全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月 生"物"加"工"过"程 -:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ bB.2! +B2# ]H.K$%&%
GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$=(*!2$%&%2%#2%%$收稿日期"$%%/ =&$=$/
基金项目"昆明理工大学科学研究基金资助项目#NNP%$%%$*%/&$%云南省教育厅面上项目#NN]5$%%!*&(#$作者简介"赵国振#&/!#&$男江苏徐州人硕士研究生研究方向"生物基化学品%熊向峰#联系人$讲师TRA,@." @^,CJDECJ^c0@C,2IBA 马铃薯淀粉同步糖化发酵制备 , 乳酸 条件的统计学优化 赵国振熊向峰陈朝银葛"锋刘迪秋韩本勇 #昆明理工大学 生命科学与技术学院昆明 *)%$$#$
摘"要"以马铃薯淀粉为原料采用同步糖化发酵方法制备乳酸( 通过 ;.,IhE?RYHFA,C 实验设计对影响乳酸产量
的 个因子进行筛选结果表明淀粉质量浓度)糖化酶用量和发酵温度 ( 个因素对乳酸产量影响显著( 利用最陡
爬坡试验逼近最大响应区采用中心复合实验设计及响应面分析法进行回归分析建立影响乳酸产量的二次模型(
模型求解得出最优淀粉质量浓度为 $&d!/ J6V糖化酶用量为$*)d%/ W6J发酵温度为 (/d%) e最大理论乳酸产
量为 &/*d// J6V( ( 批验证实验结果平均值与预测值接近表明该模型与实际情况拟合良好实际最大乳酸产量为
&/(d* J6V较优化前提高了 &(d/i! 乳酸的平均纯度达到 /)d$i( 关键词"发酵%! 乳酸%马铃薯淀粉%同步糖化发酵 中图分类号"f7/$&""""文献标志码"5""""文章编号"&*$=(*!#$%&%$%# =%%%* =%* +9F.G.H5F.2/27942I3:F.2/27,V65:F.:5:.I742G92F5F2 1F54:-JA 1.G36F5/023115::-54.7.:5F.2/5/I704G0/F5F.2/ P45>OHBR9:ECSM>+OS@,CJRDECJ-4T+-:,BRK@COTUECJVMW3@RX@H45+YECRKBCJ #-B.EJEBDV@DEQI@ECIE,CG fEI:CB.BJK NHCA@CJWC@\EF0@?KBDQI@ECIE,CG fEI:CB.BJK NHCA@CJ*)%$$# -:@C,$
*J1F45:F"f:E1FBGHI?@BC BD.,I?@I,I@G DFBA1B?,?B0?,FI: 8K0@AH.?,CEBH00,II:,F@D@I,?@BC ,CG DEFAEC?,?@BC
Z,0@C\E0?@J,?EG2;.,IhE?RYHFA,C GE0@JC Z,0H0EG ?BE\,.H,?E?:EEDEI?0BD0E\EC D,I?BF0DBF.,I?@I,I@G
1FBGHI?@BC2f:EFE0H.?00:BZEG ?:,?0?,FI: IBCIEC?F,?@BC J.HIB,AK.,0EGB0,JE ,CG DEFAEC?,?@BC ?EA1EF,R
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?:FEED,I?BF02-EC?F,.IBA1B0@?EGE0@JC ,CG FE01BC0E0HFD,IEAE?:BGB.BJKZ,0H0EG ?B@C\E0?@J,?E?:E@C?EFR
,I?@BC BD?:E\,F@,8.E0,CG ?B,0IEF?,@C ?:EB1?@A,.\,.HE0BD?:ED,I?BF0D@C,.K.E,G@CJ?B?:EA,^@AHA.,IR
?@I,I@G 1FBGHI?@BC2f:E?:EBFE?@I,.B1?@A,.IBCG@?@BC0ZEFE,0DB.BZ0" 0?,FI: IBCIEC?F,?@BC $&d!/ J6V J.HIB,AK.,0EGB0,JE$*)d%/ W6J ,CG DEFAEC?,?@BC ?EA1EF,?HFE(/d%) e2f:EA,^@AHA?:EBFE?@I,.K@E.G
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Z,0&/(d* J6V,CG Z,0&(d/i :@J:EF?:,C ?:EBF@J@C,.BCE2f:E1HF@?KBD!R.,I?@I,I@G Z,0B\EF/)d$i2 K0A L24I1"DEFAEC?,?@BC% !R.,I?@I,I@G% 1B?,?B0?,FI:% 0@AH.?,CEBH00,II:,F@D@I,?@BC ,CG DEFAEC?,?@BC ""乳酸及其衍生物被广泛应用于食品)医药)农 业)日用品)环保)化工等领域( 尤其是近年来人 们利用乳酸生产生物可降解塑料)绿色包装材料及 农用薄膜等来解决日益严重的资源短缺和环境污 染问题引起了人们极大的关注展示了乳酸及其 衍生物广阔的应用前景*& =$+ (
目前用于乳酸生产的原料大都是玉米等粮食
作物不仅价格高而且对我国的粮食安全构成一定
的影响( 马铃薯块茎中富含丰富的淀粉)维生素和
微量元素且马铃薯具有产量高)适应性广)耐旱耐
瘠等特点( 而我国是世界上最大的马铃薯生产国
拥有丰富的马铃薯资源但加工业却很薄弱因此
开发马铃薯生产乳酸具有广阔的应用前景*(+ (
同步糖化发酵#Q@AH.?,CEBH00,II:,F@D@I,?@BC ,CG
DEFAEC?,?@BCQQU$模式最早在燃料乙醇的生产中得 到应用*#+ ( 同步糖化发酵不仅可以避免葡萄糖浓 度过高对水解过程中酶活力和乳酸发酵的抑制而 且可以充分利用设备缩短发酵周期节约能源这 一发酵模式得到不断推广在乳酸发酵生产中也得 到了一定应用*) =*+ ( 发酵条件的优化涉及大量的实验研究是耗 时)耗力)耗费的过程它往往影响产物的生产效率 和成本( ;.,IhE?RYHFA,C 设计和响应面法克服了传 统的单因素法实验次数多)实验周期长和结果不准 确等缺点可以从众多影响因子中快速有效地筛选 出主效因子并实现其水平的优化已被成功地运 用于多种微生物发酵条件优化工作中* =!+ ( 本研究 采用;.,IhE?RYHFA,C设计法)最陡爬坡法和响应曲 面法对鼠李糖乳杆菌以马铃薯为原料在 QQU模式 下发酵生产乳酸的条件进行优化找到影响乳酸产 量的关键因子并确定最佳条件( D?材料与方法 D=D?菌种 鼠 李 糖 乳 杆 菌 # !$)40($)*+, /.$7&0,$-M--*%%(购自中国工业微生物菌种保藏管理中 心由昆明理工大学 清华大学生物资源开发工程研 究所驯化并保藏( D=B?培养基 &2$2&"种子培养基#J6V$葡萄糖 )%)酵母膏 &%)乙酸钠 %d))柠檬酸二铵 %d$) N
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&2$2$"初始发酵培养基#J6V$马铃薯淀粉$)%)酵母膏 &))乙酸钠 %d))柠檬
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$>%d%&( D=M?分析方法 还原糖的测定"采用3+Q法*/+ ( 乳酸含量的测定"采用T3f5定钙法*&%+ ( ! 乳酸光学纯度的测定"YBE:F@CJEF ,`CCR :E@A,0试剂盒分析法( D=@?同步糖化发酵过程*DD+ 在装有 &%% AV发酵培养基的$)% AV三角瓶中
加入-,-.
$#淀粉质量的 %d$i$和 " 淀粉酶 #&% W6J$/% e蒸煮 (% A@C冷却后加入糖化酶#$)% W6J$和-,->
(
#&$) J6V$按 !i接种量加入活化的菌
液( e恒温振荡培养摇床转速 &#% F6A@C(
D=P?W65:X0FV834G5/实验设计
通过 ;.,IhE?RYHFA,C 设计法对淀粉质量浓度)
酵母膏质量浓度)糖化酶用量)接种量)发酵温度)发
酵时间)-,->
(
加入量 个因素进行重要因素的筛选
并设定 $个虚拟项( D=Q?最陡爬坡试验 根据;.,CIhE?RYHFA,C实验设计法筛选出的因 素及效应进行爬坡试验( D=R?响应面分析 根据;.,CIhE?RYHFA,C实验设计法和最陡爬坡 试验确定因素与水平后采用中心复合实验设计进 行响应面分析实验( D=>?验证实验 在最佳条件下进行验证实验计算实验值与预 测值之间的误差( B?结果与讨论 B=D?W65:X0FV834G5/实验 本文以乳酸产量为响应值采用实验次数"m &$ 的实验设计设计表见表 &结果见表 $( 表 D?W65:X0FV834G5/实验设计因素与水平 E5J60D?Y5/;027I.7040/F75:F241./Z01F.;5F0I L.F-W65:X0FV834G5/ 代码 因素 编码水平 =& l& D & ! #淀粉$6#J!V=&)% (%%
D
$糖化酶用量6#W!J=&$ $)% (%% D ( ! #酵母膏$6#J!V=&$&)$%
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发酵温度6e ( #)
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接种量6i ! &$D 发酵时间6:$ !#
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&$) &)% D / 虚拟项$
"第 # 期 赵国振等"马铃薯淀粉同步糖化发酵制备 ! 乳酸条件的统计学优化
表 B?W65:X0FV834G5/实验设计表以及实验结果
E5J60B?#[904.G0/F56I01.;/5/I40192/10Z5630127W65:X0FV834G5/
编号 D
&
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$D ( D # D ) D * D D ! D / ! #乳酸$6
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/ =& =& =& & & & =& & & &&)d/
&% & =& =& =& & & & =& & &!/d(
&& =& & =& =& =& & & & =& &(d&
&$=& =& =& =& =& =& =& =& =& /!d/ ""由表 ( 可知淀粉质量浓度)糖化酶用量和发酵 温度 ( 个因素置信度在 /%i以上所以上述三因素 被选为重要因素作为主要研究对象进行优化( 而 其他 # 个因素根据其效应性选择实验水平酵母膏 质量浓度和发酵时间具有正效应取高水平接种 量和-,-> ( 加入量具有负效应取低水平( 表 M?W65:X0FV834G5/实验设计效应分析 E5J60M?W54F.5640;4011.2/:207.:.0/F15/I5/56A1.1 27F-0.41.;/.7.:5/:0 因素 效应 系数 E # 常量 &*%d#)! *%d)! % D & *$d)& (&d$)! &&d!% %d%% D$
$$d(& &&d&)! #d$& %d%)$ D ( (d$!( &d*#$ %d*$ %d)// D # d%)% (d)$) &d(( %d(&) D ) &/d&* /d)!( (d&/ %d%!* D * =$d&!( =&d%/$ =%d#& %d$% D &*d#(( !d$& $d# %d&&$ D ! =&d)%% =%d)% =%d$) %d!$* D / =d&%% =(d))% =&d&! %d()/ "注"# " %d& 认为该因素影响显著( B=B?最陡爬坡试验 根据 ;.,IhE?RYHFA,C 法筛选出的淀粉质量浓 度)糖化酶用量和发酵温度 ( 个显著因素的效应大 小设计它们的步长进行最陡爬坡试验设计寻找 最大产量区( 试验设计及结果如表 # 所示( 表 @?最陡爬坡试验设计及其试验结果 E5J60@?!F00901F:6.GJ./; 0[904.G0/F56I01.;/ 5/I40192/10Z56301 编号 ! #淀粉$6 #J!V =& $ 糖化酶用量6 #W!J =& $ 发酵温度6 e ! #乳酸$6 #J!V =& $ & $)% $)% ( &!/d* $ $*% $*% (! &/$d# ( $% $% (/ &/%d( # $!% $!% #% &!/d! ) $/% $/% #& &/%d$ * (%% (%% #$ &!d) ""由表 # 可知最大乳酸产量区在第 $ 次试验附 近故以第 $ 次试验的条件即淀粉质量浓度 $*% J6V糖化酶用量 $*% W6J发酵温度 (! e作为 响应面实验因素水平的中心点( B=M?中心复合设计和响应面分析 采用中心复合实验设计结合响应面分析方法 以淀粉质量浓度)糖化酶用量和发酵温度 ( 因素为 自变量乳酸产量为响应值对同步糖化发酵生产 乳酸的发酵条件进行优化( 中心复合实验设计因 素水平见表 )实验设计及结果见表 *回归分析结 果见表 方差分析结果见表 !( ! 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" 表 P?中心复合实验设计因素与水平 E5J60P?Y5/;027I.7040/F75:F241./Z01F.;5F0IL.F-,,\I01.;/ 代码 编码水平 =&d*!& / =& % & &d*!& / D &$$ *d$*$#% $*%$!% $/(d# D$
$$*d$* $#% $*% $!% $/(d# D ) (#d*( (* (! #% #&d( 表 Q?中心复合实验设计及结果 E5J60Q?,,\I01.;/5/I40192/10Z56301 编号 编码水平 D & D $ D ) ! #乳酸$6 #J!V =& $ & % =&d*!& / "% &#d& $ &d*!& / % "% &*!d) ( =& & "& &#!d( # & =& =& &!d$ ) & =& "& &!!d* * & & "& &/#d! % &d*!& / "% &!$d# ! % % "% &/&d! / % % "&d*!& / &!)d* &% % % "% &/$d* && % % =&d*!& / &d! &$ & & =& &!&d* &( =& =& =& &))d* &# % % "% &/(d) &) % % "% &/&d$ &* % % "% &/$d# & =& =& "& &)%d* &! =&d*!& / % "% &#*d# &/ =& & =& &)$d! $% % % "% &/(d( 表 R?中心复合实验的回归分析结果 E5J60R?Y0;4011.2/5/56A1.127,,\I01.;/ 因素 系数 标准误差 E # 常量 &/$d)#) $d)* )d%%* % D & &$d*( &d%( d##% % D $ &d()$ &d%( %d/# %d##* D ) &d//( &d%( &d&% %d$*/ D & D & =&$d!/) &d*)! =d! % D $ D $ =)d)#& &d*)! =(d(#$ %d%% D ) D ) =#d($$ &d*)! =$d*% %d%$*
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$&d!(!$d $$) %d!$* %d#$! S & S ) #d&(! $d$$ ) &d!)/ %d%/(
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$S ) %d#&($d $$) %d&!) %d!) ""用 @`C@?,8&) 软件对实验数据进行二次多项式 回归拟合得到乳酸产量对上述三因素的三元二次 拟合回归方程为 ""Fm&/$d)#) l&$d*(D & l&d()$D $ l&d//(D ) = &$d!/)D & D & =)d)#&D $ D $ =#d($$ D
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$l #d&(!D & D ) l%d#&(D$
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方差分析显著性检验表明>$m/$d/$i方程 回归性显著且能够较好地反映真实值和预测值之 间的关系因此该模型可用于以马铃薯淀粉为原料 进行同步糖化发酵制备乳酸的产量分析与预测( 表 >?中心复合实验的方差分析 E5J60>?<54.5/:05/56A1.127,,\I01.;/ 方差来源 自由度 单方和 调整平方和 调整均方差 B # 回归 / )$%$d%% )$%$d%% )!d%%% &#d)/ % 线性 ($ $$d#& $$$ d#& )d#*/ &/d&$% 平方 ($ *#d *#d$/$&d#$($(d$* % 交互作用 ( &*)d($ &*)d($))d&%! &d(/ %d(%$
残差误差 &% (/*d& (/*d& (/d*&
失拟 ) (/$d(# (/$d(# !d#* &%$d() % 纯误差 ) (d!( (d!( %d* 合计 &/ ) )/!d& /"第 # 期 赵国振等"马铃薯淀粉同步糖化发酵制备 ! 乳酸条件的统计学优化 ""对回归方程求解得模型极值点D & m%d)/# )( D$
m%d$)# !&D ) m%d)$* * $$分别对应为淀粉质量 浓度 $&d!/ J6V糖化酶用量 $*)d%/ W6J发酵温度 (/d%) e最大乳酸产量达到 &/*d// J6V( 根据中心复合实验结果绘制响应面分析图结 果见图 & k图 (( ""图 & 显示了淀粉质量浓度和糖化酶用量对乳酸 产量的交互影响效应( 由图 & 可以看出"这 $ 个因 素存在一定的交互作用( 在较低区域内随着淀粉 质量浓度的增加乳酸产量逐渐增加但淀粉质量 浓度在较高区域时随着淀粉质量浓度的增加乳 酸产量反而降低( 这可能是由于淀粉质量浓度过 高经糖化酶水解得到的葡萄糖质量浓度也随之过 高进而出现了底物的抑制现象( 在一定区域内 糖化酶用量的增加可以提高乳酸产量但用量超过 一定范围后乳酸产量反而降低这可能是因为较 大的糖化酶用量在一定程度上加快了淀粉的水解 速度使底物葡萄糖质量浓度过高进而产生了底 物的抑制作用( 从图 & 还可以看出最低淀粉质量 浓度为 $*) k$) J6V糖化酶最低用量为 $*% k$% W6J( 图 D?乳酸产量与淀粉质量浓度)糖化酶用量的关系 N.;=D?!3475:0G3F356V./7630/:07241F54:- :2/:0/F45F.2/5/I;63:25GA6510I215;0 2/F-0942I3:F.2/2765:F.:5:.I ""图 $ 显示了淀粉质量浓度和发酵温度对乳酸产 量具有较大的交互影响效应( 由图 $ 还可以看出" 淀粉浓度在较高区域内随着发酵温度的升高乳 酸产量增加很快达到最高点后处于平稳状态( 淀 粉质量浓度在较低区域内随着发酵温度的升高 乳酸产量先逐渐增加达到最高点后又逐渐降低( 发酵温度在高低不同的区域内时淀粉质量浓度也 显示了同样的效果说明淀粉质量浓度和发酵温度 对响应值乳酸产量具有很显著的交互作用( 由图 $ 还可以看出淀粉质量浓度在 $*) k$) J6V发酵温 度为 (! k#% e乳酸产量最大( 图 B?乳酸产量与淀粉质量浓度)发酵温度 的关系 N.;=B?!3475:0G3F356V./7630/:07241F54:- :2/:0/F45F.2/5/I704G0/F5F.2/F0G9045F340 2/F-0942I3:F.2/2765:F.:5:.I ""图 ( 显示了糖化酶用量和发酵温度对乳酸产量 的交互影响效应( 糖化酶用量和发酵温度在一定 程度上可以提高乳酸产量这是由于糖化酶用量的 增加或发酵温度的升高提高了糖化酶的活性加 快了糖化速度进而有更多的葡萄糖可转化生成乳 酸但温度过高会对菌株自身的生长产生负影响 进而影响乳酸产量( 由图 ( 还可以看出糖化酶用 量和发酵温度分别为 $*% k$% W6J和 (! k#% e 时乳酸产量存在最大值( 图 M?乳酸产量与糖化酶用量)发酵温度的关系 N.;=M?!3475:0G3F356V./7630/:0724;63:25GA6510 I215;05/I704G0/F5F.2/F0G9045F340 2/F-0942I3:F.2/2765:F.:5:.I %& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" B=@?验证实验 ""在最优条件下进行验证实验验证结果见表 /( ( 次实验平均值为 &/(d* J6V与预测值之间的误差 为 &di( 与优化前 &% J6V相比乳酸产量提高了 &(d/i! 乳酸的平均纯度达到 /)d$i( 表 ]?验证实验结果 E5J60]?#[904.G0/F56Z04.7.:5F.2/27F-0G2I06JA 29F.G.H0I:2/I.F.2/1 实验号 ! #乳酸$6#J!V=&$ ! 乳酸纯度6i & &/#d$ /)d& $ &/(d& /#d! ( &/(d) /)d* M?结?论 采用 ;.,IhE?RYHFA,C 实验设计筛选出对乳酸 产量影响显著的因素为淀粉质量浓度)糖化酶用量 和发酵温度( 采用最陡爬坡试验得出合适的中心点 为淀粉质量浓度 $*% J6V糖化酶用量$*% W6J发酵 温度 (! e( 采用中心复合实验设计进行响应面分 析对实验的结果进行二次回归曲线拟合并用统计 学的方法进行分析得出最优淀粉质量浓度为 $&d!/ J6V糖化酶用量为$*)d%/ W6J发酵温度为 (/d%) e最大乳酸产量达到&/*d// J6V( 在最优条 件下进行验证实验( 次实验平均值为 &/(d* J6V误 差 &di与优化前相比乳酸产量提高了 &(d/i ! 乳酸的平均纯度达到 /)d$i( 与传统的糖化与发 酵工艺相比同步糖化发酵将底物水解和微生物发酵 过程结合起来简化了工艺和设备节约了生产时间 同时克服了底物的抑制作用因而具有较高的乳酸产 量( 但目前存在的问题是酶解温度和发酵温度不协 调底物转化率还不够高今后研究的重点是选育出 耐受更高温度的乳酸菌使同步糖化发酵更加高效 进而提高乳酸的生产效率( 参考文献" *&+"吕九琢徐亚贤2乳酸应用)生产及需求的现状与预测*]+2北 京石油化工学院学报$%%#&$#$$ "($R(!2 Vn ]@H9:HBSH L,^@,C2511.@I,?@BC BD.,I?@I,I@G ,0ZE.,00?,?H0 ,CG DBFEI,0?BD@?01FBGHI?@BC ,CG GEA,CG*]+2]BHFC,.BDYE@_@CJ MC0?@?H?EBD;E?FBR-:EA@I,.fEI:CB.BJK$%%#&$#$$"($R(!2
*$+"b@_,K,hHA,F]5F,\@CG,C ab@FH?:,J@F@f2aEIEC??FECG0@C ?:E 1FBGHI?@BC1HF@D@I,?@BC ,CG ,11.@I,?@BC BD.,I?@I,I@G *]+2Y@BR I:EA$%%! $$#$$ "$#)R$*#2
*(+"杨抑吴卫国陈杰2马铃薯综合利用研究进展*]+2中国食物
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*#+"刘振王金鹏张立峰等2木薯干原料同步糖化发酵生产乙醇
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;,C S@,CJ_HC2f:E0?HGK1FBJFE00@C B1?@A@9,?@BC DBF8@B1FBIE00
*]+2-:EA@I,.MCGH0?FKf@AE0$%%*$%#($")#R)2 *!+"]B:C a;a,_EE\NQHhHA,F,C NE?,.2Q?,?@0?@I,.B1?@A@9,?@BC BD 0@AH.?,CEBH00,II:,F@D@I?@BC ,CG !R#l$R.,I?@I,I@G DEFAEC?,?@BC DFBA
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*/+"栾雨时包永明2生物工程实验技术手册* +`2北京"化学工业
出版社$%%)"$)R$2 *&%+ 郑志姜绍通潘丽军等2T3f5钙法测定发酵液中乳酸含量 的探讨*]+2食品科学$%%($*#($" &%$R&%)2 P:ECJP:@]@,CJQ:,B?BCJ;,C V@_HCE?,.2Q?HGKBC AE?:BG0DBF GE?EFA@C,?@BC BD.,I?@I,I@G @C DEFAEC?EG 8FB?:*]+2UBBG QI@ECIE$%%($*#($" &%$R&%)2
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&&"第 # 期 赵国振等"马铃薯淀粉同步糖化发酵制备 ! 乳酸条件的统计学优化