全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ００７
收稿日期：２０１３－０８－２７
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１２ＣＢ７２１１０３、２０１２ＣＢ７２１００３）； 国家高技术研究发展计划（８６３ 计划） （２０１２ＡＡ０２２２０６Ｂ、
２０１２ＡＡ０２０４０３）；国家自然科学基金（３１２０１２９６ ／ Ｃ２００１０１）；中央高校基本科研业务费专项资金；生物反应器工程国家重点实验室开
放课题
作者简介：徐晶晶（１９８７—），女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：酶工程；苏二正（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｅｚｈｓｕ＠ ｎｊｆｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０脂肪酶的重组可溶表达、
固定化及其酶学性质
徐晶晶１，苏二正２，吴向萍１，马昱澍１，魏东芝１
（１􀆰 华东理工大学 鲁华生物技术研究所 生物反应器工程国家重点实验室，上海 ２００２３７；
２􀆰 南京林业大学 轻工科学与工程学院 酶与发酵工程实验室，南京 ２１００３７）
摘　 要：为了提高 Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０ 脂肪酶的可溶表达水平，分别将目的基因与 ｐＧＥＸ ４Ｔ １、ｐＥＴ２８ａ 和
ｐＥＴ３２ａ构建重组表达载体，转入大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３），通过优化诱导过程，发现可溶性酶的最高活性可达 ２５ ０００
Ｕ ／ Ｌ。 再经 Ｎｉ２＋亲和柱纯化、ＬＨ ＥＰ 固定化后，固定化酶的比酶活为 ２１４ Ｕ ／ ｇ（以 １ ｇ 湿质量计），酶活回收率为
５１％。 固定化后重组脂肪酶的最适温度由 ３０ ℃提高到 ３５ ℃，最适 ｐＨ从 ７􀆰 ０偏移至 ８􀆰 ０左右，并且稳定性也有所
增加。 该固定化重组脂肪酶同样能够拆分消旋体反式 ４ 甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，光学选择性没有改变。 反应
１４ ｈ，转化率为 ４８􀆰 ５％，底物的 ｅ􀆰 ｅ．值为 ９９􀆰 ２％，表明该固定化脂肪酶能有效拆分消旋体反式 ４ 甲氧苯基缩水甘
油酸甲酯，为工业生物催化制备地尔硫卓提供了可能。
关键词：黏质沙雷氏菌；脂肪酶；可溶表达；固定化；手性拆分
中图分类号：ＴＱ９２５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－００３３－０６
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０
ＸＵ Ｊｉｎｇｊｉｎｇ１，ＳＵ Ｅｒｚｈｅｎｇ２，ＷＵ Ｘｉａｎｇｐｉｎｇ１，ＭＡ Ｙｕｓｈｕ１，ＷＥＩ Ｄｏｎｇｚｈｉ１
（１􀆰 Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ； ２􀆰 Ｅｎｚｙｍｅ ＆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０ ｉｎ
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｐＧＥＸ⁃４Ｔ⁃１， ｐＥＴ２８ａ ａｎｄ ｐＥＴ３２ａ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ􀆰 Ａｆｔｅｒ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ ２５ ０００ Ｕ ／ Ｌ ｉｎ ｓｈａｋｅ
ｆｌａｓｋｓ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｉ⁃ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ􀆰 Ｔｗｏ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｐａｓｅ， ａｎｄ ＬＨ⁃ＥＰ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｏｎｅ􀆰 Ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｔｈｅ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗｅｒｅ ３５ ℃ ａｎｄ ８􀆰 ０， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎｔｏ ＬＨ⁃ＥＰ􀆰 Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ （ ±）⁃ＭＰＧＭ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄ ａ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ４８􀆰 ５％ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ａｎ ｅ􀆰 ｅ． ｖａｌｕｅ ｏｆ ９８􀆰 ２％ 􀆰 Ｏｕｒ
ｓｔｕｄｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｇｏｏｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０ ｌｉｐａｓｅ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｌｔｉａｚｅｍ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ；ｌｉｐａｓｅ；ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ；ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
　 　 脂肪酶（ＥＣ ３􀆰 １􀆰 １􀆰 ３）又称三酰基甘油酯水解
酶（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｃｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ），它可将中长链甘油
三酯催化水解成甘油和脂肪酸。 除水解反应以外，
脂肪酶还能催化酯化、酯交换、氨解、醇解等多种反
应，并且在非水相体系中具有高度的区域选择性和
立体选择性。 因此，脂肪酶在食品工业、医药化妆
品、生物柴油、手性化学品拆分制备方面发挥着重
要作用［１－２］。
与其他细菌脂肪酶相比，来源于黏质沙雷氏菌
的脂肪酶因能高立体选择性催化拆分消旋体反式
４ 甲氧苯基缩水甘油酸甲酯（（ ±） ＭＰＧＭ），得到
冠状血管舒张剂药物顺式地尔硫卓制备的关键中
间体 （２Ｒ，３Ｓ） ４ 甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，即
（－） ＭＰＧＭ而备受关注［３－４］。 Ｉｄｅｉ等［５］克隆得到黏
质沙雷氏菌 Ｓｒ４１ ８０００ 的脂肪酶基因，并将其与信
号肽共同构建到载体 ｐＵＣ１９ 上再转化到野生型菌
株中进行表达，使酶产量增加了近 １４０倍，之后又使
用膜反应器对该脂肪酶固定化，并用于拆分消旋体
（±） ＭＰＧＭ。 目前，人们已经从黏质沙雷氏菌中克
隆该脂肪酶基因，并在大肠杆菌中进行了表达，但
大多数表达产物都以无活性的包涵体形式存
在［６－８］。 因此，如何实现该脂肪酶的高水平活性表
达是一个亟待解决的难题。 一般可以通过 ２种途径
来实现：一是对重组脂肪酶包涵体进行变复性以重
新获得有活性的酶，但这种方法由于操作繁琐、耗
时较长不能用于工业化生产；二是构建能可溶表达
该脂肪酶的表达系统或通过优化目的蛋白的表达
条件，实现可溶活性表达。
Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０为华东理工大学鲁华生
物技术研究所筛选获得的 １ 株高产 ２，３ 丁二醇菌
株，笔者以 Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０ 基因组为模板克
隆获得其脂肪酶基因，构建多个原核表达系统，以
可溶性表达为目的优化其表达条件， 随后对该脂肪
酶进行纯化、固定化，并研究其理化性质，为地尔硫
卓规模化生产奠定基础。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 菌株和材料
菌株 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＤＨ５ a、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）、Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０、表达载体 ｐＧＥＸ ４Ｔ １、ｐＥＴ２８ａ、
ｐＥＴ３２ａ均为华东理工大学鲁华生物技术研究所保
藏；质粒 ＰＭＤ１９ Ｔ购自 ＴａＫａＲａ公司； Ｔａｑ ＤＮＡ聚
合酶、Ｔ４ＤＮＡ 连接酶、限制性内切酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ
购于上海捷瑞生物工程有限公司；聚乙烯醇、橄榄
油均购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；异丙
基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）、氨苄青霉素购于 Ｓｉｇｍａ 公
司；其他生化试剂均为市售国产分析纯。
１􀆰 ２　 脂肪酶基因的克隆和表达
根据 ＧｅｎＢａｎｋ上提交的黏质沙雷氏菌脂肪酶基
因设计并合成特异性引物，正向引物 ５′ ＧＧＴＴＧＡＡ⁃
ＴＴＣＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡ ３′ （下划线为
ＥｃｏＲⅠ酶切位点），反向引物为 ５′ ＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ⁃
ＴＡＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣ ３′ （下划线为 ＮｏｔⅠ酶
切位点），以黏质沙雷氏菌 Ｈ３０ 基因组为模板进行
ＰＣＲ扩增。 将 ＰＣＲ产物连接到 ｐＭＤ１９ Ｔ载体并测
序。 把经测序验证的重组质粒用 ＥｃｏＲⅠ和 ＮｏｔⅠ双酶切
后电泳回收 ＤＮＡ片段，用 Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接到同样
经 ＥｃｏＲⅠ和 ＮｏｔⅠ双酶切的 ｐＥＴ２８ａ、 ｐＥＴ３２ａ和 ｐＧＥＸ
４Ｔ １中，构建表达质粒，转化大肠杆菌 ＤＨ５α，经双
酶切、测序验证正确后，将重组质粒转化大肠杆菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）进行初步表达。 在 ＬＢ培养基（蛋白胨 １０
ｇ ／ Ｌ、酵母膏 ５ ｇ ／ Ｌ、ＮａＣｌ １０ ｇ ／ Ｌ，ｐＨ ７􀆰 ０）中，３７ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ 培养至 ＯＤ 为 ０􀆰 ６ ～ ０􀆰 ８ 左右，加入 ０􀆰 １％
（体积分数） １ ｍｏｌ ／ Ｌ的诱导剂 ＩＰＴＧ于 ３０ ℃培养 ８ ｈ
后离心收集菌体。 将菌体重悬于 ２５ ｍＬ ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ ８􀆰 ０）缓冲液中，超声波破碎菌体后高
速离心，对上清与沉淀分别取样，进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电
泳分析。
１􀆰 ３　 脂肪酶的酶活测定
脂肪酶的活力测定以橄榄油为底物采用 ＮａＯＨ
滴定法［９］。 ０􀆰 ５ ｍＬ适当稀释的酶液或 １０～５０ ｍｇ 固
定化酶、１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ７􀆰 ０的磷酸钠缓冲液 ２􀆰 ０ ｍＬ
的测酶活体系于摇床上 ３０ ℃保温 ５ ｍｉｎ 左右，加入
预保温的乳化橄榄油底物 ２􀆰 ５ ｍＬ 开始反应，１０ ｍｉｎ
后用 １０ ｍＬ终止液（无水乙醇与丙酮按照体积比１ ∶ １
混合）终止反应，对于游离酶空白对照中先加终止液
再加底物，对于固定化酶空白对照中加终止液后煮沸
１０ ｍｉｎ再加底物。 脂肪酶催化橄榄油水解产生的游
离脂肪酸的量通过 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＮａＯＨ滴定测得，加
２滴 ０􀆰 ０５％（质量分数）酚酞指示滴定终点。 在上述
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
条件下，脂肪酶水解底物每分钟产生 １ μｍｏｌ 游离脂
肪酸所需的酶定义为一个活力单位（Ｕ）。
１􀆰 ４　 重组脂肪酶的分离纯化
用镍柱对重组脂肪酶进行分离纯化。 离心收
集 ５０ ｍＬ 发酵液的菌体，重悬于 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ （ｐＨ ８􀆰 ０）缓冲液中，超声波破碎菌体，高速离
心分离上清和沉淀；将上清 ５ ｍＬ 以 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ 的
速度加样到柱体积为 １ ｍＬ的 Ｎｉ ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 亲
和柱上，基本流动相为含 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 的 ２５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ ８􀆰 ０） 缓冲液；用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
咪唑进行冲洗，穿出峰过后，用浓度梯度为 ５０、８０、
１００和 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的咪唑流动相洗脱，分别收集洗
脱组分进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分析。
１􀆰 ５　 脂肪酶的固定化
称取 ０􀆰 ５ ｇ 环氧载体 ＬＨ ＥＰ 加入 ５ ｍＬ 纯化
的脂肪酶溶液中。 在 ２５ ℃和 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ下开始固定
化。 １６ ｈ后，用砂芯漏斗滤出固定化酶，用去离子
水充分清洗并过滤抽干。 测定固定化溶液中的蛋
白浓度及固定化脂肪酶的活力，计算固定化率及酶
活力回收率。
称取 ２􀆰 ５ ｇ 氨基载体 ＬＨ ＨＡ，加入 １０ ｍＬ ｐＨ
８􀆰 ０的 ０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ的磷酸钾缓冲液（含有 ２􀆰 ０％ （体
积分数）的戊二醛）中，在 ２５ ℃ 和 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ下活化
２ ｈ，活化结束后用去离子水充分清洗直至闻不出戊
二醛味。 称取 ０􀆰 ５ ｇ 活化的氨基载体 ＬＨ ＨＡ，按照
环氧基载体同样的方法进行固定化。 １０ ｈ 后，用砂
芯漏斗滤出固定化酶，并依次用去离子水、１ ｍｏｌ ／ Ｌ
的 ＮａＣｌ溶液、０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ８􀆰 ０ 的磷酸钾缓冲液
充分清洗，过滤抽干。 测定固定化溶液中的蛋白浓
度及固定化脂肪酶的活力，计算固定化率及酶活力
回收率。
１􀆰 ６　 脂肪酶的性质研究
１）最适温度 　 取适量的纯化脂肪酶液或固定
化脂肪酶，分别于 ２５～６０ ℃下测定酶活。 将最适温
度下的酶活定义为 １００％，计算相对酶活。
２）最适 ｐＨ　 取适量的纯化脂肪酶液或固定化
脂肪酶，在 ３０ ℃下分别于 ｐＨ ３􀆰 ０ ～１０􀆰 ０ 的磷酸 硼
酸 柠檬酸缓冲液中测定酶活。 将最适 ｐＨ 下的酶
活定义为 １００％，计算相对酶活。
３）热稳定性 　 取适量的纯化脂肪酶液或固定
化脂肪酶，加入 ５ ｍＬ ｐＨ ８􀆰 ０ 的 Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液
中，置于不同温度（２５ ～ ６０ ℃）下，保温 ６ ｈ 后，测定
残余酶活。
４）ｐＨ稳定性　 取适量的纯化脂肪酶液或固定
化脂肪酶，置于 ２５ ｍＬ的具塞三角烧瓶中，依次加入
５ ｍＬ、ｐＨ ３􀆰 ０ ～ １０􀆰 ０ 的磷酸 硼酸 柠檬酸缓冲液，
于 ２５ ℃放置 １２ ｈ后，测定残余酶活。
１􀆰 ７　 固定化脂肪酶拆分地尔硫卓中间体
在 ２５ ｍＬ具塞三角瓶中加入 ５ ｍＬ 甲苯，５ ｍＬ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液 （ ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ， ｐＨ ８􀆰 ０ ）， １００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ （±） ＭＰＧＭ，０􀆰 １ ｇ 固定化脂肪酶，置于 ３０
℃的恒温摇床 １５０ ｒ ／ ｍｉｎ 进行反应，一定时间后取
样，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，分离有机相和水相，
取有机相进行 ＨＰＬＣ检测。 手性柱为日本大赛璐公
司的 Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ，流动相为正己烷 异丙醇混合液
（两者体积比为 ６０ ∶ ４０），柱温控制在 ２０ ℃，流速为
０􀆰 ８ ｍＬ ／ ｍｉｎ，检测波长 ２５４ ｎｍ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 Ｈ３０脂肪酶的克隆与表达
以 Ｓ􀆰 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０的基因组ＤＮＡ为模板，通过
ＰＣＲ（９４ ℃ ０􀆰 ５ ｍｉｎ，５８ ℃ １ ｍｉｎ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３０个循
环）获得 ２ ０００ ｂｐ左右的扩增产物，与预期的目的基
因大小相符。 将 ＰＣＲ获得的脂肪酶基因片段经胶回
收纯化后，与 ｐＭＤ１９ Ｔ 载体连接过夜，转化大肠杆
菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＤＨ５α，筛选重组子经 ＥｃｏＲⅠ和 ＮｏｔⅠ双酶切鉴
定，酶切鉴定正确的重组菌送样测序，测序结果经
ＢＬＡＳＴ进行同源性比对分析，与 ＧｅｎＢａｎｋ 中已提交
的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因同源性为 ９８％。
将成功构建的重组质粒 ｐＥＴ２８ａ ｌｉｐａｓｅ、
ｐＥＴ３２ａ ｌｉｐａｓｅ和 ｐＧＥＸ ４Ｔ １ ｌｉｐａｓｅ 分别转化
入大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中并进行诱导表达。 在 ３０
℃条件下，ＩＰＴＧ 诱导 ８ ｈ 后，收集菌体超声破碎后
离心，所得的上清液与沉淀分别进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ
电泳分析，结果如图 １ 所示。 由图 １ 可知：重组菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ２８ａ ｌｉｐａｓｅ中脂肪酶主要以
非可溶性包涵体形式表达为主（图 １（ａ）泳道 ５），重
组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＧＥＸ ４Ｔ １ ｌｉｐａｓｅ的表
达产物中，脂肪酶的可溶表达与包涵体约各占一半
（图 １ （ ｃ） 泳道 ４ 和 ５），而重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ ｌｉｐａｓｅ 中脂肪酶主要以可溶性表
达为主（图 １（ｂ）泳道 ４）。 就脂肪酶在重组菌中的
表达量而言，重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ
ｌｉｐａｓｅ和 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ２８ａ ｌｉｐａｓｅ 中脂肪
酶的表达总量较高，而 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＧＥＸ
４Ｔ １ ｌｉｐａｓｅ中的脂肪酶表达量较低。
５３　 第 ６期 徐晶晶等：Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０脂肪酶的重组可溶表达、固定化及其酶学性质
１—空载体空白对照； ２—诱导前空白对照； ３—诱导后全菌体； ４—诱导后上清； ５—诱导后沉淀； Ｍ—标准蛋白
图 １　 大肠杆菌重组 Ｓ􀆰 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０脂肪酶的诱导表达
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓ􀆰 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０ ｌｉｐａｓｅ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
　 　 测定重组菌表达脂肪酶的比酶活表明：重组菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ ｌｉｐａｓｅ表达脂肪酶的比
酶活最高，达到 ５ ０００ Ｕ ／ Ｌ；重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３） ／ ｐＧＥＸ ４Ｔ １ ｌｉｐａｓｅ 表达脂肪酶比酶活
次之，达到 ２ ０００ Ｕ ／ Ｌ；重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／
ｐＥＴ２８ａ ｌｉｐａｓｅ 表达脂肪酶比酶活最低，仅为 ５００
Ｕ ／ Ｌ左右。 原始 Ｓ􀆰 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０ 表达的脂肪酶比
酶活为 ４００ Ｕ ／ Ｌ左右，可以看出在大肠杆菌中重组
表达后，脂肪酶的表达酶活都有了不同程度的提高。
结合重组菌中脂肪酶的表达状况及其表达酶
活，后续表达条件优化以重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ ｌｉｐａｓｅ作为研究对象。
２􀆰 ２　 表达条件优化
为了获得更理想的表达结果，在 ＬＢ 培养基中
对重组菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ ｌｉｐａｓｅ 的诱
导表达条件如诱导温度、诱导剂 ＩＰＴＧ 浓度、诱导时
间等进行了优化。 得到重组脂肪酶诱导表达的最
佳条件：２５ ℃，ＩＰＴＧ 浓度 ０􀆰 ８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，诱导时间为
１２ ｈ。 同时，发现添加诱导剂 ＩＰＴＧ 的同时，添加终
浓度为 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＣａＣｌ２，能使脂肪酶的表达活力
提高 １􀆰 ６倍（图 ２）。 在最优条件下诱导表达，重组
菌 ＯＤ６００最高达到 １６􀆰 ２，脂肪酶比酶活达到 ２５ ０００
Ｕ ／ Ｌ（图 ３），比文献［６ ８］报道的结果要高。
２􀆰 ３　 重组脂肪酶的纯化
利用 ｐＥＴ３２ａ 融合表达在目的蛋白的 Ｃ 末端的
Ｈｉｓ ｔａｇ，通过 Ｎｉ２＋亲和柱进行分离纯化。 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ 电泳结 果 见 图 ４。 由 图 ４ 可 知： 采 用
８０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ以上浓度的咪唑能获得纯度较高的目的
蛋白。 但同时考虑到过高的盐浓度会降低脂肪酶
的活性，所以选用 ８０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 咪唑作为纯化该脂肪
图 ２　 Ｃａ２＋浓度对 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ ｌｉｐａｓｅ
重组脂肪酶诱导表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｌｉｐａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ⁃ｌｉｐａｓｅ
图 ３　 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ ｌｉｐａｓｅ重组脂肪
酶诱导表达进程曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｐａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ３２ａ⁃ｌｉｐａｓｅ
酶时的洗脱浓度。
２􀆰 ４　 重组脂肪酶的固定化
为了寻找对重组脂肪酶固定化效果较好的载
体，考察氨基载体和环氧载体对脂肪酶的固定化效
果，结果见表 １。 由表 １ 可知：环氧载体 ＬＨ ＥＰ 的
６３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
１、２—５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 咪唑洗脱峰；３、４—８０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ咪唑洗脱峰；
５、６—１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ咪唑洗脱峰 ７—２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ咪唑洗脱峰
图 ４　 咪唑洗脱浓度对纯化脂肪酶影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ
固定化率为 ７６％，酶活回收率为 ５１％，最终固定化
酶比酶活达到 ２１４ Ｕ ／ ｇ（以 １ ｇ菌体湿质量计）；氨基
载体 ＬＨ ＨＡ 对蛋白的固定化率以及酶活回收率
均不高，分别为 ６３％和 ２３％，最终的固定化酶比酶
活也仅达到 １０３ Ｕ ／ ｇ。 由此可以看出 ＬＨ ＥＰ 是一
个较适宜的固定化载体。
表 １　 不同固定化载体对脂肪酶的固定化效果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｎ
ｌｉｐａｓｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
载体 固定化时间 ／ ｈ
固定化
率 ／ ％
固定化酶比
酶活 ／ （Ｕ·ｇ－１）
酶活回收
率 ／ ％
氨基载体
（ＬＨ ＨＡ） １０ ６３ １０３ ２３
环氧载体
（ＬＨ ＥＰ） １６ ７６ ２１４ ５１
２􀆰 ５　 重组脂肪酶的酶学性质
考察纯化的游离脂肪酶及环氧载体 ＬＨ ＥＰ 固
定化脂肪酶的最适反应温度，结果见图 ５。 由图 ５
可知：固定化后脂肪酶的最适水解温度与游离酶相
比从 ３０ ℃提高到 ３５ ℃。 当温度升至 ４５ ℃时，游离
酶活性显著下降，与之相比固定化酶则保留约 ６０％
的活性。 当温度升高至 ５０ ℃以上后游离酶和固定
化酶都迅速失活。
ｐＨ是影响酶催化活性的主要因素之一，因此考
察 ｐＨ对重组脂肪酶活力的影响，结果见图 ６。 由图
６可知：经 ＬＨ ＥＰ 固定化后的脂肪酶，其最适 ｐＨ
从 ７􀆰 ０偏移至 ８􀆰 ０左右。 究其原因可能是由于酶分
子所带电荷在固定化后发生了改变。 通常情况下，
图 ５　 重组脂肪酶的最适温度
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｐａｓｅ
带负电荷的载体往往导致固定化酶的最适 ｐＨ 向碱
性偏移，而带正电荷的载体则将使固定化酶的最适
ｐＨ比游离酶低。
图 ６　 重组脂肪酶的最适 ｐＨ
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｐａｓｅ
脂肪酶经 ＬＨ ＥＰ 固定化后温度和 ｐＨ 稳定性
也发生改变，结果见图 ７ 和图 ８。 由图 ７ 可知：当温
度在 ３５ ℃以下时，游离酶和固定化酶的稳定性没有
太大差别，当温度升至 ４０ ℃以上时，游离酶迅速失
活，４５ ℃时酶活只剩下 ３５％左右，而固定化酶的热
稳定性有所提高，在 ４５ ℃放置 ６ ｈ 以后，残余酶活
还有 ６０％以上。 同时，游离酶和固定化酶都不能耐
受 ６０ ℃以上的高温。
图 ８为固定化后对脂肪酶的 ｐＨ 稳定性。 由图
８ 可知：固定化后脂肪酶的稳定性有一定程度的增
加，在 ｐＨ４􀆰 ０的缓冲液中存放 １２ ｈ 后，固定化酶的
残余酶活为 ４０％左右，而游离酶只剩 ２５％左右；在
ｐＨ大于 ８􀆰 ０ 的缓冲液中存放 １２ ｈ 后，游离酶迅速
失活，而在 ｐＨ １０􀆰 ０ 的缓冲液中固定化酶残余酶活
仍然保持在 ３５％左右。
２􀆰 ６　 固定化重组脂肪酶对地尔硫卓中间体的拆分
利用质粒 ｐＥＴ３２ａ 上的 Ｔｒｘ 标签与 Ｓ􀆰 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
Ｈ３０脂肪酶进行融合表达，显著提高了脂肪酶的可溶
表达比例。 由于 Ｔｒｘ标签过大，与脂肪酶融合后可能
７３　 第 ６期 徐晶晶等：Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０脂肪酶的重组可溶表达、固定化及其酶学性质
图 ７　 重组脂肪酶的热稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｐａｓｅ
图 ８　 重组脂肪酶的 ｐＨ稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ８　 ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｉｐａｓｅ
影响其催化效果，特别是其催化拆分的光学选择性。
此外，固定化也会对酶的催化性能产生影响。 为此，
按照 １􀆰 ７的方法考察固定化重组 Ｓ􀆰 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０脂
肪酶对地尔硫卓中间体的拆分效果。 结果显示，固定
化脂肪酶能够特异性拆分（±） ＭＰＧＭ，且优先催化 Ｒ
构型，催化拆分的光学选择性与原始游离脂肪酶一
致，说明融合表达、固定化均没有改变该脂肪酶催化
拆分的光学选择性。 经过 １４ ｈ 的反应，转化率为
４８􀆰 ５％，底物的 ｅ􀆰 ｅ．值为 ９９􀆰 ２％，表明本文制备的固定
化重组脂肪酶对（±） ＭＰＧＭ具有很好的拆分效果，
具备工业化应用的潜力。
３　 结　 论
成功克隆了 Ｓ􀆰 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ Ｈ３０ 的脂肪酶基因，
　 　 　 　 　 　
通过对表达载体和诱导条件的优化，实现了可溶表
达，在摇瓶中重组脂肪酶比酶活达到 ２５ ０００ Ｕ ／ Ｌ。
并通过镍柱进行纯化，环氧载体固定化，固定化脂
肪酶最适温度为 ３５ ℃，最适 ｐＨ ８􀆰 ０，在低于 ４５ ℃，
ｐＨ为 ５􀆰 ０～８􀆰 ０条件下比较稳定。 该固定化脂肪酶
能有效拆分（±） ＭＰＧＭ，为工业生物催化制备地尔
硫卓提供了可能。
参考文献：
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达和酶学性质的研究［Ｊ］ ．生物技术，２０１０，２０（５）：１２⁃１６．
［ ９ ］ 　 Ｍａｃｈｉｄｏ Ｇ Ａ， Ｐａｒｋ Ｙ Ｋ， Ｐａｓｔｏｒｅ Ｇ Ｍ． Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ
ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ ［Ｊ］ ．Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，２８：９０⁃９５．
（责任编辑　 荀志金）
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷