全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
9=QCJ(JTDIOCBEDN\QD)ODHJ((@CMQCJJOQCM
2DE*! -D*#
B`O*#$%%
KDQ"%$*&!7!:e*Q((C*%78# 6&783*#$%%*$#*$$8
收稿日期"#$%$ 6$8 6$
基金项目"国家高技术研究发展计划#37& 计划$资助项目##$$3YY%$V&&3$
作者简介"王"欣#%!3&%$&女&河北保定人&硕士研究生&研究方向"生物化工(毛忠贵#联系人$&教授&博士生导师&@FPBQE"PBD酒精 沼气双发酵耦联工艺中 !+@ T
P
的控制
王"欣&张成明&姜"立&陈"程&张建华&毛忠贵
#江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室&无锡 #%0%##$
摘"要"45# 6
0
是,酒精 沼气双发酵耦联工艺-稳定运行的重要抑制物 在耦联工艺中&以中温厌氧出水代替自来
水配料进行酒精发酵 通过无预糖化工序的,同步糖化发酵-技术研究&将酒精发酵的初始 ).提高到 7j$&.
#
45
0
的消耗降低了 $g&使 45# 6
0
的质量浓度维持在 & M:U的沼气发酵安全范围内 在进行高浓度酒精发酵时&糖化酶
的添加量为每克木薯添加 %0$ S&发酵 0 =&最终酒精体积分数达 %0j8g 糖化酶添加量与常规酒精发酵用量相
比&每克木薯增加了糖化酶 #$ S
关键词"木薯(燃料乙醇(同步糖化发酵(硫酸
中图分类号"d+!#$*%""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$&& 6$7
!+
@T
P
:2/E426./0E-5/26FJ0E-5/0:23960H942:011
RY-W1QC&V.Y-W9=JCMPQCM&T,Y-WUQ&9.@-9=JCM&V.Y-WTQBC=IB& Y`5V=DCMMIQ
#_JXUB;DOBADOXDN,CKI(AOQBE\QDAJH=CDEDMXDNA=J` QCQ(AOXDN@KIHBAQDC&4H=DDEDN\QDAJH=CDEDMX&TQBCMCBC SCQZJO(QAX&RIGQ#%0%##&9=QCB$
*K1E45:E"45
# 6
0
Q(BC QP)DOABCAQC=Q;QADOX(I;(ABCHJNDOA=J(AB;EJD)JOBAQDC DNA=JJA=BCDEFPJA=BCJHDIF
)EJK )ODHJ((*,C A=JHDI)EJK )ODHJ((&A=JPJ(DA=JOPBEBCBJOD;QHJNEIJCA&QC(AJBK DNAB) LBAJOLB(I(JK NDO
PJKQIP)OJ)BOBAQDC DNA=JJA=BCDENJOPJCABAQDC*d=JKD(BMJDN(IENBAJOJKIHJK $g A=ODIM= JEJZBAQCMA=J
QCQAQBEPJKQIP).AD7j$ QC A=J(QPIEABCJDI((BHH=BOQNQHBAQDC BCK NJOPJCABAQDC LQA=DIA)OJF(BHH=BOQNQHBF
AQDC&OJ(IEAQCMQC A=JHDCHJCAOBAQDC DN(IENBAJBA& M:U&QALB((BNJADA=JPJA=BCJNJOPJCABAQDC*,C A=JZJOX
=QM= HDCHJCAOBAQDC JA=BCDENJOPBABAQDC&A=JKD(BMJDNMEIHDBPXEB(JLB(%0$ S:MHB((BZB&NJOPJCABAQDC
AQPJLB(0 =&BCK A=JNQCBEJA=BCDEHDCHJCAOBAQDC LB(%0j8g #Z:Z$*,C A=JD)AQPQHDBPXEB(JKD(BMJQCHOJB(JK #$ S:MHB((BZBHDP)BOJK LQA= A=BAQC A=JAOBKQAQDCBE)ODHJ((*
L0M I24H1"HB((BZB( NIJEJA=BCDE( (QPIEABCJDI((BHH=BOQNQHBAQDC BCK NJOPJCABAQDC( (IENBAJ
""木薯原料生产乙醇的过程中产生大量蒸馏废
液&已成为制约燃料酒精进一步发展的瓶颈&很多
学者对酒精蒸馏废液直接回用工艺进行了广泛的
研究*% 6+ 但是&由于废液直接回用存在许多问题&
目前工业规模上直接回用水平只能达到 #$g h
&$g&大部分的蒸馏废液仍然需要,厌氧好氧-处理
后才能排放 针对以上问题&笔者所在实验室提出
了,酒精 沼气双发酵耦联工艺- *7 68+ #图 %$&并且已
经取得了较好的效果*3 6%$+ 此技术路线既能在工
艺内部解除废水污染的困局&并且摈除好氧处理工
艺&还能节约大量的水资源
""中温厌氧消化液的 ).为 8j7 h3j#&能提高厌
图 C?酒精沼气双发酵耦联工艺流程
U.;=C?U62I:-54E27E-00E-5/26FJ0E-5/0:23960H942:011
氧反应器的抗酸化能力&却导致在酒精发酵前下调
).至 0j$ h0j# 的过程中使用较多的.
#
45
0
45
# 6
0
虽然对酒精发酵没有干扰&但对后续的沼气发酵会
产生影响 在厌氧环境中&45# 6
0
被逐步还原成.
#
4&
到一定浓度时将对甲烷菌系产生毒害作用*%%+ &从而
降低了有机酸向甲烷转化的速率&致使厌氧出水中
的乙酸)丙酸等小分子有机酸浓度上升&而小分子
有机酸含量较高时会对酵母的生长产生抑制
作用*%$&%# 6%&+
""本文拟通过提高预糖化 ).&减少 .
#
45
0
添加
量&以降低 45# 6
0
对厌氧沼气发酵的负面作用 但是
,预糖化工序-是酒精发酵最易引入杂菌的环节&提
高预糖化的 ).将大大增加杂菌污染的风险 如果
去除预糖化工序&将糖化酶与酵母同时接入发酵
罐&形成,同步糖化发酵-的酒精生产技术&既能消
除高 ).下染菌机率增加的担忧&又能减少操作步
骤&简化工艺*%0 6%+ 因此&本文将研究无预糖化工
序的,同步糖化发酵-技术
C?材料与方法
CNC?材料
%j%j%"原料
""木薯&河南天冠企业集团有限公司
%j%j#"菌种
""菌种为市售安琪耐高温活性酿酒干酵母
%j%j&"主要试剂和药品
""液体耐高温
!
淀粉酶##$ $$$ S:PU$)液体
糖化酶#%&$ $$$ S:PU$&无锡杰能科生物工程有
限公司产品(其他试剂均为分析纯或优级纯的商
品试剂
%j%j0"种子培养基#M:U$
""葡萄糖 #$&酵母膏 3*&-.
0
9E%j&& M`45
0
!8.
#
5
$j%&9B9E
#
$j$7 ).自然&$j$3 >`B灭菌 % PQC
CN@?实验方法
%j#j%"种子培养
""接一环生长良好的斜面酵母至 #$$ PU种子培
养基中 k)%$$ O:PQC培养 #0 =
%j#j#"液化
""将木薯粉碎&过 $j0 PP筛子&称取 7$ M木薯
粉于 #$ PU三角瓶中&按质量体积比 %i#j# 的料水
比用 %&# PU中温厌氧出水调浆&测量拌料前后的
).&并用 #g .
#
45
0
溶液调节 ).到 7*$&记录.
#
45
0
的使用量&按 %$ S:M木薯粉的比例加入耐高温
!
淀粉酶&于沸水浴中液化 % =
%j#j&"糖化
""将 %j#j# 中得到的液化液在 %#% k下灭菌 #$
PQC&冷却至 7$ k&用 #g.
#
45
0
调节料液至所需
).&记录 .
#
45
0
使用量&并按实验所需添加糖化酶
进行糖化
%j#j0"发酵
""将糖化液冷却至 &$ k并接入 %$g酵母种子
液&$j%g尿素#-源$&放入恒温培养箱中&&$ k静
置培养 0 =&间歇振荡 每隔 7 = 测定一次发酵三
角瓶的总质量&其减少量为总的质量损失&即为95
#
释放量
CNO?分析方法
%j&j%"糖化酶活力测定
""按W\3#87%38 测定糖化酶活力
%j&j#"酒精含量测定
""采用蒸馏法测定酒精含量*%7+
%j&j&"还原糖测定
""采用斐林试剂法测定还原糖*%7+
%j&j0"总糖测定
""用 #g.9E于沸水浴中水解试样 # =&中和后按
还原糖测定方法测定
%j&j"酸度测定
""采用酸碱滴定法测定酸度*%7+ &酸度定义为滴定
%$ PU醪液所消耗 $j% PDE:U-B5.的体积
%j&j7"甘油)乙酸)乳酸含量测定
""采用高效液相色谱法测定甘油)乙酸)乳酸含
量 色谱条件"美国 Q^DCJGSEAQ`BAJ&$$$ .>U9&日
本 4=DKJGb, %$% 示差折光检测器&\QDFbBK .>1F
38 .离子交换柱&柱温 7$ k&流动相 $j$$ PDE:U
稀.
#
45
0
&流速 $j7 PU:PQC&进样量 #$
"
U
0& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
@?结果与讨论
@NC?预糖化和发酵初始9"对酒精发酵的影响
""传统的酒精发酵工艺一般在 ).0*$ h0*# 进行
糖化和发酵&因为在此 ).范围内既能保证较高的
糖化酶酶活&又能抑制以乳酸菌为代表的杂菌的生
长*%8+ &但是为了防止在耦联工艺的糖化工序中引入
过多的 .
#
45
0
&考虑通过提高预糖化 ).以减少
.
#
45
0
的使用量 但是提高 ).将易使糖化酶处于
欠佳的活性范围内&故研究预糖化和发酵初始 ).
对酒精发酵的影响
""按 %j#j# 所述方法得到的液化液降温至 7$ k&
用 #g.
#
45
0
分别调节料液 ).到 7*$)*)*$ 和
0*$#对照$ 然后按每克木薯 %#$ S的比例添加糖
化酶&糖化 &$ PQC 糖化结束后&降温至 &$ k&接入
%$g的种子液&静置培养&实验结果如表 % 所示 由
表 % 可知"初始 ).的提高对高浓度酒精发酵结果
基本无影响&副产物甘油含量有小幅的升高&总残
糖含量和残还原糖均在正常范围内
表 C?初始9"对酒精发酵的影响
D5K60C?#70:E127./.E.569"2/0E-5/26704J0/E5E.2/
初始 ). &#酒精$:
g
"
#甘油$:
#M!U
6%
$
"
#总
残糖$:
#M!U
6%
$
"
#残
还原糖$:
#M!U
6%
$
0j$ %0j3 !j&# %j0 %j0
j$ %0j8 !j07 %0j3 %j3
j %0j3 !j% %0j3 %j#
7j$ %0j8 !j73 %j7 #j%
""由于糖化酶的最佳作用 ).为 0j$ h0j&理论
上&初始 ).调整到 7j$ 时&糖化过程会受到影响&
进而影响酒精发酵&但是通过对酒精发酵过程中的
).检测发现&发酵液的 ).在前 %# = 迅速下降#图
#$&在 3 =时 ).已下降至 0j$ h0j0&进入糖化酶的
最佳作用 ).范围&从而确保了糖化过程的顺利进
行 因此&在预糖化初始 ).为 7j$ 时&酒精发酵不
会受到影响 V=BD等*%3+报道了发酵过程中类似的
).变化情况&并表明"发酵液 ).的下降是由酵母
代谢生成的有机酸外泄造成的(而随着发酵的进
行&发酵液中高浓度的酒精造成部分酵母死亡&酵
母胞内氨基酸等物质的溢出&使发酵液的 ).上升
""由图 # 可知"随着预糖化初始 ).的上升&初始
还原糖逐渐减少&这是由于糖化酶活力随着预糖化
图 @?初始9"对发酵过程中还原糖和9"变化的影响
U.;=@?#70:E127./.E.569"2/40H3:./; 13;545/H9"27
J51-01H34./; 0E-5/26704J0/E5E.2/
).的上升而下降 发酵 7 = 时&还原糖含量比发酵
起始时有不同程度的升高&说明在这段时间内&糖
化作用的速率高于酒精发酵的耗糖速率&同时也说
明&即使在初始 ).为 7j$ 条件下&酒精发酵也不受
影响
""实验结果表明"初始 ).在 0j$)j$)j 及 7j$
时&均可以使高浓度酒精发酵正常&初始 ).的提高
不影响酒精的正常发酵&为了最大程度减少 45# 6
0
的
添加量&确定初始 ).为 7j$
@N@?酒精发酵中"
@
!+
P
使用量分析
""酒精 沼气双发酵耦联工艺中&45# 6
0
主要是由
木薯原料在液化和糖化过程中引入的&在各初始 ).
下对液化和预糖化前使用的 .
#
45
0
进行了定量分
析&结果如图 & 所示
""由图 & 可知"由于中温厌氧出水的缓冲作用使
得液化结束时 ).升高&故需要再添加少量的.
#
45
0
调节 ).到液化初始 ).7j$ 随着 ).的降低&醪
液中引入的 45# 6
0
逐渐增多&对照组添加的 45# 6
0
质
量浓度为 &j!3 M:U&而 ).7j$ 时 45# 6
0
质量浓度为
%j!! M:U&为对照组的 $g 有资料表明少量 45# 6
0
对厌氧沼气发酵也是有益的&少量的硫化物能够维
持较低的氧化还原电位从而利于甲烷菌的生长&硫
酸盐还原菌也能降解丙酸&减少丙酸的积累*%!+ 经
笔者前期酒精沼气双发酵循环 #$ 批次实验证明"醪
&
"第 # 期 王"欣等"酒精 沼气双发酵耦联工艺中 45# 6
0
的控制
图 O?不同初始9"条件时发酵醪中!+@T
P
的质量浓度
U.;=O?,2/:0/E45E.2/27!+
@T
P
./E-0J51-3/H04H.7040/E
./.E.569":2/H.E.2/1
液中的 45# 6
0
质量浓度降低到 & M:U以下&沼气发酵
较为安全&不会对双发酵耦联工艺的运行构成
危害*3+
@NO?同步糖化发酵工艺的研究
#j&j%"糖化酶稳定性
""取适量经过稀释的糖化酶在 ).7*$)不同温度
下保存&然后以质量分数 #g的可溶性淀粉溶液为
底物&在乙酸 乙酸钠缓冲体系中&定时测定糖化酶
酶活&结果如图 0 所示 由图 0 可知"在 &$ k时糖
化酶的稳定性较强&失活率低&在 %3 = 时糖化酶相
对酶活在 !0g左右(而在 7$ k糖化酶的稳定性较
差&在 7 =时相对酶活仅为 #g&失活率高
图 P?不同温度下糖化酶的稳定性
U.;=P?%63:25JM65101E5K.6.EM 5EH.7040/EE0J9045E3401
""上述研究已经证明&在酒精发酵初期&).能迅速
降低到糖化酶的最佳作用 ).范围&且图 0 表明在发
酵温度 &$ k时糖化酶可以稳定持久地发挥作用&所
以可以革除糖化工序&形成,同步糖化发酵-的酒精
生产技术&以降低高 ).下染菌的几率
#j&j#"糖化酶添加量的优化
""因为酒精发酵时的温度#&$ k$并不是糖化酶
作用的最适温度#7$ k$&初始 ).调整到了 7j$&所
以糖化酶的添加量需要重新确定 将按 %j#j# 所述
方法得到的液化液冷却至 &$ k 用稀 .
#
45
0
调节
料液 ).为 7*$&分别按每克木薯粉加 3$)%%$)%0$
及 %8$ S的比例添加糖化酶&同时接种酵母进行同
步糖化发酵&结果如表 # 和图 所示
表 @?糖化酶用量对酒精发酵的影响
D5K60@?#70:E127E-0H215;0127;63:25JM65102/0E-5/26
704J0/E5E.2/
糖化酶量:
#S!M
6%
$
):=
&
#酒精$:
g
"
#总残糖$:
#M!U
6%
$
"
#残还原糖$:
#M!U
6%
$
3$ 7$ %0j& #%j# 0j
%%$ 7$ %0j7 %8*7 &j%
%0$ 0 %0j3 %j# #j
%8$ 0 %0j3 %j8 %j!
图 Q?糖化酶的添加量对,+
@
释放量和
还原糖浓度的影响
U.;=Q?#70:E127H215;0127;63:25JM65102/,+
@
942H3:E.2/
5/H40H3:./; 13;54:2/:0/E45E.2/./!!U942:011
""由图 可知"发酵 #0 =时95
#
的释放量随糖化酶
用量的增加而增大 当高于 %0$ S:M木薯时� = 后
的发酵速率基本保持一致 糖化酶用量小于 %0$ S:M
时发酵速率较慢&并且发酵时间延长到7$ =&酒精度也
较糖化酶用量 %0$ S:M时低#表 #$ 由图 可以看出"
同步糖化发酵初始还原糖仅为 &g左右&发酵到 7 =&还
原糖含量都有不同程度的增加&说明在发酵 7 =之内&
糖化速率要高于酵母发酵速率 但是发酵#0 =后在糖
化酶量较少的情况下&明显延缓了酵母的发酵速率&导
7& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
致发酵时间延长&残还原糖量偏高
""因此&糖化酶用量为 %0$ S:M木薯为宜&此时较
常规酒精发酵糖化酶用量增加了 #$ S:M木薯&由于
糖化酶本身用量少&成本低&对酒精制造成本基本
不构成影响
#j&j&"同步糖化发酵可行性的研究
""为进一步验证同步糖化发酵工艺的可行性&
将同步糖化发酵工艺与预糖化 &$ PQC 的发酵工艺
#糖化酶添加量均为 %0$ S:M木薯$进行比较&结
果见表 &
表 O?糖化时间对酒精发酵的影响
D5K60O?#70:E12715::-54.7.:5E.2/E.J02/0E-5/26704J0/E5E.2/
预糖化时间:PQC
95
#
释放量:#M!U6%$
%# = #0 = 0 =
&
#酒精$:g "
#总残糖$:
#M!U
6%
$
"
#残还原糖$:
#M!U
6%
$
$ 8 %$ %&0 %0j3 %j7 #j#
&$ ! %$8 %&7 %0j! %0j3 %j8
""由表 & 可知"# 种工艺的微小差异在可接受范
围内&说明在初始 ).7j$ 的条件下&采用同步糖化
发酵工艺进行高浓度酒精发酵是可行的
@NP?同步糖化发酵工艺的放大实验
""对同步糖化发酵工艺在 %$ U发酵罐上进行了 &
批放大实验 取 #j7 cM木薯&按 %i#j#的料水比加入
中温厌氧出水拌料&添加 %$ S:M木薯的
!
淀粉酶&
在 ).7j$)%$$ k下液化 % =&降温到&$ k&同时加入
%0$ S:M木薯的糖化酶)$j%g尿素和 %$g的种子液&
静止培养&发酵结果如表 0所示
表 P?CB S发酵罐中酒精发酵结果
D5K60P? 0`136E1270E-5/26704J0/E5E.2/./CB S704J0/E24
批次 &#酒精$:
g
"
#甘油$:
#M!U
6%
$
"
#总残糖$:
#M!U
6%
$
"
#残还原糖$:
#M!U
6%
$
升酸
"
#45
# 6
0
$:
#M!U
6%
$
% %0j7 !j! %j3 %j7 #j# %j30
# %0j3 !j7& %&j0 #j0 %j3 %j!&
& %0j8 !j0 %0j# #j% #j #j$0
平均 %0j8 !j3 %0j #j$ #j# %j!0
"""""""""注"酸度定义为滴定 %$ PU发酵醪液所消耗 $j% PDE:U-B5.的体积&发酵初始酸度减去发酵终点
酸度即为升酸
"" 表 0 结果说明"此工艺在 %$ U发酵罐实验中取
得了较好的效果&酒精体积分数维持在 %0*8g&副
产物甘油质量浓度也控制在 %$ M:U以下&升酸控制
在 # 左右&对发酵结束污染杂菌升酸进行了分析&发
现乳酸在 %j# h%j7 M:U之间&乙酸质量浓度在
$j# h$j0 M:U之间&即染菌升酸控制在 %j7 h#j0 之
间 酒精发酵引入的 45# 6
0
浓度也控制在 & M:U的
沼气发酵安全范围内
O?结论
""通过无预糖化工序的,同步糖化发酵-研究&提
高发酵初始 ).到 7*$&使得发酵液中 45# 6
0
浓度减
少了 $g&控制 45# 6
0
质量浓度在 & M:U以下&不会
对酒精沼气双发酵的正常运行构成危害(在同步糖
化发酵条件下糖化酶的添加量为 %0$ S:M&较传统
酒精发酵工艺多耗糖化酶 #$ S:M(发酵液酸度上升
可控制在 #j 以内#多数情况小于 #j#$ 酒精发酵
顺利进行&酒精体积分数保持在 %0*8g
参考文献"
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"第 # 期 王"欣等"酒精 沼气双发酵耦联工艺中 45# 6
0
的控制
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国外动态
美国科学家以蔗糖为原料制造石墨烯
美国科学家使用普通的蔗糖制造出了纯净的石墨烯&用这种石墨烯可以研制出更轻)更快)更紧实柔
韧)更廉价的计算机电子设备&可广泛应用于军用飞机和医疗领域
美国莱斯大学化学教授詹姆斯!图尔领导的科研小组首先将少量蔗糖放置在一薄层铜箔上&然后在加
热和低压下让这些蔗糖接触流动的.
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和YO %$ PQC后&这些蔗糖缩减成纯净的单层石墨烯&调整气体的流
动可控制石墨烯薄膜的厚度 这种一步式低温处理方法相对简单可控&不需要使用更难处理的化学气相沉
积法以及其他需要高温的方法&使制造石墨烯变得更加容易 图尔解释道&在传统化学气相沉积法中&科学
家需要持续使用气体#甲烷或乙烷$来调整石墨烯的生长环境和掺杂物质以让石墨烯的质量达到最优&但新
方法使用了不同的碳原料&因此可以更好地控制石墨烯中掺杂的物质和石墨烯的厚度
#胡晓丽$
3& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"