全 文 ：July2008
·50·
生物加工过程
Chine鸵Jol】malofBioprocessEn舀nee矗ng
第6卷第4期
2008年7月
卢一葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达
夏永振，王 倩，刘慧敏，张浩军，祁庆生
(山东大学微生物技术国家重点实验室，国家糖工程中心，济南250100)
摘要：应用表面表达技术对来自n撇聊嗍ei的争葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达及后期性质进行了研
究。实验结果表明酵母表面表达酶有活性，该酶的最佳诱导时间为24h，最适温度是70℃，而酶活的最适pH是
5．5。使异源表面表达了Bgll的酵母在以纤维二搪为唯一碳源的培养基中生长，发酵结果表明纤维二糖被明显利
用了，但在培养186h后，发酵液中仍残留一定量的纤维二搪。这种技术对纤维素发酵系统中纤维二糖酶活性低的
现状有所帮助。
关键词：伊葡萄糖苷酶；酵母；纤维二糖
中图分类号：s826 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)04—0050一06
Expression0fbeta-glucosidasefromn记屁D如册m阳Ps西
oncellsurfaceof勋cc砌加刀哕cPsP阳l，妇缸P
XIAYong—zhen，WANGQian，LIUHui—min，ZHANGHao-jun，QIQing-sheng
(School0fl如Science，NationalGlycoengineeringRe眙archCenter，Sh肌dollgunive玛it)r，Jin柚250100，chi啮)
Abstract：r11Ieexpressi蚰ofbeta—duc明idasefmm州娩。如m脱秭叩tlleceu叫面ceof＆dⅫ硼砂螂盱
el心i粥w鹤inV鹤tigated甜ldtlIeglucosida船w硒ch锄cterized．Theop时malindlJcingtiIneof吐le洲【rf如e-en-
zy眦w躯24h．rIhe叩tiIIlalteInpemturew硇70℃a11d叩tirIlalpHw硇5．5．AfleroptiIIlizationof Ileg netic
en舀nee删erlz】m陀，tIlerecombi眦ltyeastw酗c出v蜀lted叽Ⅱ陀Ir_Bdi岫guppdjed埘山ceUobi佣eassolecar-
boIn岛帆lrce，Thef．enr比ntationresulti础catedⅡlatceUobiosewautilized．Aner186hcllltivation．t}lerewas
cenobio鸵ontlIenledi啪．The托sultconfimledtl att}le孕。砒hofengineeredye幽tonceUobio∞medi岫w鹊
help“inceuulo∞ed瑚lolpToductionpIDce鸥．
Keywords：beta-出ucosidase；＆mc7谊rDm妒∞ce触i钟；ceUobio跎
近年来，石油价格的大幅度上涨使世界各国都
在积极寻求可再生能源，作为经济发展的保障，这
使可再生能源问题成为各国竞逐的热点，各种新能
源的研究也变得更加火热。其中，纤维素乙醇作为
一种非常有潜力的洁净能源。正日益成为人们关注
的焦点‘1I。
纤维素乙醇的研究对我国有着重要的研究意
义。一方面，伴随着粮食的生产，都会有大量的秸
秆生成而得不到有效利用，被焚烧或被掩埋，浪费
极大而且污染环境；另一方面，能源问题也正日趋
紧张，我国一半以上的石油需要进口获得，这已成
为我国经济发展的瓶颈。纤维素乙醇项目可以使
我国的生物质能源得到有效利用，另外也缓解了我
国能源缺口造成的巨大压力弘o。
收稿日期：200r7．12．17
基金项目：山东省中青年科学家奖励基金资助项目(2006BS02011)
作者简介：夏永振(1984一)，男。山东菏泽人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。
联系人：祁庆生，教授．E·IIlail：qiqin萨heng@sdu．edu．cn
万方数据
2008年7月 夏永振等：卢一葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达 ·5l·
纤维素乙醇工艺主要包括两个步骤，首先是生
物质水解产生还原糖，然后利用还原糖发酵产生乙
醇。目前决定成本的主要是第一步，即利用纤维素
水解产生还原糖【3J。这一步主要是利用纤维素酶
系将纤维素进行水解。具体过程是，首先利用葡聚
糖内切酶(endo一1，4毋-D—gluc肌ase，EC3．2．1．4)和
葡聚糖外切酶(exo一1，41争D-gluc觚se，EC3．2．1．91)
的协同作用将纤维素降解成纤维二糖和纤维寡糖，
然后在口．葡萄糖苷酶的作用下将纤维二糖和纤维
寡糖降解成葡萄糖HJ。而现有的纤维素酶系中，卢一
葡萄糖苷酶是其中的限制因素¨J。
目前，两种纤维素乙醇的工艺比较有竞争力，
一种是同步糖化发酵(simultalleoussacch撕ficatj伽
锄dfe珊entation，ssF)，另一种是联合生物加工
(con∞lidatedbi叩rocessing，CBP)p，6J。同步糖化发
酵过程是将生物质水解产生还原糖和还原糖发酵
产生乙醇组合到一起，在同一步骤进行，这样一方
面可以使还原出来的糖被酵母利用生成乙醇，解除
了产物对酶的抑制作用；另一方面降低了发酵罐中
的糖含量，从而降低了染菌几率。
同时，酵母的表面表达技术是近几年发展起来
的一项技术，它将目的蛋白和酵母的细胞壁蛋白融
合表达后，将目的蛋白固定在了酵母的表面。比较
常用的细胞壁蛋白有口凝集素、a凝集素和n01p
蛋白[J7。8|。据报道，表面表达不仅可以有效提高酶
活力的稳定性，而且可以将表达、纯化和固定合于
一体，节省时间和资源一1。
在此研究中，利用酵母的表面表达系统将来自
而掀聊艄西的口．葡萄糖苷酶固定在了酿酒酵
母的表面上，得到了有活性的表面酶，并测定了固
定化后酶的温度和pH性质变化，同时尝试并成功
地使异源表达了这种表面酶的酵母在以纤维二糖
为唯一碳源的培养基中生长。这为纤维素酶的同
步发酵工艺提供了帮助。
1材料和方法
1．1材料
1．1．1实验所用菌株和质粒
瑞氏木霉(舭lIlo如7，l口舰酬)由山东大学生命科
学学院汪天虹老师实验室馈赠。大肠杆菌DH5Q(E
cofiDH5akcz△M15凰积九鲫4)由本实验室保存，作
为重组质粒的扩增宿主。酿酒酵母菌EBY—100(＆
c唧疵池EBY一100)由本实验室保存，作为表达宿主。
质粒pYDl，由本实验室保存，作为表达载体。
1．1．2分子克隆用酶和试剂
限制性内切酶茚n1、TaqDNA聚合酶购自博美
生物试剂公司。AgaroseGelDNAPuri6c撕伽l(it，
T4DNA连接酶，DNAnagIIIentPu商cationl(it购自
宝生生物工程有限公司。核酸相对分子质量标准
(1Kb)购自Bio¨。
1．1．3培养基
LB培养基(g／L)：蛋白胨10、酵母膏5、№C110
用于E．co缸DH5a培养。氨苄青霉素(Ampicillin)
体积质量100mg／L；
YPD培养基(g／L)：蛋白胨20，酵母膏10，葡萄
糖20，用于酿酒酵母EBYl00培养；
MM培养基(g／L)：葡萄糖20，磷酸铵5，磷酸
氢二钠15，硫酸镁0．6，另添加氯化钙0．6，蛋白胨
2。另添加各种微量元素；
MinimalDextro∞Plates培养基(g／L)：YNB
6．7，亮氨酸0．1，葡萄糖20，用于酵母转化子的
筛选；
YNB—cAA培养基(g／L)：YNB6．7，酸水解酪
素5，葡萄糖或半乳糖20，用于转化子的转接或
诱导；
酶活检测培养基：YNB6．79g／L，酸水解酪素
5g／L，1mmoL／LpNPG，半乳糖20g／L，琼脂粉
20g／L，用于酶活性的初步验证；
发酵培养基(g／L)：YNB6．7，酸水解酪素5，纤
维二糖5，用于表面酶发酵。
1．2方法
1．2．1 总DNA提取和oved印PCR扩增目标基因
cDNA序列
用玻璃珠法¨卅提取得到瑞氏木霉的总DNA。
然后根据Genebank上的序列信息设计引物(表1)，
利用over—l印PCR¨¨得到了包含外显子E2和E3的
cDNA序列。将得到的6∥1cDNA序列构建到
pMDl8-T质粒中，得到了pMDl8一蟛1质粒，将得到
的质粒进行测序验证。
万方数据
· 52· 生物加工过程 第6卷第4期
表1 0verl印PcR设计的引物
Table1 蹦眦瑁usedinoverl印PCR
注：划线部分是外显子E：和E3重叠区
1．2．2重组质粒pYDl-6∥1的构建
对pMDl8—6鲥l质粒利用引物对(％Z—F：
GC型匹!垡!GrI，IGTAccTCCTGCAGGGAC；％Z—R：
CC丛!!!：卫cTAcGcTACCGACAGAGl[GC)将6∥1的
cDNA扩增出来，然后将经过勋乃l酶切后得到的酶
切产物进行胶回收后与同样处理的pYDl载体进行
连接，构建成pYDl-6∥1，经过酶切、测序验证，然后
电转化u21进入酿酒酵母EBY-100中。
1．2．3目标蛋白Bgll的表达和初步检测
含有pYDl—6∥1质粒的酿酒酵母EBY·100放人
20g／L葡萄糖的YNB-cAA培养基中培养，待菌体
生长到D‰在2—5之间时，4000r／min下离心10
min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(10mmoL／L，pH
7．5，PBS)将菌体洗涤2遍，后重新悬浮于20g／L半
乳糖的YNB—CAA中，使菌体∞600在0．5—1．O之
间，将菌体放人20℃摇床中，培养48h。从中取出
少量菌体点在酶活检测平板上，1d后，观察结果。
1．2．4酶活性的检测方法¨副
取1mL诱导的酵母细胞5000r／Illin下离心
8I血，去上清液，加入1．5mL含5mI蒯／LpM℃的
50mI叫／L醋酸盐缓冲液悬浮，反应8IIlin，
5000r／Illin下离心8lIlin，取上清液，1：1加入l瑚L／L
的Na2CO，，402砌下读取光度值(A舰)。将单位DD
菌体反应8IIlin，使402啪处光度值(A础)变化为
0．00l，定义为1个相对活力单位(u)，即，相对活力
(u)=(AA402×103)／OD啪，其中A啦是指在402啦
下反应液的光度值与对照的光度值之差。
1．2．5重组酶最佳诱导时间的确定
将酵母细胞诱导48h，每隔12h取样，测定其
表面酶相对活力，确定最佳诱导时间。
1．2．6重组酵母的最佳诱导温度和pH的确定
将诱导48h的酵母表面酶，分别放入40，45，
50，55，60，65，70，75℃一系列温度梯度的缓冲液
中，进行反应，然后放人96孔酶标板中，在酶标仪下
读取410nm处吸光值。
将诱导了48h的酵母细胞表面酶，分别放入广
谱pH缓冲体系配成的pH3—11的一系列
25mmoL／L缓冲液中，反应完成后，放人96孔酶标板
中，在酶标仪下读取410姗处分光光度值。
1．2．7Bgll表面酶的纤维二糖好氧发酵
将最佳诱导时间下的酵母细胞，在5000r／IIlin
下离心8min，收集茵体，用PBs将菌体洗涤，放入
等量的发酵培养基中进行发酵，每隔一定时间取
样，测菌体的DD鲫，另外取样离心，上清液利用高效
液相色谱法(HPLC)法测纤维二糖的含量。
1．2．8HPLC条件
纤维二糖的含量通过视差检测器(r曲．activein-
dexdetector)进行检测，所用高效液相色谱仪为日本
岛津公司生产，型号为10．LA。分离柱采用的是
NH2柱(250mm×4．6mm，5斗m，l(mm鹊il)，流动
相y(乙腈)：y(水)=75：25，流速是lmL／IIlin，进样
量是40灿，柱温是30℃【l引。
飞』：：∑二皇坠．a●●_■●—■●______-·-—·_-_●—■—●-__·_·一-
、12 兮、12 讣
◆咖訾情弛：和E胆鼍兰去b
1Iro岫PcR得到去除了12的6一l基因
E． E，
毒 一
吲l基因
图l o、，er-l叩PCR获得6∥l序列示意图
Fig．1sche眦of山e帆r．1apPcRfor吲l
2结果和讨论
2．1 重组质粒pYDl—6∥l的构建
利用玻璃珠法提取瑞士木酶的总DNA，利用方
万方数据
2008年7月 夏永振等：口一葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达 ·53·
法中设计的引物调出该基因的全序列，然后分别用
引物对1调取E2，引物对2调取E，，再用over—l印
PcR将E：和E，进行融合，得到了去除内含子I：的
专∥1的cDNA序列。重组质粒pYDl一略Zl按照方法
构建完成。在这个质粒中，6∥1基因和呼2基因融
合在一起，并在目标蛋白的末端加入了V5抗原基
因和His—tag标签，从而能方便将表达蛋白进行检测
和纯化。构建的质粒经检测和扩增，电转入酿酒酵
母EBYl00中，得到了阳性克隆酵母转化子。
图2 pYDl·^∥重组质粒构建的鉴定
Fig．2IdeII衄cati叩0fdlem伽出naInp：LasIIlidpYDl-Wl
2．2 目标蛋白Bgll的表达和初步检测
挑取上步验证正确的含pYDl—6∥1的转化子和
1株含有pYDl的对照菌株，在经过48h诱导表达
后，点到活性检测平板上培养。1d后，在菌落上各
点1滴lmoL／L的Na：cO，溶液，发现只有含有
pYDl—6∥1载体的阳性克隆子周围形成了黄绿色的
圆晕，说明含有pYDl一6∥l质粒的酵母拥有了卢-葡
萄糖苷酶的活性。
注：左边的是阴性对照，右边的是阳性克隆
圈3阳性克隆子活性初步鉴定
Fig．3Iden曲ca曲noftIIep∞itiVeclon船蚰
enz”ne-assayclIltlImmedi岫
2．3表面表达酶的最适酶活
pNPG是纤维二糖的类似物，结构是葡萄糖残
基通过p糖苷键连接1个对硝基苯，通过伊葡萄糖
苷酶降解后，对硝基苯被释放，在碱性条件下显色，
在402nm波长下有吸光值。根据此方法，笔者测定
了酶的最佳诱导条件。
在不同的诱导时间取样，分析诱导时间对诱导
喇1酶表达量的影响。发现在24h诱导时，酶活力
最高，再延长诱导时间反而使酶活力迅速下降(图
4)，可能是由于表面的异源蛋白不稳定造成。在一
系列的温度梯度和pH梯度下分别测取酶活，发现
最佳温度变化由原来的45—55℃变成了70℃；最
适pH为5．5，比游离酶的最适pH提高了l(图
5)¨5I，这可能是因为融合表达，也可能是因为酶处
于细胞表面，影响了蛋白的构象变化，或者两个情
况共同影响的结果¨2。。
600
500
晕加O
R
蜓300
叶，
曩200
l∞
0 10 20 30 40 50
诱导时间，Il
图4表面酶酶活随诱导时间的变化
Fig．4E丘＆tsoftheinducedtime叩the加tivityof
吼lrf函孢-engiIIeeredbeta·glucosidase
己
畏
j}g
霞
翼
电
器
!}g
靛
翼
图5表面酶比酶活随温度和pH变化的曲线
Fig．5Temperan啪锄dpHprom∞ofBurke咖乎neered
beta—glu嘲ida船
万方数据
·54· 生物加工过程 第6卷第4期
2．4 Bgll表面表达酶的纤维二糖好氧发酵
在以纤维二糖为唯一C源的培养基中发酵，每
隔一定时间测其菌体的0口鲫，发现表面表达有纤维
二糖酶的菌株有明显的生长现象，而对照菌株没有
(图6)。因此，可以判断异源表面表达的卢·葡萄糖
苷酶使该酿酒酵母拥有了可以降解纤维二糖的能
力。利用HPLc测定了各时刻纤维二糖含量，结果
表明培养阳性菌株发酵液中的纤维二糖被明显利
用了，但在培养186h后，发酵液中仍残留一定量的
纤维二糖。因此，这个系统可以为纤维素酶乙醇发
酵中纤维二糖酶不足的状况提供重要补充。同时，
这个系统也可以为固定化酶提供一种可用的方法。
图6以纤维二糖为C源的菌体生长
Fig．6G彤wⅡ10fenginee陀dye粕t∞
cellobio∞Inedium
vallR00yen等¨副发现酵母游离载体pYDl在没
有选择压力下表达蛋白不够稳定，所以本实验采用
了选择压力下的发酵，计划在本实验基础上进一步
利用酵母的同源重组，将口．葡萄糖苷酶基因插入酵
母的入位点【l引，这样可以保证在无压力条件下，仍
可得到稳定而且高效表面表达届一葡萄糖苷酶的酵
母菌，这为进一步构建可降解纤维素的酵母工程菌
提供了基础。
3结论
将表面表达技术应用于同步糖化发酵工艺的
一个尝试，对纤维素生产乙醇的工艺研究有一定的
借鉴意义。
(1)利用overl印一PCR的方法，成功得到了来自
Z劂“的6鲋l的cDNA序列，并将此基因克隆在酵
母表面。该酶的最佳诱导时间为24h，最适温度是
70℃，而酶活的最适pH为5．5。该酶的最佳诱导
时间为24h，再延长诱导时间反而使酶活力迅速下
降，这可能和异源蛋白不稳定有关；而酶活最适pH
以及最适温度的改变则可能是因为融合表达，也可
能是因为酶处于细胞表面，影响了蛋白的构象变
化，或者2种情况共同的影响¨21。
(2)以纤维二糖为唯一C源，对表达了Bgll酶
的细胞进行了发酵实验，发现该细胞可以利用纤维
二糖为唯一C源生长，在同步糖化发酵过程中，该
系统对纤维素酶系统中普遍存在的纤维二糖酶的
活力不高的情况具有良好的补充作用。计划后期
进一步利用酵母的同源重组，将口．葡萄糖苷酶基因
插入酵母的入位点¨6。，这样可以保证在无压力条件
下，仍可得到稳定而且高效表面表达口一葡萄糖苷酶
的酵母菌，从而降低成本，缩短实验步骤。
(3)该实验将酶固定化在细胞表面，相比于非
固定化的策略，提高了酶的有效浓度，因此提高了
酶的活力及菌体对纤维二糖的利用率，从而对纤维
素发酵产乙醇工艺中纤维二糖利用效率低的问题
给出了一种解决方法。
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南充6万t生物柴油项目获批复
南充炼化总厂生物柴油项目已通过国家发改委正式批复。2009年8月，年产6万t的该项目将试车投
产。该项目投资达1．8亿元，项目的安评、环评、职业危害评价均通过了国家相关部门审查。用于该厂开发
生物柴油的主要原料是麻风树，具有适宜种植、价格低廉、分布广等特点。
陕西生物质能发电项目在礼泉开工建设
陕西生物质能发电项目采用层燃+室燃的链条炉燃烧技术，利用在常温下压缩成块状的农作物秸秆作
燃料，进行燃烧发电，达到可再生资源的综合利用。由上海蓝鸟科技股份有限公司投资建设，设计安装3台
130∥h高温高压锅炉，配3台30Mw凝汽式汽轮发电机组，利用当地废弃的果树枝条和农作物秸秆作为燃
料。建成投产后，年发电6亿kW．h，为群众间接增收2亿多元，实现产值3亿元，利税5000万元以上。与
同类型的煤电项目相比，每年可减排CO：20万t以上，既节省了资源，改善了农村环境，又增加了农民收入，
促进地方经济发展。
(朱宏阳)
万方数据