全 文 ：第6卷第2期
2008年3月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Mar．2008
· 33·
桔青霉生产核酸酶的发酵条件研究
王端好1”，周河治2，张小里1
(1．西北大学化工学院，西安710069；2．广西大学生命科学与技术学院，南宁530004)
摘要：对通过紫外线和∞co两次育种得到的桔青霉W48高产茵株培养基的单组分和发酵条件进行了优化，最后
又用正交实验对培养基的各组分的浓度进行了优化。得到了产酶量最高的培养基组分(质量分数)是：KH：P04
0．05％，KHP040．03％，酵母膏+蛋白胨0．7％，CaCl20．02％，M#040．04％，ZnS040．03％，葡萄糖5％，pH5．5。
最佳发酵条件是：接种量10％，装液量50mL，摇床转速180r／min，温度30℃，发酵时间66h。用最佳培养基和最
佳发酵条件发酵生产核酸酶的酶活力为758．10U／mL，原始菌种产核酸酶的酶活力为272．26U／mL，提高了
2．78倍。
关键词：发酵；核酸；正交实验；桔青霉
中图分类号：Q815，TQ925文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0033—05
ProductionofnucleasebyP niclliumcitrinumfermentation
WANGDuan．ha01”，ZHOUHe．zhi2，ZHANGXiao—lil
(1．CollegeofChemicalEngeering，NorthwestUniversity，Xi’an710069，China；
2．CollegeofLifeScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530004，China)
Abstract：Penicilliumc trinumW48，ahighyieldstrainwhichismutatedwithuhravioletradiationrays
and∞Coradiationwascultivated．Theconstitutesofthefermentationcultureandfermentationconditions
wasoptimized．Theoptimumculturecontains：KH2P040．05％，K2HP040．03％，yeastex ract+pep-
tone0．7％，CaCl20．02％，MgS040．04％，ZnS040．03％，Glucose5％，pH5．5．Theoptimumcuhi—
vatedconditionsareinoculationquantity10％，liquidvolume50mL，rotationspeed180r／min，fermen-
tationtemperature30oC，time66h．
Keywords：fermentation；nuclease；orthogonalexperimentaldesign；Penicilliumcitrin
核酸不仅在遗传信息的传递和蛋白质合成中
具有关键的作用，而且核酸降解获得的5’一核苷酸
和5’一脱氧核苷酸可加工成各种医用药品、生化试
剂、助鲜剂以及农作物促生长剂，它广泛应用于生
物工程、医药、食品、化妆品、农业生产和科研等领
域，并具有很高的经济价值¨。3]。我国具有丰富的
核糖核酸资源和先进的RNA生产技术，但将核酸降
解为核苷酸的大多数菌种生产活力低下，而且遗传
稳定性差，大大制约了我国核苷酸工业的发展。本
文对通过紫外线和∞Co两次育种得到的桔青霉高产
菌株W48发酵条件和培养基进行了优化，为以后继
续研究奠定了一定的基础，最终达到工业化的目的。
收稿日期：2007-06-26
基金项目：广西科技厅资助课题(001200％3)
作者简介：王端好(1969一)，男，山东临沂人，博士研究生，研究方向：生物化工。
联系人：周河治，教授。E—mail：gxuzhz@163．coin
万方数据
·34· 生物加工过程 第6卷第2期
1材料与方法
1．1 材料
桔青霉W48(Penicilliumtr num)，广西大学食
品发酵研究所保藏。斜面培养基：5Be’麦芽汁琼
脂。平板培养基(质量分数)：NaNO，0．2％，
KH2P040．1％，KCl0．05％，MgS040．05％，FeS04
0．001％，葡萄糖3％，琼脂2％。pH自然。种子培
养基：花生饼粉3．5％，KH：P040．1％，葡萄糖3％，
pH自然。基础发酵培养基见文献[4]。
1．2方法
1．2．1种子的制备
用无菌水10mL洗30℃培养6d的斜面，取2
mL接入装有20mL种子培养基的250mL摇瓶中，
30oC，180r／min摇床培养24h，即为种子。
1．2．2基础发酵培养
250mL摇瓶装基础发酵培养基50mL，按10％
的接种量接种，30oC，180r／min摇床培养66h。
1．2．3酶活检测
酶活检测方法参考文献[5]。
1．2．4斜面扩大培养
将菌种在麦芽琼脂培养基上划线接种，于28—
30℃下培养60～80h左右，待培养基表面全部形成
墨绿色的孢子，基本看不到白色菌丝为止。
2结果与分析
2．1 不同碳源对产酶量的影响
由表l可知，葡萄糖是该菌的最佳碳源。葡萄
糖是多数微生物优先利用的碳源，所以，利用葡萄
糖作碳源时，桔青霉产酶量最高。其次是玉米淀
粉。由于该菌是霉菌能够分泌淀粉酶，所以该菌能
够以玉米淀粉为唯一碳源，并且产酶量较高。这为
以后工业化生产奠定了基础。
2．2不同氦源对产酶量的影响
由表1可知，所利用的氮源中，酵母膏+蛋白胨
是营养最丰富的，产酶量最高。霉菌是化能异养
型，不能利用无机氮源，由于利用自来水配制培养
基，自来水中含有一定的有机氮源，所以用硝酸铵
作氮源时，产酶量最低。
表1 碳／氮源种类对发酵生产核酸酶产酶量的影响
Table1 Effectofdifferentcarbona dnitrogen
souI_ceonnucleicacidenzymeproductivity
碳源 M活／(u·mL‘1)氮源 酶活／(u·mL。1)
麸皮+葡萄糖 70．86 酵母膏+蛋白胨 307．53
麸皮 137．46 酵母膏 218．13
葡萄糖 304．06 蛋白胨 170．80
蔗糖 74．26 硝酸铵 52．67
玉米淀粉 283．70
2．3 无机离子对产酶量的影响
无机盐以Au方案产酶量最高。其次是培养基
中只加ZnSO。一种无机盐，这是因为锌离子有稳定
核酸酶的酶活中心的作用(见图1)。
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呈
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无机盐
图1 无机盐对桔青霉发酵生产核酸酶产酶量的影响
Fig．1Effectofdifferentinorganicions011
nucleicacidenzymeproductivity
2．4发酵时间对产酶量的影响
桔青霉W48培养时间分别取为54，60，66，72，78
h(供氧量相同)，测核酸酶活，结果(图2)所示，发酵
时间在66h，产酶量最高。发酵时间过短，菌体产酶
量小，发酵时间过长，发酵后期菌体衰亡，产酶量较
小，菌体已经生产的酶部分失活。由此可以看出，该
菌发酵生产核酸酶是生长偶联型的。
2．5 发酵条件对产酶量的影响
2．5．1发酵液初始pH对产酶量的影响
分别调整灭菌前发酵培养基的初始pH为2．5，
4．0，5．5，7．0，8．0，发酵培养桔青霉W48，测核酸酶
活。结果(图3)显示起始pH为5．5时酶量最高，
5．5是液体培养基的自然pH。因此配制后的培养
∞
∞
∞
∞
∞
O
5
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2
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万方数据
2008年3月 王端好等：枯青霉生产核酸酶的发酵条件研究 ·35·
基pH不需再调节。
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0 20 40 60 80 100
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图2发酵时间对产酶量的影响
Fig．2EffectoffermentationtimeOilucleic
acidenzymeproductivity
图3发酵液初始pH对产酶量的影响
Fig．3EffectofinitialpHonnucleic
acidenzymeproductivity
2．5．2接种量对产酶量的影响
分别以6％，8％，10％，12％，14％接种量，发酵
培养桔青霉W48，测核酸酶活。实验结果(图4)显
示接种量在10％时，产酶量最高。接种量过大桔青
霉生长过速，不利于产酶，接种量过小，菌体生长过
慢，同样不利于产酶。
2．5．3溶氧对产酶量的影响
(1)摇床转速对产酶量的影响
摇床转速分别以140，160，180，200，220r／min，
进行发酵培养桔青霉W48，测酶活，结果见图5，摇
床转速在达到180r／min前，产酶量有较大提高，当
摇床转速达到180r／min后，产酶量提高不大。所
以，本试验选取180r／min作为摇床转速。
(2)装液量对产酶量的影响
摇瓶装液量分别为30，40，50，60，70mL，发酵
培养桔青霉W48，测酶活，结果见图6，装液量从小到
大产酶量在逐渐减小。本试验选用了装液量为
50mL。通过图5和图6可知，该菌是高耗氧的微生
物。
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量
妲
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埘(接种量)，％
图4接种量对产酶量的影响
Fig．4Effectofinoculationquantityon
nucleicacidenzymeproductivity
图5摇床转速对产酶量的影响
Fig．5Effectofrotatespeedonnucleic
acidenzymeproductivity
p
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图6装液量对产酶量的影响
Fig．6Effectofliquidvolumeonnucleic
acidenzymeproductivity
万方数据
· 36· 生物加工过程 第6卷第2期
2．5．4发酵温度对产酶量的影响
发酵温度分别取为：24，27，30，33，36℃，发酵
培养桔青霉W48，测酶活，结果(图7)所示，发酵温
度在30℃时，产酶量最高。该温度也是该菌最适生
长温度。当温度低于30℃时，该菌生长缓慢，产酶
量小，当温度高于30℃时，该菌生长速率变慢，同时
酶部分失活。
2．6发酵培养基各组分浓度的优化o¨
以葡萄糖为碳源，蛋白胨+酵母膏为氮源，加
入微量元素，选择k(313)正交表，表头设计见
表2。
，
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图7发酵温度对产酶量的影响
Fig．7Effectoffermentationtemperature
onnucleicacidenzymeproductivity
表2正交试验
Table2 DesignoforthogonMdesign—direct
注：A—KH2P04B—K2HP04C一酵母膏+蛋白胨D—cacl2E—MgS04F—zIIs04D一葡萄糖
当a=0．05时，F(2，8)=4．46，F(4，8)=
3．84，这说明酵母膏+蛋白胨的量和ZnSO。的量对
产酶量的影响显著。当Ot=0．01时，F(2，8)=
8．65，F(4，8)=7．01，这说明酵母膏+蛋白胨的量
和ZnSO。的量对产酶量的影响极显著。
表3方差分析结果
Table3 ResultsofanalysisofVariance
从表3还可以看出A，B，AXB，D，E，G的均方
离差都较小，把它们合并到误差列中后结果见表4。
表4合并后的方差分析结果
Table4 ResultsofanalysisofVarianceaft rcombinaiton
当a=0．05时，，(2，22)=3．44，易见Fc>R晒
(2，22)，F，>F0．仿(2，22)这说明酵母膏+蛋白胨的
含量和ZnSO。的含量对产酶量的影响显著。当Ot=
0．01时，Rol(2，22)=5．72，Fc，>Fo．m(2，22)，
F，量的影响极显著，ZnS04的量对产酶量的影响显著。
根据正交试验结果得出用桔青霉发酵生产核酸酶
的最佳培养基配方(质量分数)：KH2P040．05％，
KHP04．03％，酵母膏+蛋白胨0．7％，CaCl20．02％，
万方数据
2008年3月 王端好等：枯青霉生产核酸酶的发酵条件研究 ·37·
MsSO,o．04％，ZnS040．03％，葡萄糖5％。其酶活为
758．10U／mL，优化前是387．10U／mL，提高了1．96倍。
3结论
(1)通过对培养基单成分的优化、对发酵条件
的优化和正交试验对培养基各组分浓度的优化，得
到如下结论：产酶量最高的培养基质量分数是：
KH2P040．05％，K2HP040．03％，酵母膏+蛋白胨
0．7％，CaCl20．02％，MgS040．04％，ZnS040． 3％，
葡萄糖5％。pH5．5。最佳发酵条件是：接种量
10％，装液量50mL，摇床转速180r／min，温度
30℃，发酵时间66h。
(2)用最佳培养基和最佳发酵条件发酵生产核
酸酶的酶活力为758．10U／mL，原始菌种产核酸酶
的酶活力为272．26U／mL，提高了2．78倍。
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大庆石化用生物技术除臭
大庆石化水气厂采用生物式空气净化工艺，治理污水毒气取得突破性进展。总投资500多万元的化工、
腈纶毒气治理装置处理量为2000m3／h的装置，主要处理化工原水池、污泥浓缩池、腈纶缺氧池、曝气池混
合室等7处污水池产生的恶臭气体。该系统利用微生物降解恶臭物质，使之成为氧化产物。被降解的含硫
化氢的臭气首先溶解于喷淋池中，再通过固定化生物滤料的氧化，将臭气中的H：s氧化为硫酸盐，有机臭气
氧化为CO：和水，在该厂污水车间投用后，H：S、氰化氢、苯三大污染物出口合格率实现100％。环保监测站
采样分析表明，该装置投用后，每年可减排H：S168kg、氰化氢14kg、苯65kg。
国电龙源集团首个生物质项目机组并网发电
秸秆发电项目是当今国际社会蓬勃发展的新能源发电产业之一。使用可再生资源——农作物废弃秸
秆作为发电燃料，不仅节约了宝贵的一次性能源消耗，而且有助于改善地区生态环境保护、有利于提高广大
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(张春鹏)
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