全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０４􀆰 ００１
收稿日期：２０１３－０４－０８
基金项目：教育部新世纪优秀人才计划（ＮＣＥＴ－１０－０４５９）；国家重点基础研究发展计划（９７３计划） （２０１２ＣＢ７２５２０２）；国家高技术研究发展计
划（８６３计划） （２０１１ＡＡ０２Ａ２１１）；国家自然科学基金（２１２７６１１０，３０９７００５６）；高等学校博士学科点专项科研基金（２０１１００９３１２０００１）；
中央高校基本科研业务费专项资金（ＪＵＳＲＰ５１３０６Ａ）；江苏高校优势学科建设工程
作者简介：司冠儒（１９８８—），男，安徽霍邱人，硕士研究生，研究方向：代谢工程育种；饶志明（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｒａｏｚｍ＠ ｙａｈｏｏ􀆰 ｃｏｍ􀆰 ｃｎ
产脂肪酶重组枯草芽胞杆菌的发酵优化
司冠儒，徐美娟，饶志明
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：笔者所在实验室前期筛选到 １ 株产脂肪酶粘质沙雷氏菌，克隆其脂肪酶基因，构建重组枯草芽胞杆菌
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ，成功实现了来源于粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达。 基于以
上工作基础上，对 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ进行了摇瓶水平上的产酶发酵优化。 首先通过单因素和正交试验确
定了有利于产脂肪酶的最佳培养基成分，并对发酵条件进行了优化。 结果表明：优化后的培养基组分为蔗糖
３５ ｇ ／ Ｌ，玉米浆 ２７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，（ＮＨ４） ２ＳＯ４ １􀆰 ２５ ｇ ／ Ｌ，ＣａＣｌ２ ４ ｇ ／ Ｌ，ｐＨ ７􀆰 ０。 在最优发酵培养基的条件下，３７ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ
摇床培养３３ ｈ，每毫升发酵液中重组菌脂肪酶酶活可达 ９８􀆰 ６ Ｕ，是优化前的 ３倍。
关键词：枯草芽胞杆菌；发酵；脂肪酶；粘质沙雷氏菌
中图分类号：ＴＱ９２５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－０００１－０６
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｌｉｐａｓｅ
ＳＩ Ｇｕａｎｒｕ，ＸＵ Ｍｅｉｊｕａｎ，ＲＡＯ Ｚｈｉｍｉｎｇ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｌｉｐａｓｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｐａｓｅ ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｔｏ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５⁃ｌｉｐＡ􀆰 Ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｉｎ Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ􀆰 Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５⁃ｌｉｐＡ ｗａｓ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ａｔ ｔｈｅ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｌｅｖｅｌ􀆰 Ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ
ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ􀆰 Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｓｕｃｒｏｓｅ ３５ ｇ ／ Ｌ，ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ ２７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，（ＮＨ４） ２ＳＯ４ １􀆰 ２５ ｇ ／ Ｌ，ＣａＣｌ２
４ ｇ ／ Ｌ， ａｎｄ ｐＨ ７􀆰 ０􀆰 Ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｄ ９８􀆰 ６ Ｕ ／ ｍＬ ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｉｔ ｗａｓ ３ ｔｉｍｅｓ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｌｉｐａｓｅ；Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
　 　 脂 肪 酶 （ ｌｉｐａｓｅ， ＥＣ３􀆰 １􀆰 １􀆰 ３， ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ
ａｃｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ），又称三酰基甘油水解酶。 能催化水
解三酰甘油生成脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯
以及甘油，其天然底物一般是不溶于水溶液的长
链脂肪酸酰基酯。 粘质沙雷氏菌脂肪酶以其独特
的性质广泛应用于食品加工、生物医药和生物柴
油等领域［１－２］ 。 朱绮霞等［３－４］筛选到 １ 株产脂肪酶
的粘质沙雷氏菌，通过响应面法优化其发酵产酶
条件，使其比酶活提高了 １０ 倍，达 ９７􀆰 ５２ Ｕ ／ ｍＬ，并
将其脂肪酶基因克隆至大肠杆菌进行表达，经发
酵优化，重组菌比酶活达 １０４ Ｕ ／ ｍＬ；王祎等［５］在
大肠杆菌中表达了粘质沙雷氏菌脂肪酶，比酶活
为 ８􀆰 ６ Ｕ ／ ｍＬ；Ｙｅ等［６］将粘质沙雷氏菌脂肪酶基因
克隆至毕赤酵母 ＧＳ１１５ 中并成功表达，重组菌比
酶活达 ６６􀆰 ２ Ｕ ／ ｍｇ。
粘质沙雷氏菌所产的胞外脂肪酶可应用于手
性化合物的不对称合成［７－８］。 此外，粘质沙雷氏菌
脂肪酶对甲醇、乙醇等有机溶剂有较高的耐受
性［４，９］。 然而，粘质沙雷氏菌本身产灵菌红素，给后
期酶的分离纯化造成了不便，同时粘质沙雷氏菌潜
在的致病性限制了其在手性药物合成及生物柴油
领域的应用。 因此，将粘质沙雷氏菌脂肪酶基因克
隆到安全宿主中进行高效表达一直是该领域研究
的重要方向。
前期，笔者所在实验室成员构建了 １ 株重组枯
草芽胞杆菌 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ，实现了来源
于粘质沙雷氏菌的脂肪酶在枯草芽胞杆菌属的首
次成功表达。 该菌株为组成型表达系统，无需添加
诱导剂，节约了生产成本，且操作更为简便，具有广
阔的工业应用前景。 本文中笔者以该重组菌株为
出发菌株，对其进行发酵优化，使其脂肪酶产量得
到进一步提高。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株
粘质沙雷氏菌 ＪＮＳ３ ９由笔者所在实验室成员
筛选保藏；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ 由笔者所在
实验室成员构建保藏。
１􀆰 ２　 主要试剂与培养基
对硝基苯酚棕榈酸酯（ｐ ＮＰＰ）购自阿法埃莎
（上海）公司；其他试剂购自国药（上海）公司。
ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０，酵母提取物 ５，
ＮａＣｌ １０，固体加 ２０ ｇ ／ Ｌ琼脂粉。
种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０，酵母提取物
５，ＮａＣｌ １０。
１􀆰 ３　 粗酶液的制备
将新鲜斜面上的菌种接种至种子培养基中培
养过夜，按 ２％的接种量转接到发酵产酶培养基中。
在培养温度为 ３７ ℃、转速为 １６０ ｒ ／ ｍｉｎ 的摇床中发
酵 ３６ ｈ，获得的发酵液在 ４ ℃、１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５
ｍｉｎ，收集上清液即为粗酶液。
１􀆰 ４　 脂肪酶活力的测定
酶活力测定采用 ｐ ＮＰＰ 法，参照文献［１０］进
行。 Ａ 液：１６􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐ ＮＰＰ的异丙醇溶液。 Ｂ
液：含有 ０􀆰 ４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００和 ０􀆰 １％阿拉伯树胶的
５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣＩ 缓冲液（ｐＨ ８􀆰 ０）。 测定时，将
相应的 Ａ 液与 Ｂ 液以 １ ∶ ９（体积比）比例混合，取
１００ μＬ 的粗酶液加入 ９００ μＬ 上述混合液中，于
４０ ℃反应 １０ ｍｉｎ。 立即加 １ ｍＬ 无水乙醇终止反
应，于 ４１０ ｎｍ下测定光吸收值。
酶活（Ｕ）单位定义：每分钟分解 ｐ ＮＰＰ 产生 １
μｍｏｌ对硝基苯酚（黄色）所需的酶量定义为 １ 个酶
活单位。
１􀆰 ５　 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ发酵产酶条件的优化
１􀆰 ５􀆰 １　 最适 Ｃ源的选择
分别以葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、β 环糊
精、蔗糖及 α 乳糖为 Ｃ 源，初始发酵培养基为 ＬＢ
培养基。 由于 ＬＢ 培养基中没有严格意义上的 Ｃ
源，可将备选 Ｃ 源作为唯一 Ｃ 源直接加入，其他组
分保持不变。 以最高酶活时的相对酶活定义为
１００％，通过计算所测酶活力值与该批次最高酶活力
值的百分比为相对酶活来确定最适 Ｃ源。
１􀆰 ５􀆰 ２　 有机 Ｎ源对菌体量及脂肪酶产量的影响
在最适 Ｃ 源的基础上，分别以酵母浸膏、牛肉
浸膏、豆粕、大豆蛋白胨及玉米浆为有机 Ｎ 源，替换
ＬＢ中的酵母膏和蛋白胨，其他组分不变。
１􀆰 ５􀆰 ３　 无机 Ｎ源对菌体量及脂肪酶产量的影响
在最适 Ｃ 源、有机 Ｎ 源基础上分别添加尿素、
ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４） ２ＳＯ４、（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４及 ＮＨ４ＮＯ３等无机
Ｎ源，其他组分不变。
１􀆰 ５􀆰 ４　 无机盐对菌体量及脂肪酶产量的影响
在最适 Ｃ 源、有机 Ｎ 源及无机 Ｎ 源的基础上，
分别以 ＫＣｌ、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、柠檬酸钠、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、
ＣｕＳＯ４等无机盐替换 ＬＢ培养基中的 ＮａＣｌ，其他组分
保持不变。
１􀆰 ５􀆰 ５　 正交试验设计优化培养基成分
在以上单因素的基础上，设计正交试验来优化
发酵培养基成分，本研究采用“四因素三水平”方
案，选取最佳 Ｃ 源、最佳有机 Ｎ 源、最佳无机 Ｎ 源、
最佳无机盐为考察因素。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 种子生长曲线和最佳种龄的确定
种子的生长曲线如图 １ 所示。 由图 １ 可知：菌
株在 ５ ｈ以后开始进入快速生长的对数期，并在 ２０
ｈ前后进入稳定期，随后菌体量开始缓慢下降，进入
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
衰亡期。 选择对数中后期的菌种最为合适，即可以
确定生长 １３～１５ ｈ的种子为最佳种龄。
图 １　 重组菌在 ＬＢ培养基中的生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ
２􀆰 ２　 最适 Ｃ源的选择
Ｃ源对菌体量及脂肪酶产量的影响如图 ２ 所
示。 由图 ２ 可知：当在 ＬＢ 培养基中添加可溶性淀
粉、麦芽糖和环糊精时，菌体量处于较高水平。 其
中以可溶性淀粉为 Ｃ 源时，菌体量最大；而菌体在
添加葡萄糖、乳糖时生长不佳；添加蔗糖、乳糖较有
利于菌体产脂肪酶，以蔗糖为 Ｃ 源时，脂肪酶产量
最高并且菌体量也相对较高。 综合考虑，以蔗糖为
Ｃ源最有利于脂肪酶产量的提高。
图 ２　 Ｃ源对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
蔗糖浓度对菌体量及脂肪酶产量的影响如图 ３
所示。 由图 ３可知：重组芽胞杆菌的生长和脂肪酶
产量在添加不同浓度蔗糖时是不同的。 在蔗糖质
量浓度为 １０ ～ ３０ ｇ ／ Ｌ 时，菌体量和脂肪酶产量随蔗
糖浓度升高呈上升趋势，随后开始下降；当蔗糖质
量浓度为 ３０ ｇ ／ Ｌ 时，菌体量与脂肪酶产量达到最
高，最有利于提高重组菌脂肪酶的产量，在此条件
下脂肪酶比酶活达 ５０􀆰 １ Ｕ ／ ｍＬ。
图 ３　 蔗糖对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 有机 Ｎ源对菌体量及脂肪酶产量的影响
有机 Ｎ源对菌体量及脂肪酶产量的影响如图 ４
所示。 由图 ４可知：大豆蛋白胨和玉米浆为有机 Ｎ
源时，菌体生长情况较好且脂肪酶产量较高；以牛
肉浸膏、豆粕为有机 Ｎ 源时则相对较低；而当以玉
米浆为 Ｎ源时，菌体量和脂肪酶产量最高，最有利
于脂肪酶产量的提高。
图 ４　 有机 Ｎ源对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
玉米浆对菌体生长及脂肪酶产量的影响如图
５ 所示。 由图 ５ 可知：随着玉米浆浓度的升高，菌
体量和脂肪酶产量皆呈现不断上升的趋势。 当玉
米浆质量浓度达到 ２５ ｇ ／ Ｌ时，达到最大值，随后开
始下降。 所以当以 ２５ ｇ ／ Ｌ 的玉米浆为 Ｎ 源时，最
有利于脂肪酶产量的提高，此时脂肪酶比酶活达
６１􀆰 ５ Ｕ ／ ｍＬ。
２􀆰 ４　 无机 Ｎ源对菌体量及脂肪酶产量的影响
无机 Ｎ源对菌体量及脂肪酶产量的影响如图 ６
所示。 由图 ６ 可知：在添加不同无机 Ｎ 源的情况
下，菌体量和脂肪酶产量差异较为明显， 除
３　 第 ４期 司冠儒等：产脂肪酶重组枯草芽胞杆菌的发酵优化
图 ５　 玉米浆对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４外，辅助添加其他无机 Ｎ 源都促进菌
体生长和脂肪酶酶活的提高。 其中添加（ＮＨ４） ２ＳＯ４
的促进作用最为显著，所以当以（ＮＨ４） ２ＳＯ４为无机
Ｎ源时，最有利于脂肪酶产量的提高。
图 ６　 无机 Ｎ源对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 ７　 （ＮＨ４） ２ＳＯ４对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ （ＮＨ４） ２ＳＯ４ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
（ＮＨ４） ２ＳＯ４浓度对菌体量及脂肪酶产量的影
响如图 ７ 所示。 由图 ７ 可知：低浓度时菌体量和脂
肪酶产量随（ＮＨ４） ２ＳＯ４浓度升高而升高，高浓度的
（ＮＨ４） ２ＳＯ４不利于菌体量和脂肪酶产量的提升，当
以 １􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ的（ＮＨ４） ２ＳＯ４为无机 Ｎ源时，最有利于
脂肪 酶 产 量 的 提 高， 此 时 脂 肪 酶 比 酶 活
达 ７３􀆰 ２ Ｕ ／ ｍＬ。
２􀆰 ５　 无机盐对菌体量及脂肪酶产量的影响
无机盐对菌体量及脂肪酶产量的影响如图 ８所
示。 由图 ８可知：当以 ＣａＣｌ２为无机盐时，比初始的
ＮａＣｌ提升约 １０％；而当以 ＫＣｌ 为无机盐时，脂肪酶
产量相比添加 ＮａＣｌ 时降低了约 １０％，所以 ＣａＣｌ２最
有利于脂肪酶产量的提高。
１—ＭｇＳＯ４；２—ＣａＣｌ２；３—ＫＣｌ；４—ＮａＣｌ；５—ＫＮＯ３；
６—ＮａＮＯ３；７—Ｖ（ＫＨ２ＰＯ４） ∶Ｖ（Ｋ２ＨＰＯ４）＝ １ ∶１
图 ８　 无机盐对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔｓ ｏｎ
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＣａＣｌ２浓度对菌体量及脂肪酶产量的影响如图
９所示。 由图 ９ 可知：菌体量和脂肪酶产量均随
ＣａＣｌ２浓度的增大而增大；当 ＣａＣｌ２质量浓度为 ４ ｇ ／ Ｌ
时，最有利于脂肪酶产量的提高；当 ＣａＣｌ２质量浓度
大于 ４ ｇ ／ Ｌ时，菌体量和酶活反而下降。 在 ＣａＣｌ２质
量浓度为 ４ ｇ ／ Ｌ时，脂肪酶比酶活达 ８０􀆰 １ Ｕ ／ ｍＬ。
图 ９　 ＣａＣｌ２质量浓度对菌体生长和
脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣａＣｌ２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
２􀆰 ６　 正交试验设计优化培养基成分
在上述单因素的基础上，设计正交试验来优化
发酵培养基成分，采用“四因素三水平”方案，选取
蔗糖、玉米浆、（ＮＨ４） ２ＳＯ４、ＣａＣｌ２为考察因素进行实
验。 具体的试验设计方案如表 １所示。
表 １　 正交试验设计方案
Ｔａｂｌｅ １　 Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
水平
Ａ
ρ（蔗糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｂ
ρ（玉米浆） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｃ
ρ（（ＮＨ４） ２ＳＯ４） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｄ
ρ（ＣａＣｌ２） ／
（ｇ·Ｌ－１）
１ ２５ ２２􀆰 ５ １􀆰 ２５ ３􀆰 ５
２ ３０ ２５ １􀆰 ５ ４
３ ３５ ２７􀆰 ５ １􀆰 ７５ ４􀆰 ５
正交试验结果及极差分析如表 ２ 和表 ３ 所示。
极差值的大小表明该因素水平的改变对结果的影
响大小，极差值越大，该因素对脂肪酶产量的影响
越大。 由表 ３极差值大小，各因素对脂肪酶产量的
影响从大到小依次为：玉米浆、（ＮＨ４） ２ ＳＯ４、蔗糖、
ＣａＣｌ２。 为了获得最高的产量，应选择的最优组合是
Ａ３ Ｂ３ Ｃ１ Ｄ２，即蔗糖 ３５ ｇ ／ Ｌ，玉米浆 ２７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ １􀆰 ２５ ｇ ／ Ｌ，ＣａＣｌ２ ４ ｇ ／ Ｌ。 采用此最优组
合的发酵培养基培养菌体，然后测脂肪酶酶活，最
终比酶活达 ９４􀆰 ７ Ｕ ／ ｍＬ。
表 ２　 正交试验结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ
试验号 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ 比酶活 ／（Ｕ·ｍＬ－１）
１ １ １ １ １ ８８􀆰 ２
２ １ ２ ２ ２ ７６􀆰 ４
３ １ ３ ３ ３ ９０􀆰 ７
４ ２ １ ２ ３ ８２􀆰 １
５ ２ ２ ３ １ ７７􀆰 ８
６ ２ ３ １ ２ ９１􀆰 ５
７ ３ １ ３ ２ ９１􀆰 ２
８ ３ ２ １ ３ ８７􀆰 ２
９ ３ ３ ２ １ ８６􀆰 ４
表 ３　 正交试验结果极差分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｒａｎｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ
误差源 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
均值 １ ８５􀆰 １００ ８７􀆰 １６７ ８９􀆰 ６３３ ８４􀆰 １３３
均值 ２ ８４􀆰 ４６７ ８０􀆰 ４６７ ８１􀆰 ６３３ ８７􀆰 ０３３
均值 ３ ８８􀆰 ２６７ ９０􀆰 ２００ ８６􀆰 ５６７ ８６􀆰 ６６７
极差 ３􀆰 ８００ ９􀆰 ７３３ ８􀆰 ０００ ２􀆰 ９００
２􀆰 ７　 初始 ｐＨ对菌体量及脂肪酶产量的影响
分别调节培养基初始 ｐＨ 为 ５􀆰 ０、６􀆰 ０、７􀆰 ０ 和
８􀆰 ０，考察初始 ｐＨ 对菌体量及脂肪酶产量的影响，
结果如图 １０所示。 由图 １０可以看出，不同初始 ｐＨ
对菌体量及脂肪酶的影响显著。 ｐＨ为 ５􀆰 ０ 时，菌体
生长受到抑制，同时脂肪酶产量较低；ｐＨ 为 ６􀆰 ０ ～
７􀆰 ０时，菌体量及脂肪酶产量较高，其中 ｐＨ 为 ７􀆰 ０
时为最佳。
图 １０　 初始 ｐＨ对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ８　 最佳接种量的选择
分别按 １％、２％、３％、４％、５％和 ６％的接种量进
行接种，培养 ３６ ｈ 后测定生物量和脂肪酶产量，所
得结果如图 １１ 所示。 由图 １１ 可以看出，随着接种
量的增加生物量和脂肪酶产量均有所增加，接种量
为 ４％时达到最大值，随后生物量和脂肪酶产量随
着接种量的增加逐步下降，因此可以确定 ４％的接
种量最有利于提高生物量和脂肪酶产量。
图 １１　 接种量对菌体生长和脂肪酶产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 １１　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ９　 重组菌在最优发酵条件下的发酵曲线
在以上优化结果的基础上对 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／
ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ进行发酵培养，并在不同时间段取样测
定菌体量及脂肪酶产量，所得结果如图 １２所示。
５　 第 ４期 司冠儒等：产脂肪酶重组枯草芽胞杆菌的发酵优化
图 １２　 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ在最优
培养条件下的发酵结果
Ｆｉｇ􀆰 １２　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５⁃ｌｉｐＡ
ｉｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
由图 １２可知：前期随着发酵的进行，菌体量呈
不断上升趋势，并在 ３３ ｈ 时达到最高值，在随后的
一段平衡期开始缓慢下降；脂肪酶酶活的变化趋势
与之相似，在 ３３ ｈ 时达到最大值，约 ９８􀆰 ６ Ｕ ／ ｍＬ，约
是优化前重组菌比酶活（３３􀆰 ２４ Ｕ ／ ｍＬ）的 ３ 倍，优化
后菌体 ＯＤ６００达 １４􀆰 ３，约是优化前 ６􀆰 ２ 的 ２􀆰 ３ 倍，单
位菌体量酶活约是优化前的 １􀆰 ３倍。 可见优化后的
发酵培养基显著提升了 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ
的产脂肪酶能力。 重组菌在 ３０ ～ ３５ ｈ 酶活较高，且
较为稳定，相对于其他菌株脂肪酶发酵过程中常出
现较高的峰值，随后急剧下降，重组菌具有较好的
稳定产酶能力，更有利于工业化应用。
３　 结　 论
在重组枯草芽胞杆菌 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５
ｌｉｐＡ基础上，对其进行了一系列摇瓶水平上的发酵
优化。 确定了种子培养 １３ ～ １５ ｈ 为最佳种龄，最佳
接种量为 ４％；通过单因素实验确定最佳种龄，Ｃ源、
有机 Ｎ源、无机 Ｎ源、无机盐离子的种类及浓度，最
优培养基成分为蔗糖 ３０ ｇ ／ Ｌ、玉米浆 ２５ ｇ ／ Ｌ、
（ＮＨ４） ２ＳＯ４１􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ和 ＣａＣｌ２ ４ ｇ ／ Ｌ；通过“四因素三
水平”正交试验，得出最优培养基为蔗糖 ３５ ｇ ／ Ｌ，玉
　 　 　 　 　 　
米浆 ２７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，（ＮＨ４） ２ＳＯ４１􀆰 ２５ ｇ ／ Ｌ，ＣａＣｌ２ ４ ｇ ／ Ｌ；最
后确定了最佳初始 ｐＨ 为 ７􀆰 ０。 用此最优发酵培养
基培养 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ／ ｐＭＡ５ ｌｉｐＡ，其脂肪酶产量可
达 ９８􀆰 ６ Ｕ ／ ｍＬ 发酵液，约是其优化前产量 ３３􀆰 ２４
Ｕ ／ ｍＬ的 ３倍，为粘质沙雷氏菌脂肪酶的广泛应用奠
定了基础。
参考文献：
［ １ ］ 　 Ｊａｅｇｅｒ Ｋ Ｅ，Ｒａｎｓａｃ Ｓ，Ｄｉｊｋｓｔｒａ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐａｓｅ［Ｊ］ ．ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｖ，１９９４，１５（１）：２９⁃６３．
［ ２ ］ 　 Ｌｉ Ｘ Ｙ，Ｔｅｔｌｉｎｇ Ｓ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｕ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ａｎ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，１９９５，６１：２６７４⁃２６８０．
［ ３ ］ 　 朱绮霞，张搏，陆雁，等．产脂肪酶粘质沙雷氏菌发酵产酶条
件的优化［Ｊ］ ．生物技术，２００９，１９（５）：６１⁃６５．
［ ４ ］ 　 朱绮霞，陈英，张搏，等．粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆表
达和酶学性质的研究［Ｊ］ ．生物技术，２０１０，２０（５）：１２⁃１６．
［ ５ ］ 　 王祎，赵健，范立强，等．重组粘质沙雷氏菌脂肪酶的可溶性
表达及其性质研究［Ｊ］ ．食品与药品，２０１０，１２（３）：７７⁃８１．
［ ６ ］ 　 Ｙｅ Ｆ，Ｆａｎ Ｌ，Ｘｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＥＣＵ１０１０ ｌｉｐａｓｅ （ ｌｉｐＡ） ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉ，２０１０，４（３）：９⁃１６．
［ ７ ］ 　 龙章徳，许建和，潘江．黏质沙雷氏菌脂肪酶的固定化及催化
拆分反式 ３ （４′ 甲氧苯基）缩水甘油酸甲酯［Ｊ］ ．催化学报，
２００７，２８ （２）：１７５⁃１７９．
［ ８ ］ 　 Ｌｉ Ｇ，Ｘｕ Ｊ Ｈ，Ｌｉ Ｘ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ３⁃
ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ ［ Ｊ ］ ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００４， ３１：
５２５⁃５３０．
［ ９ ］ 　 Ｚｈａｏ Ｌ Ｌ， Ｘｕ Ｊ Ｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＥＣＵ１０１０［Ｊ］ ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２００８， ４ （ ３ ）：
６２６⁃６３３．
［１０］ 　 Ｔａｎｇ Ｌ Ｈ，Ｘｉａ Ｌ Ｍ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｌｉｐａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓｚ ＪＵ３１８［Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，１２５（２）：１３９⁃１４６．
（责任编辑　 管　 珺）
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷