成&陈坚/放射性根瘤菌 _NK#+$% 生产辅酶 (
%$
的摇瓶发酵条件)S*/无锡轻工大学学报&#$$&&##$+1+)/
_F QFADHI&\F RF?J8=HI&38=H SGDH/3?=H7W<=(
%$
-8DXGHI1AED-X
JFE>FB=J?H@G>G?H-6W34/B&<$"*%/&<@)#*/$+_NK#+$%)S*/S?FB1
HDE?A_F[GOHGCZGI8>0H@& #$$&&##$+1+)/
)2*"吴有炜/试验设计与数据处理 )U*/苏州$苏州大学出版
社& #$$#/
)!*"李万仓&郑宏燕&张惠娟&等/高效液相色谱测定构树叶中辅酶
(
%$
含量)S*/营养学报&#$$!&&$",#$,%21,%)/
ZG_DHJDHI& Q8=HIK?HIWDH& Q8DHIKFGTFDH& =>DE/\=>=B>G?H ?AJ?=H7W<=(
%$
GH F*&$"&,#)/ 220*/7#* 6W8GI8 .=BA?B<1
DHJ=EGaFG@ J8B??IBD.8W)S*/;J>D4F>BG<=H>DNGHGJD& #$$!&&$
",#$
$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
,%21,%)/
国外动态
英研究发现可用真菌降解聚氨酯塑料
""据英国曼彻斯特大学的杰夫!罗布森博士在美国.应用与环境微生物学/杂志上报道&他们将聚氨酯塑
料埋入含有某些真菌的土壤&结果发现&随着塑料的降解&真菌的数量有所增加&这说明这些真菌能以聚氨
酯塑料为食( 进一步的实验显示&如果增加土壤中的养料以增强真菌活性&或者直接加入在别处培养的真
菌&都会明显加快聚氨酯塑料的降解速度( 这项研究说明&可以利用真菌有效分解废弃的聚氨酯塑料&而不
是简单地将其燃烧或填埋( 他们正在开展进一步研究&以确保这一降解过程中产生的副产品不会危害环境(
""LHC=BI=H>公司在夏威夷建生物质制汽油装置
""霍尼韦尔旗下的OV9公司和LH-WH技术公司的合资企业LHC=BI=H>技术公司于 #$%$ 年 # 月 #$ 日宣布&
他们得到美国能源部 # $$ 万美元的资助&将组合?用LH-WH技术公司的快速热加工"^`9# 技术与OV9公
司的加氢专项技术来加工宽范围的纤维素原料&包括农业残余废弃物+废纸+木质生物质+海藻和专用能源
作物&如换季木草和甜高梁秸秆( 将在美国夏威夷州eD.?E=G建设从纤维素生物质制取运输燃料汽油装置&
该装置将于 #$%, 年投运&每年可使生物质转化成燃料约 !i& 万Z&其主要是汽油&并含有少量柴油燃料(
""法国利用植物光合作用开发出新型生态电池
""据法国国家科研中心的研究人员在美国.分析化学/杂志上报道&他们利用植物光合作用产生的物质开
发出一种新型生态电池( 研究人员通过仙人掌进行了相关实验&结果发现&一旦仙人掌发生光合作用&生态
电池就会产生电流( 这个实验不但能即时观测到植物的光合作用&还提供了开发生态新能源的可能(
""日本今年正式投产生物燃料汽油
""日本石油公司计划 #$%$ 年在西日本 & 个炼油厂正式生产生物燃料汽油&产量预计占该公司总产量一半
以上( 并在全国设置 # $$$ 个配套加油站(
""生物燃料汽油是将甘蔗秆或麦秸等发酵制成生物乙醇&将 ,&j生物乙醇与 2j天然气混合制成生物汽
油添加剂"L`bL#&再与 ))j的汽油混合成生物燃料汽油( 因其3V
#
排放小前景看好(
"文伟河#
## 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"