全 文 ：第6卷第4期
2008年7月
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessEn舀neering
JuJv2008
· 31 ·
胃蛋白酶水解绿豆分离蛋白的工艺
徐 娟，袁艳娟，屠春燕
(南京工业大学 制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：选用胃蛋白酶对绿豆分离蛋白进行酶法水解，考察了原料预处理条件、pH、温度、底物浓度等对酶解的影
响，结果表明：原料预处理最适条件为沸水浴中90℃处理20miII，在37℃、pH1．8、底物质量分数7％、酶量6000
U／g条件下酶解180min，水解度(DH％)为19．86％，达到了制备小肽的水解度要求。实验证明，经过水解，绿豆分
离蛋白各功能特性得到很好的改善。
关键词：酶法；水解；绿豆；胃蛋白酶；蛋白质
中图分类号：Q946．1 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008J04— 03l—05
PreparationofoUgo-peptidebypepsinhydrolyzation
ofprotei璐isolatedfrommungbean
XUJu肌，YUANYan-juan，TUChun-yan
(CollegeofL施Science锄dPh舳眦c即ticalEn百咖riIIg，NanjiIIgUIl ve璐i哆0f’I镜hnolog)r，Nanjill9210009，Cllim)
Abs咖ct：Aprep锄tionmet}Iodf roligo-peptidebypepsinehydrolyzationofi∞latedmungbe觚pmteim
w鹊investigated．Anoptimumco diti伽w鹊defined诵tllthein exofhydrolysisdegree．Theproteins
werepretl．ealedat95‘℃for20min．Under蛐optimumhydrolyticconditio璐onpmteincoIlcen咖tionof
7％，enzylⅡe鲫bst阳teratioof6000U／g，temperature37℃，pHof1．8，龃dhydrol”ict meof4h，
tlleobtainedhydrol”icdegreeof咖ngbeanproteinw鸹19．86％．
Keyw吖ds：eIlz)，IIl“c；hydrolysis；mungbe锄；pepsin；pr；otein
绿豆营养成分全面，富含蛋白质、糖类、多种微
量元素和人体必需维生素，其中蛋白质质量分数高
达19．5％～33．1％，比禾谷类籽粒高2—3倍，蛋白
质功效比高，且氨基酸种类齐全。大多数必需氨基
酸化学评分超过wHO和FAO推荐值，赖氨酸含量
很丰富，可补充禾谷类特别是玉米中赖氨酸的不
足¨J。目前对绿豆的利用大多数还停留在传统的
淀粉粗加工上，忽略了绿豆蛋白等其他成分的开
发，造成资源浪费旧1。
食用蛋白质类食物主要经消化道酶促水解后，
以小肽的形式被吸收，比完全游离氨基酸更易、更
快地被机体吸收和利用旧一J。绿豆分离蛋白经水解
制成的低分子肽混合物，其氨基酸结构几乎完全与
绿豆蛋白一样，必需氨基酸平衡良好，含量丰富。
由于绿豆肽分子相对质量小，水溶性很高，因此，作
为食品原料，具有低黏度、速溶和无残渣等特点，能
够调整蛋白质食品的硬度、改善口感、促进微生物
生长发育和活跃代谢作用等特性。
收稿日期：2007旬3．30
作者简介：徐娟(1982-)。女。江苏南京人，硕士研究生，研究方向：生物化工。
联系人：屠春燕，女，副研究员，E·mIiI：tcy734l@126．咖。
万方数据
·32· 生物加工过程 第6卷第4期
1材料与方法
1．1 主要试剂及试验材料
绿豆种子：市售；胃蛋白酶(固态)：1500 0U／g，
最适pH1．5—3．0，温度30一50℃，Novo公司；茚三
酮、NaOH、无水乙醇、磷酸盐等均为分析纯。
1．2主要仪器
PHsJ-3F型pH计：上海雷磁仪器厂；分析天平：
上海天平仪器厂；离心机：美国Beckm肌公司；752
型分光光度计：Spectmmlab公司。
1．3实验方法
1．3．1绿豆分离蛋白的提取
绿豆种子洗净，温水浸泡至豆皮表面有
80％一90％破裂，去皮，子叶匀浆，稀释，将稀释液
调pH至10．0，充分搅拌后以8000r／min离心
20min，取上清液，沉淀物加水溶解后调pH至
10．0，同样方法再次离心，得到的上清液与前次上
清液合并，调pH至4．6，离心，取沉淀进行冷冻干
燥，即绿豆分离蛋白。
1．3．2蛋白质测定(Bradford法)
蛋白质测定用文献[5]方法。
1．3．3酶活力测定(福林酚法)
酶活力测定同文献[6]。
1．3．4水解度(DH％)的测定(茚三酮法)"1
水解度DH％=(nh一～)／(厅总一‰)×100％
式中：凡。为不同时间酶解液中的总游离一NH：的摩
尔数，m脚l；‰为原料蛋白中固有的游离一NH：的摩
尔数，姗ol；n总为原料蛋白强酸水解后的总游离
一NH2的摩尔数，I砌olo
1．3．5酶解反应
以pH7．0的磷酸缓冲液配制一定浓度的绿
豆分离蛋白溶液，调节pH至实验设定值，在实验
设定的温度加入反应所需的酶，同时低速充分混
匀。反应过程中以1moL／L的Na0H溶液严格控
制酶解液的pH，每隔一定时间取一定量酶解液，
以100℃沸水浴加热10min进行灭酶，再以等体
积比加入三氯乙酸(TcA)，10％并放置于60℃
水浴中加热10min将未反应完全的蛋白质和大
分子肽沉淀，用10ooor／min的转速离心15min，
取上清液，定容，用茚三酮法进行显色计算水
解度。
2结果与讨论
2．1酶解前预处理¨1
天然植物蛋白分子具有紧密的立体结构，肽链
卷曲于蛋白质分子的内部，很难被蛋白酶水解，可
以通过对其进行预处理，使包藏于分子内部但易与
酶发生作用的部位暴露出来，从而增加酶解的作用
点，提高酶解速度。蛋白变性方法有很多种，其中
热处理法具有经济、设备投资少，且经过热处理的
蛋白质不易复性等优点而广泛使用。
实验研究了不同的预处理温度和时间对绿豆
蛋白水解度的影响，结果见图1、2。由图1、2可见，
水解度随着预处理温度升高和时间的延长而增大，
但到达某一定值后即明显下降。这可能是由于温
度过高引起原本已打开的二硫键和疏水键又再生，
使得蛋白质结构变得反而紧密，阻碍了酶解的进
行，使水解度降低。通过比较，选择预处理温度为
95℃、预处理时间为20min对水解有利。
16
12
皂8
。
4
O 20 40 60 80 100 120
t(酶解)／IIlin
图l预处理温度对水解度的影响
Fig．1EⅡ碗toftlletempemtu托0fh朗ltreatment
∞hydmlyBis(DH)
图2预处理时间对水解度的影响
fk．2E丘＆toftIIetimeofhemt陀咖ent
叩hydmly8is(仉)
万方数据
2008年7月 徐娟等：胃蛋白酶水解绿豆分离蛋白的工艺 ·33·
2．2 pH对水解度的影响
pH对酶促反应影响的原因是多方面的。不适
的酸碱环境可使酶空间构象改变，最终导致酶可逆
或不可逆失活，并且pH的差异决定了底物分子及
酶的解离状态，影响他们的结合，从而影响蛋白的
水解程度。
实验在胃蛋白酶的最适工作pH范围内，研究
了不同pH缓冲值对酶水解的影响(图3)。结果表
明在此条件下胃蛋白酶最适pH为1．8。
t(酶解)，Ⅱin
底物质量分数9％，酶量6∞Ou／g，温度37℃
图3 pH对胃蛋白酶水解的影响
Fig．3E踮ct0fpHValue叩pep8inhydmly8i8
2．3温度对水解度的影响
温度对酶催化反应影响的原因主要有两个方
面：一是温度对蛋白酶稳定性的影响，即对酶热变
性失活作用；二是温度对酶催化反应本身的影响。
在胃蛋白酶的工作温度范围内，考察温度对酶解的
影响，结果见图4。由图4可见胃蛋白酶水解绿豆
分离蛋白的最适温度为37℃。
作用越频繁。随着[s]的减少(即∥5增加)，底物
相对于酶的浓度减少。当底物浓度小到一定程度
时，酶的数量就趋于过剩，单位时间内一部分酶分
子不与底物结合，造成水解程度增加变缓慢。
实验于pH1．8，37℃，酶量6000u／g条件下对
不同的底物浓度进行研究，结果表明，底物质量分
数为7％时水解度相对较高(图5)。因此确定底物
质量分数为7％。
37℃，pH1．8，酶鼍6000U／g
图5底物质量分数对胃蛋白酶水解的影响
Fig．5髓&t0fsubstrateconce曲嘶叩
伽p叩sinhydmlysis
2．5酶量对水解度的影响
在蛋白质的酶解实验中，酶用量的增大可以增
加酶与底物之间结合的几率，从而增强水解程度。
当酶量增加到一定值后，上升的趋势减缓。因此，
对于酶的添加量需要进行权衡。实验考察了不同
的酶加入量对水解度的影响，结果如图6所示。由
图6可见，水解度与加入的酶量成正相关性，然而
10000U／g相对于6000U／g的增加比例为6000U／
g相对于3000u／g的增加比例的1／3，考虑到经济
指标，选择酶量为6000U／g。
16
12
8
§4
底物质量分数9％，酶量6000U／g，pH1．8
图4温度对胃蛋白酶水解的影响
Fig．4E‰t0ftempera￡u陀蚰pepsinhydmlysis 0
2．4底物浓度对水解度的影响
过高的底物浓度易造成水解液黏度增大，影响
蛋白酶的扩散，对水解反应有抑制作用。在底物浓
度一定的时候，理论上酶分子越多则酶与底物之间
50 100 150 200 250
t(酶解)，min
pH1．8，37℃，底物质量分数为7％
图6酶量对胃蛋白酶水解的影响
Fig．6E妇6ect0fenzyr酹c叩c即岫舡伽
∞pepsinhydmlyBis
万方数据
· 34· 生物加工过程 第6卷第4期
2．6正交实验设计优化胃蛋白酶水解条件
由于在水解过程中，几个单因素右间会有相互
依赖和影响，因此根据单因素实验，选择温度、pH、
底物浓度([S])和酶量(∥S)进行四因素、三水平
(L9(34))的正交试验。水解时间为240min。正交
结果及分析见表l～3。
表l 胃蛋白酶正交试验的因素水平设计(k(34))
’rable1 De8咖0ffl址t岫胁dlevels0f0nllogo砌
e耻rimentforpepsin(k(34))
水解度和经济因素，最终选择6000U／g为适宜酶量。
反应条件以37℃，pH1．8，底物质量分数7％最为
合适。照此条件进行重复实验，水解度平均值
达19．86％。
2．7功能特性的测定结果p。1¨
对酶水解得到的混合肽进行功能特性测定，结
果见表4。经过酶解各功能特性均得到改善。
表4蛋白及水解液的功能特性
’‰le4 Functioflalp呷硎es0fpmteiIl明dhydrolysate
表2胃蛋白酶正交试验结果 3 结 论
Table2 Resul协oftheorth090nalexperimem0fp p8in
裹3胃蛋白酶正交试验结果分析
’I砌e3 AIlalysisoftlle托suhsof岫orth090砌experi眦nt
由表3可知，影响水解反应的主次关系为：酶用
量大于反应温度大于pH大于底物浓度。酶量10000
U／g时的水解度只比6000U／g时高出3．95％，兼顾
对胃蛋白酶酶解绿豆分离蛋白的水解条件进
行了探讨，其最适条件为：温度37℃，pH1．8，底物
质量分数7％，酶量6000U／g，水解时间为4h。经
过酶解，绿豆分离蛋白的溶解度、起泡性及泡沫稳
定性、乳化性及其稳定性以及苦味都得到明显改善。
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2008年7月 徐娟等：胃蛋白酶水解绿豆分离蛋白的工艺 ·35·
基因研究新发现有望破解“能源与人争粮”难题
现行生产工艺条件下，人们只有选用玉米、甘蔗等较易分解为糖类的作物作为生物乙醇的生产原料，而
富含纤维素的木材、秸秆等，却因为缺乏将纤维素高效转换成糖类的方法而无法作为大规模工业生产生物
乙醇的原料。这导致了“能源与人争粮”的矛盾，尤其在全球粮食供应日益紧张的今天，更成为发展生物燃
料的一个瓶颈。
来自丹麦诺维信公司和美国洛斯阿拉莫斯国家实验室等的科学家在英国《自然·生物工艺学》杂志上
撰文介绍说，他们借助于破译里氏木霉基因组所获得的数据分析发现，里氏木霉有一些基因能够编码产生
一种特殊的酶，这种酶能够帮助把植物纤维素高效分解成单糖物质——生产生物乙醇的极佳中间原料，这
一成果可能使生物燃料遭遇的“能源与人争粮”难题得到破解。与其他同类真菌相比，里氏木霉在促成纤维
素转换成单糖的同时，只有很少的基因会编码生成“吞噬”纤维素的酶，这样使得纤维素转换成单糖相对
高效。
(朱宏阳)
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