全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
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收稿日期&$%%. 8%. 8&)
基金项目&国家重点基础研究发展计划$.-# 计划%资助项目 $$%%-*Y-%-!%," $%%-*Y-&,#%,%)国家高技术研究发展计划$!)# 计划%资助项目
$$%%)((%$%&%$" $%%)((%$%&%#" $%%)((%$%$%&" $%%-((&%%,%,%)国家自然科学基金资助项目$ $%!-)%&&%)北京市自然科学基金
资助项目$$%-&%%$%)北京市教育委员会共建项目
作者简介&王晓楠$&.!,#%"男"河南鹤壁人"硕士研究生"研究方向&微生物发酵)谭天伟$联系人%"教授"XN<=;G&:`:=?e<=;G72HC:7B@H7C?
丙酮酸对肺炎克雷伯氏菌微氧发酵甘油
产 E"@ 丙二醇的影响
王晓楠"王凤寰"吴家鑫"谭天伟
$北京化工大学 生命科学与技术学院 北京市生物加工过程重点实验室"北京 &%%%$.%
摘"要&微氧条件下"考察肺炎克雷伯氏菌发酵生产 &"# 丙二醇过程中柠檬酸和丙酮酸对发酵过程的影响 摇瓶
实验结果表明&添加柠檬酸能抑制菌体生长和 &"# 丙二醇合成)丙酮酸对菌体生长和 &"# 丙二醇合成有一定的
促进作用 T发酵罐批式发酵表明&补料培养基中加入 ! J0T丙酮酸"&"# 丙二醇的产量提高了约 &%f!k"转化
率提高了约 ,f,k"比生长速率提高了约 &%f!k 上述结果初步表明"强化能量的产生能够有效促进 &"# 丙二醇
的合成"可以利用分子生物学手段强化丙酮酸的产生以促进 &"# 丙二醇的合成
关键词&丙酮酸)&"# 丙二醇)微氧发酵
中图分类号&1!&""""文献标志码&(""""文章编号&&)-$ 8#)-!$$%&%%%# 8%%$# 8%
#770:G279B43R5G02/H.:425042M.:704H0/G5G.2/27E"@S94295/0J.26
742H;6B:0426MB *(+,#(% -..&".#%
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N0B O24J1&9OFH]=:B)&"#N5U)<;CF>=BF>2;CEBF?
""&"# 丙二醇$&"#N9F>9=?B@;>G"简称 &"# 5U%
是 & 种重要的化工原料"在药物(聚酯(抗冻剂(溶
剂(保护剂的合成领域有很好的应用前景,&- &"#
5U的生产方法主要有化学法和微生物发酵法"鉴于
微生物发酵法选择性好(转化率高"已经引起了广
泛的重视,$- "但存在终产物浓度低(生产周期长和
甘油转化率低等问题"导致缺乏市场竞争力而无法
实现工业化
""克雷伯氏菌$)(*+#(% ,-/&"-#%%以甘油为唯
一*源发生歧化反应"通过氧化和还原 $ 个支路生
产 &"# 5U"通过(_5和/(UL
$
来维持代谢通量平
衡,#- 丙酮酸作为发酵生产 &"# 5U过程中的重
要代谢中间物"与氧化途径有着密不可分的关系"
KB?J等,,-提到丙酮酸代谢是 )f,-/&"-#%厌氧利
用甘油发酵的重要代谢步骤之一 此前已有较多
研究报道过添加富马酸,- (丁二酸,)-等三羧酸循环
$_*(% 代谢物和乙酸,-- 等其他副产物,! 8.- 对
&"# 5U发酵过程的影响"但丙酮酸对发酵的影响
却很少被关注 本文重点研究丙酮酸对发酵生产
&"# 5U的影响"并初步分析原因
E?材料与方法
EPE?菌种和培养基
""本实验所用菌种为重组克雷伯肺炎杆菌
)f,-/&"-#%P*a**$&&&
""培养基 $J0T%&c
$
L5+
,
!#L
$
+#f,"cL
$
5+
,
&f#"$/L
,
%
$
S+
,
,"aJS+
,
%f$,"*=*+
#
%f"酵母浸
粉 #f!"葡萄糖 !"甘油 $%"富马酸,&%- %f%$ 微量
元素 普通补料&)%k甘油(-fk葡萄糖和 #$fk水
""微量元素溶液$J0T%&\BS+
,
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$
+&"K?*G
$
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,
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$
+%f%#"*>*G
$
!$L
$
+%f$
#-kL*G", EPC?培养方法
""微氧条件采用 $% &%% 养时间&$ 4 发酵罐培养在上海保兴 Y[+_X*L
$%%$ 型 T发酵罐中进行"初始装液量$ T"接种量
&%k"通气量%f, T0<;?"搅拌转速#%% F0<;?"发酵温
度为#- l"自动加入, <>G0T的 c+L维持 9L-f%"
流加补料维持甘油质量浓度在 &% g$% J0T
EP@?分析方法
""取发酵液稀释至合适倍数"蒸馏水为对照"用
分光光度计测定QH
)%%

""发酵液中主要化学成分采用岛津 T* &%(高
效液相色谱分析"检测器为Z[U &%(示差检测器"
色谱柱为 Y;>NZ=@ 公司 (<;?BDL5^ !-L有机酸
离子交换柱"柱温) l"流动相为 <<>G0TL
$
S+
,
"
流速为%f) 心&% <;?"然后取上清液稀释 &%% 倍"用%f$$
!
<微
滤膜过滤"即得试样
""发酵过程中采用高碘酸钠滴定法,&%-可以快速
测定甘油"实现控制底物浓度的目的)而文中提到
的所有甘油浓度值都是通过液相色谱测定的
C?结果与讨论
CPE?摇瓶培养条件下丙酮酸质量浓度对产物合成
的影响
""$% &%(& J0T的丙酮酸$5OF%"用c+L调灭菌前培养基
9L为 -f% r%f#"发酵&$ 4"结果如图 & 所示
图 E?丙酮酸加入量的分析结果
Q.;=E?*/56B1.17245JJ./; J.7040/G5H23/G1
279B43R5G0
""由图 &可知"随着丙酮酸加入量的增加"QH逐渐
提高$未在图中显示%"乳酸$T=C%(琥珀酸$SHC%(柠
檬酸$*;:%和甲酸$\>F%的浓度却逐渐增多"而乙酸
$(CB%和 $"# 丁二醇$$"# YU%与 &"# 5U的浓度
逐渐降低 原因可能是随着丙酮酸添加量的增加"下
游与丙酮酸直接相连的乳酸(乙酰辅酶(和

酮戊
二酸的浓度必定增加

酮戊二酸作为 _*(循环
内的 &种物质"由于过量导致整个循环受阻"不能提
供充分的(_5和/(UL
$
)$"# YU与 &"# 5U的产
生都需要还原当量/(UL
$
"/(UL
$
含量降低势必造
成 $"# YU与 &"# 5U的浓度逐渐降低
""由此可见"只有控制合理的丙酮酸添加量才能
促进细胞的代谢"有效提高甘油转化率和 &"# 5U
的单位产量
CPC?摇瓶培养条件下柠檬酸浓度对产物合成的
影响
""实验条件同 $f&"结果如图 $ 所示 由图 $ 可
,$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
知"随着柠檬酸浓度的提高"QH$图中未显示%和
&"# 5U的终浓度低于初始值)乳酸(甲酸(乙酸的
终浓度高于初始值且逐渐升高
图 C?柠檬酸加入量的分析结果
Q.;=C?*/56B1.17245JJ./; J.7040/G5H23/G127:.G45G0
""柠檬酸是_*(循环的中间代谢物"加入少量柠
檬酸时"柠檬酸的合成受到抑制)其前体草酰乙酸和
乙酰辅酶(得到富集"乙酰辅酶(较多地代谢为乙
酰磷酸"进而代谢为乙酸 如图 $ 所示"乙酸浓度远
高于空白值"这对菌体的进一步生长代谢有着很大的
毒害作用"QH$图中未显示%和 &"# 5U均低于空白
随着柠檬酸浓度的提高"在较低浓度时"下游的

酮
戊二酸生成量提高"$"# YU由

酮戊二酸代谢而
来"故 $"# YU此时浓度提高)而当柠檬酸浓度过高
时"对_*(循环的抑制作用极其明显"所以_*(循环
中的

酮戊二酸的产量就较低"$"# YU产量也相
应降低
CP@?有机酸的种类和浓度对摇瓶发酵过程中,源
代谢的影响
""方法同 $f&"摇瓶中添加一定量的丁二酸(柠檬
酸和丙酮酸"培养&$ 4后用发酵罐的罐载 9L计测
定发酵液的酸碱度"结果如图 # 所示
""图 #中&5OF 指添加 J0T丙酮酸"5OF &% 指
添加 &% J0T丙酮酸"5OF & 指添加 & J0T丙酮酸"
SHC 指添加 J0T丁二酸"SHC &%指添加 &% J0T
丁二酸"SHC &指添加& J0T丁二酸"*;: 指添加
J0T柠檬酸"*;: &% 指添加&% J0T柠檬酸"*;: &
指添加 & J0T柠檬酸
""由图 # 可知"整个发酵过程中未另外加入碱类
物质"添加有机酸的摇瓶&$ 4后的 9L都要高于相
应的对照摇瓶"而添加丙酮酸的摇瓶要明显高于加
入丁二酸和柠檬酸的摇瓶 由此可见"添加丙酮酸
的摇瓶最终的产酸量较少 为了进一步确认这个
实验结果"考察发酵液中醇类物质的浓度 $将
图 @?有机酸对摇瓶发酵液9"的影响
Q.;=@?#70:G12724;5/.:5:.J12/9"
&"# 5U和$"# YU按碳元素个数折合成一元醇浓
度计算%"结果如图 , 所示 由图 , 可知"添加丙酮
酸的各摇瓶中醇类物质的含量明显高于其他各瓶"
而添加其他有机酸的各摇瓶中甘油的消耗量基本
相同且大部分低于对照实验
图 T?发酵液中醇类浓度对比图
Q.;=T?Y.7040/G56:2-26:2/:0/G45G.2/1./M42G-
""由此可见"添加丙酮酸有利于菌体将*(/源较
多地转化为醇类物质"而转化为酸性物质较少)提
高甘油的转化率的同时"能够相对减少中和剂的用
量"从而有效降低成本
CPT?全自动发酵罐培养条件下丙酮酸对菌体生长
和产物合成的影响
""在 T发酵罐中进行补料批式发酵实验"
$%%.%$&-批次为对照组"补料为普通补料)$%%.%$&.
批次为实验组"补料中添加&! J丙酮酸 选取生物
量(&"# 5U($"# YU(甲酸(乙酸(丙酮酸(乳酸(琥
珀酸 !项指标进行比较"结果如图 g!所示
""由图 g! 可知&实验组菌体浓度较对照组稍
低)而实验组的 &"# 5U($"# YU(甲酸(丙酮酸(
丁二酸和乳酸的浓度都较对照组高
$"第 # 期 王晓楠等&丙酮酸对肺炎克雷伯氏菌微氧发酵甘油产 &"# 丙二醇的影响
图 U?丙酮酸对*P-./&".#%生长的影响
Q.;=U?#70:G1279B43R5G02/*P-./&".#% 1`;42OG-
图 W?丙酮酸对*P-./&".#%发酵生产 E"@ XY
和 C"@ 8Y的影响
Q.;=W?#70:G1279B43R5G02/G-0;0/045G.2/27
E"@SXY5/JC"@S8Y
图 Z?丙酮酸对*P-./&".#%发酵生产甲酸
和乙酸的影响
Q.;=Z?#70:G1279B43R5G02/G-0;0/045G.2/27
724H.:5:.J5/J5:0G.:5:.J
""添加适量 $整个过程中质量浓度不高于
&f% J0T%的丙酮酸"发现代谢途径中与丙酮酸直接
关联的乳酸(甲酸(

酮戊二酸和乙酰辅酶 (的浓
度都有所增加"同时适量丙酮酸有利于促进_*(循
环 乳酸作为一个代谢支路的终端代谢物"将会不
断积累 甲酸进一步代谢为 *+
$
和 L
$
+"发酵液中
*+
$
的浓度取决于罐压和发酵液的渗透压 两批次
图 >?丙酮酸对*P-./&".#%发酵生产丙酮酸(琥
珀酸和0 乳酸的影响
Q.;=>?#70:G1279B43R5G02/G-0;0/045G.2/27
9B43R5G0"13::./5G05/J0S65:G5G0
实验罐压基本相同"但实验组发酵液的渗透压要高
于对照组"故实验组甲酸浓度要高于对照组$见图
-% _*(循环活跃提供充足的 (_5和 /(UL
$
"而
&"# 5U($"# YU和丁二酸的生成都需要 (_5和
/(UL
$
"故实验组 &"# 5U($"# YU(甲酸(丙酮
酸(丁二酸和乳酸的浓度都较对照组高 此外"乙
酰辅酶(浓度的增加可以促进乙酸的合成"乙酸前
期过量抑制了菌体的生长"这正是实验组菌体浓度
较对照组稍低的原因
""上述结果初步表明"外源添加丙酮酸可以有效
提高 &"# 5U的终浓度和甘油的转化率"最终
&"# 5U的产量提高了约 &%f!k"转化率提高了约
,f,k"比生长速率提高了约 &%f!k )f,-/&"-#%
的代谢途径中"& <>G甘油代谢为 & <>G丙酮酸会产
生 & <>G(_5和 $ <>G/(UL
$
"可见内源产生的丙酮
酸较外源添加产生更多的 (_5和 /(UL
$
李春
等,.-曾提到在培养基或厌氧发酵过程中外源添加
适量还原剂$如 d
*
%"增强菌体中还原当量 /(UL
$
的积累"以提高 &"# 5U的质量浓度和转化率 所
以通过分子生物学手段强化丙酮酸的产生可以产
生更多的能量"积累还原当量 /(UL
$
"从而提高
&"# 5U的终浓度和甘油转化率
@?结?论
""摇瓶培养基中添加适量的丙酮酸能提供
)f,-/&"-#%生长代谢所需充足的(_5和/(UL
$
"
对菌体生长(&"# 5U和其他代谢终产物合成都有
一定程度的促进作用 丙酮酸的加入能够促进菌
体较多地代谢为醇类物质"减少中和剂的使用量
摇瓶培养基中加入一定量的柠檬酸能够促进乳酸(
)$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
乙酸和 $"# YU的代谢"对菌体生长和 &"# 5U的
合成有抑制作用"并且随着添加量的增加相应的促
进和抑制作用增强
"" T发酵罐上进行补料批式发酵实验结果表
明"在补料中添加一定量丙酮酸"最终 &"# 5U的
产量提高了约 &%f!k"转化率提高了约 ,f,k"比生
长速率提高了约 &%f!k)其他副产物含量也都有一
定程度的提高"这是(_5和还原当量/(UL
$
较对照
组充足的表现
参考文献&
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