全 文 ：第９卷第５期
２０１１年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０５．００７
收稿日期：２０１１－０５－０８
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）资助项目（２００７ＣＢ７１４３０３）
作者简介：张 悦（１９８５—），女，内蒙古巴彦淖尔人，硕士研究生，研究方向：发酵工程；王永红（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｙｈｗａｎｇ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
拟干酪乳杆菌发酵 Ｌ 乳酸合成培养基的优化
张 悦，王泽建，王永红，钱江潮，张嗣良
（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，２００２３７）
摘 要：为开发一种适合于乳酸发酵过程代谢流分析（ＭＦＡ）的合成培养基，以拟干酪乳杆菌 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ
为对象，考察主要营养成分对其生长和乳酸合成的影响。在合成培养基的优化过程中，先确定了影响菌体生长和
乳酸合成的主要营养物质及其浓度范围，针对葡萄糖、混合氨基酸、核苷类物质、维生素等生长因子、混合磷源、
ＣａＣＯ３六大类营养成分，使用正交试验法先后设计了六因素五水平和四因素三水平正交试验以及氨基酸梯度试验
和氨基酸缺失试验，得到了最佳培养基组成（１Ｌ）：葡萄糖８０ｇ、醋酸钠２ｇ、吐温－８０１ｍＬ、柠檬酸氢二铵１ｇ、金属
离子０７２ｇ、混合氨基酸 ３９２５ｇ、核苷类物质０１５ｇ、维生素等生长因子００７５ｇ、混合磷源 ０ｇ、ＣａＣＯ３３５ｇ。以半
合成培养基为对照，考察优化后的合成培养基对菌体生长和乳酸合成的影响。结果表明，菌体在合成培养基中的
乳酸产量、产率均比半合成培养基中高。这些结果为Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ的代谢流定量研究奠定了基础。
关键词：合成培养基；乳酸；拟干酪乳杆菌；正交试验
中图分类号：Ｑ８１５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０５－００３２－０６
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｅｆｉｎｅｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒＬｌａｃｔｉｃａｃｉｄ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ
ＺＨＡＮＧＹｕｅ，ＷＡＮＧＺｅｊｉａｎ，ＷＡＮＧＹｏｎｇｈｏｎｇ，ＱＩＡＮＪｉａｎｇｃｈａｏ，ＺＨＡＮＧＳｉｌｉａｎｇ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｄｅｆｉｎｅｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒＭＦＡ，ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｐｒｉｍｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｔｏ
ｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｌａｃｔａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｎＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｆｏｒｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｅｆｉｎｅｄｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅｐｒｉｍｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅｍｅｄｉｕｍａｎｄｔｈｅｒａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｉｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．
Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ６ｋｉｎｄｓｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｇｌｕｃｏｓｅ，ａｍｉｎｏａｃｉｄｍｉｘｔｕｒｅ，ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｄｅｓ，ｖｉｔａｍｉｎｓａｎｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，ｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｘｔｕｒｅ，ａｎｄｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ，ｗａｓｄｅｆｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｓｉｘ
ｆａｃｔｏｒｆｉｖｅｌｅｖｅｌｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄａｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｆｏｕｒｆａｃｔｏｒｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ａｓ
ｗｅｌａｓａｍｉｎｏａｃｉｄｍｉｘｔｕｒｅｇｒａｄａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｈｏｒｔａｇｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｆｉｎａｌｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ（１Ｌ）ａｓｆｏｌｏｗｓ：８０ｇｌｕｃｏｓｅ，２ｇｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，１ｍＬＴｗｅｅｎ８０，１ｇａｍｍｏｎｉｕｍｈｙ
ｄｒｏｇｅｎｃｉｔｒａｔｅ，０７２ｇｍｅｔａｌｉｏｎｓ，３９２５ｇａｍｉｎｏａｃｉｄｍｉｘｔｕｒｅ，０１５ｇｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，００７５ｇｖｉｔａｍｉｎｓ
ａｎｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ，０ｇｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｘｔｕｒｅ，ａｎｄ３５ｇｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ．Ａｈｉｇｈｅｒｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｌａｃｔｉｃ
ａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍｔｈａｎｉｎｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｍｅｄｉｕｍ．ＲｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅｄａｂａｓｉｓｆｏｒｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｌｕｘａｎａｌｙｓｉｓｉｎＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：：ｄｅｆｉｎｅｄｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ；ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８
乳酸是一种简单且重要的羟基酸［１］，广泛用于
医药、食品、皮革、卷烟、印染、化工等领域［２－５］。由
乳酸聚合而成的聚乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄ，ＰＬＡ）是
一种新型材料［６－７］，因其具有可降解性，故有代替传
统聚苯乙烯塑料产品的趋势［８－９］，这使得乳酸拥有
了巨大的潜在市场。
拟干酪乳杆菌产乳酸的量很高，因此，研究其
代谢过程为进一步提高其乳酸合成能力在大规模
生产中就显得尤为重要。笔者在参阅文献
［１０－１３］的基础上，应１３Ｃ微观代谢流分析所需，使
用正交设计方法，优化得到与半合成培养基生长及
乳酸合成能力相当的合成培养基，为代谢流分析
（ＭＦＡ）奠定基础。
１ 材料与方法
１１ 菌种
拟干酪乳杆菌 Ｌｐａｒａｃａｓｅｉ（生物反应器工程国
家重点实验室筛选得到）。菌种用甘油与水等体积
混合液与ＭＲＳ种子液１∶１混合后在－８０℃下保存。
１２ 培养基配方
茄子瓶培养基（１Ｌ）：葡萄糖４０ｇ，蛋白胨１０ｇ，
酵母浸膏 １０ｇ，牛肉膏 ６ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０４１ｇ，
ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ０２ｇ，ＮａＣｌ００３ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
００１８３ｇ，乙酸钠 ４ｇ，柠檬酸氢二铵 ２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４·
３Ｈ２Ｏ２ｇ，吐温 －８０１ｍＬ，ＣａＣＯ３１０ｇ（每瓶分装
０５ｇ），琼脂 １８ｇ（每瓶分装０９ｇ）。ＮａＯＨ调 ｐＨ
至６０，１１５℃灭菌１５ｍｉｎ。
种子培养基（优化后ＭＲＳ培养基，１Ｌ）：葡萄糖
４０ｇ（单独配制，接种前加入），蛋白胨 １０ｇ，酵母浸
膏１０ｇ，牛肉膏１０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０４１ｇ，ＭｎＳＯ４·
４Ｈ２Ｏ０２ｇ，ＮａＣｌ００３ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００１８３ｇ，乙
酸钠 ４ｇ，柠檬酸氢二铵 ２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ２ｇ，吐
温－８０１ｍＬ，ＣａＣＯ３１５ｇ（单独灭菌，接种前加入）。
ＮａＯＨ调ｐＨ至６０，葡萄糖１１５℃灭菌１５ｍｉｎ，其他
１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。
半合成发酵培养基（优化后ＭＲＳ培养基，１Ｌ）：
葡萄糖 ９０ｇ（单独配制，接种前加入），蛋白胨
１３３３ｇ，酵母膏 １３３３ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００２７３ｇ，
ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ００１３３ｇ，ＮａＣｌ００１３３ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
００２４３ｇ，乙酸钠 ０６７ｇ，ＣａＣＯ３１５ｇ（单独灭菌，接
种前加入）。ＮａＯＨ调 ｐＨ至６０，葡萄糖１１５℃灭
菌１５ｍｉｎ，其他１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。
基础合成培养基（１Ｌ）：葡萄糖 ９０ｇ（单独配
制，接种前加入），乙酸钠２ｇ，柠檬酸氢二铵１ｇ，吐
温－８０１ｍＬ，金属离子０７２ｇ［ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０５ｇ，
ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ０１ｇ，ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ００５ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
００２ｇ，ＣｏＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００１ｇ，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ００１ｇ，
ＮｉＳＯ４·６Ｈ２Ｏ００１ｇ，（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４·４Ｈ２Ｏ００１ｇ，
ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００１ｇ］，混合氨基酸 １５７ｇ（Ａｓｎ
１５ｇ，Ｃｙｓ１５ｇ，Ｓｅｒ１５ｇ，Ｇｌｕ１５ｇ，Ｌｙｓ１２ｇ，Ａｓｐ
１ｇ，Ｇｌｎ１ｇ，Ａｌａ０５ｇ，Ａｒｇ０５ｇ，Ｇｌｙ０５ｇ，Ｈｉｓ
０５ｇ，Ｉｌｅ０５ｇ，Ｌｅｕ０５ｇ，Ｍｅｔ０５ｇ，Ｐｈｅ０５ｇ，Ｐｒｏ
０５ｇ，Ｔｈｒ０５ｇ，Ｔｒｐ０５ｇ，Ｔｙｒ０５ｇ，Ｖａｌ０５ｇ，以
上均为Ｌ型氨基酸），核苷类物质０３ｇ（鸟嘌呤盐
酸盐００５ｇ，腺嘌呤００５ｇ，胸苷００５ｇ，２ 脱氧鸟
苷００５ｇ，尿嘧啶００５ｇ，胞苷００５ｇ），维生素等生
长因子 ００５ｇ（对氨基苯甲酸 ０００５ｇ，生物素
０００５ｇ，氰钴胺素 ０００５ｇ，叶酸 ０００５ｇ，肌醇
０００５ｇ，烟酸 ０００５ｇ，泛酸 ０００５ｇ，吡哆醇
０００５ｇ，核黄素０００５ｇ，硫胺素０００５ｇ），混合磷
源６ｇ（Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４３ｇ），ＣａＣＯ３１５ｇ
（单独灭菌，接种前加入）。混合氨基酸、核苷类物
质、维生素等生长因子用无菌水配成溶液，用０４５
μｍ滤头过滤除菌，葡萄糖１１５℃灭菌１５ｍｉｎ。其
余盐溶液用ＮａＯＨ调ｐＨ至６０，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。
１３ 培养条件
一级茄子瓶：将－８０℃保存的甘油管在４℃冰
箱解冻后取１５０μＬ接种到茄子瓶，在３７℃下倒置
培养２４ｈ得到一级茄子瓶。
二级茄子瓶：用竹签取一级茄子瓶表面的白色
菌体均匀涂抹到新茄子瓶上，在３７℃下倒置培养
２４ｈ得到二级茄子瓶。
种子瓶：取一个新鲜的二级茄子瓶，加入５０ｍＬ
无菌蒸馏水，使其上的菌悬浮于无菌水中。取悬浮
液１５ｍＬ接种于半合成种子培养基（２５０ｍＬ锥形瓶
中装１００ｍＬ种子液）中，在３７℃、１１０ｒ／ｍｉｎ的摇床
中培养１２ｈ获得种子液。
发酵瓶：以２０％的接种量将种子液接入发酵瓶
（２５０ｍＬ锥形瓶中装２００ｍＬ发酵液）中，在３７℃、
１３０ｒ／ｍｉｎ的摇床中培养４８ｈ后放瓶。
１４ 乳酸的分析方法
使用高效液相色谱测定乳酸含量，色谱仪为
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００（检测器：Ｇ１３１４Ａ紫外可见波长检测
器；进样器：Ｇ１３２８Ａ）；色谱柱为 ＭｅｔａｃａｒｂＨｐｌｕｓ
ｃｏｌｕｍｎ（３００ｍｍ×７８ｍｍ，ＶａｒｉａｎＩｎｃ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，
ＣＡ）；流动相为 ００１ｍｏｌ／Ｌ已抽滤 Ｈ２ＳＯ４；流速为
３３ 第５期 张 悦等：拟干酪乳杆菌发酵Ｌ乳酸合成培养基的优化
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０４ｍＬ／ｍｉｎ；柱温５０℃；进样量为１０μＬ；检测波长
２１０ｎｍ。
２ 结果与讨论
以菌体在半合成发酵培养基中的生长和乳酸
产量为对照，预实验通过优化基础合成培养基配方
中各大类营养物质的量，使菌体在合成培养基中的
乳酸产量超过半合成培养基的水平，并且初步确定
了正交试验中各因素的质量浓度范围。
２１ 六因素五水平正交试验
六因素五水平正交表记为 Ｌ２５（５
６）。结果如表
１、表２所示。
表１ 六因素五水平正交试验表
Ｔａｂｌｅ１ Ｓｉｘｆａｃｔｏｒｆｉｖｅｌｅｖｅｌｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇ·Ｌ－１
序
号
因 素
ρ（葡萄糖） ρ
（混合氨
基酸）
ρ（核苷类
物质）
ρ（维生素等
生长因子）
ρ（混合
磷源）
ρ（ＣａＣＯ３）
ρ（乳酸）
１ １（５０） １（０） １（０） １（０） １（０） １（１５） ３００
２ １ ２（７８５） ２（００７５） ２（００２５） ２（１５） ２（２０） ４２９
３ １ ３（１５７） ３（０１５） ３（００５） ３（３） ３（２５） ４５３
４ １ ４（２３５５） ４（０２２５） ４（００７５） ４（４５） ４（３０） ４４９
５ １ ５（３１４） ５（０３） ５（０１） ５（６） ５（３５） ４３７
６ ２（６０） １ ２ ３ ４ ５ ３１４
７ ２ ２ ３ ４ ５ １ ４３９
８ ２ ３ ４ ５ １ ２ ４５０
９ ２ ４ ５ １ ２ ３ ４７８
１０ ２ ５ １ ２ ３ ４ ３７４
１１ ３（７０） １ ３ ５ ２ ４ ３４７
１２ ３ ２ ４ １ ３ ５ ５０４
１３ ３ ３ ５ ２ ４ １ ４５５
１４ ３ ４ １ ３ ５ ２ ３９８
１５ ３ ５ ２ ４ １ ３ ４３０
１６ ４（８０） １ ４ ２ ５ ３ ３５２
１７ ４ ２ ５ ３ １ ４ ５４９
１８ ４ ３ １ ４ ２ ５ ５０９
１９ ４ ４ ２ ５ ３ １ ４０７
２０ ４ ５ ３ １ ４ ２ ５１５
２１ ５（９０） １ ５ ４ ３ ２ ３３２
２２ ５ ２ １ ５ ４ ３ ４０４
２３ ５ ３ ２ １ ５ ４ ４５８
２４ ５ ４ ３ ２ １ ５ ６０２
２５ ５ ５ ４ ３ ２ １ ４２０
由表１可知：在所有实验组中，２４号实验组的
乳酸产量最高（６０２ｇ／Ｌ），比对照半合成培养基
４８４ｇ／Ｌ高１１８ｇ／Ｌ。该组实验条件（ｇ／Ｌ）：葡萄
糖９０、混合氨基酸２３５５、核苷类物质０１５、维生素
等生长因子００２５、混合磷源０、ＣａＣＯ３３５。
４３ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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表２ 六因素五水平正交试验直观分析表和方差分析表
Ｔａｂｌｅ２ Ｉｎｔｕｉｔｉｏｎｉｓｔｉｃａｎｄｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｓｉｘｆａｃｔｏｒｆｉｖｅｌｅｖｅｌｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
误差源 葡萄糖 混合氨基酸
核苷类
物质
维生素等
生长因子
混合
磷源
ＣａＣＯ３
Ⅰｊ ４１４ ３２９ ３９７ ４５１ ４６６ ４０４
Ⅱｊ ４１１ ４６５ ４０８ ４４２ ４３７ ４０２
Ⅲｊ ４２７ ４６５ ４７１ ４２７ ４１４ ４３９
Ⅳｊ ４６６ ４６７ ４３５ ４３２ ４２７ ４３５
Ⅴｊ ４４３ ４３５ ４５０ ４０９ ４１７ ４７３
极差 ５５ １３８ ７４ ４２ ５２ ７１
偏差平方和 １０５７６０ ７００４０４ １８４８５２ ５１２５２ ８８３４０ １６２１５１
自由度 ４ ４ ４ ４ ４ ４
Ｆ比 ２０６４ １３６６６ ３６０７ １０００ １７２４ ３１６４
Ｆ临界值 ６３９０ ６３９０ ６３９０ ６３９０ ６３９０ ６３９０
显著性
由表２可知：理论上最好的实验条件（ｇ／Ｌ）为葡
萄糖８０、混合氨基酸２３５５、核苷类物质０１５、维生素
等生长因子０、混合磷源０、ＣａＣＯ３３５。极差从大到小
依次为混合氨基酸、核苷类物质、ＣａＣＯ３、葡萄糖、混
合磷源、维生素等生长因子。在以维生素等生长因子
为误差列、Ｐ值为００５的条件下，进行方差分析，结
果表明：混合氨基酸是显著性影响因子，在选取的范
围内对乳酸合成影响最大。５０、６０ｇ／Ｌ葡萄糖组无糖
剩余，９０ｇ／Ｌ葡萄糖组乳酸产量比 ８０ｇ／Ｌ组少
２ｇ／Ｌ，可能是因为高浓度葡萄糖造成高渗透压环境，
低浓度导致Ｃ源缺乏。混合氨基酸与核苷类物质是
主要的Ｎ源，影响显著。维生素等生长因子的影响与
预期相违，需继续优化。混合磷源为该菌发酵所不需
要。ＣａＣＯ３的量与乳酸合成呈正相关，但目前乳酸产
量已远超半合成水平，无需继续提高用量。
２２ 四因素三水平正交试验
统计分析３次平行的六因素五水平正交试验，发
现葡萄糖和 ＣａＣＯ３的趋势重现性良好，最大乳酸产
量分别在８０和３５ｇ／Ｌ水平，因此，在以下实验中照
此添加；混合氨基酸中最大乳酸产量在７８５、１５７和
２３５５ｇ／Ｌ水平之间轻微波动；核苷类物质中最大乳
酸产量在０１５和０３ｇ／Ｌ水平波动；维生素等生长因
子中最大乳酸产量在０和００７５ｇ／Ｌ水平波动；混合
磷源中最大乳酸产量在０和４５ｇ／Ｌ水平波动。
已知葡萄糖质量浓度为８０ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ３质量浓
度为３５ｇ／Ｌ。四因素三水平正交表记为 Ｌ９（３
４），结
果如表３、表４所示。
表３ 四因素三水平试验表
Ｔａｂｌｅ３ Ｆｏｕｒｆａｃｔｏｒｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇ·Ｌ－１
实验号
因 素
ρ（混合氨基酸） ρ（核苷类物质） ρ（维生素等生长因子） ρ（混合磷源）
ρ（乳酸）
１ １（７８５） １（０） １（０） １（０） ４６６
２ １ ２（０１５） ２（００３７５） ２（２２５） ５２０
３ １ ３（０３） ３（００７５） ３（４５） ５７４
４ ２（１５７） １ ２ ３ ４２７
５ ２ ２ ３ １ ６３８
６ ２ ３ １ ２ ４２６
７ ３（２３５５） １ ３ ２ ５１３
８ ３ ２ １ ３ ４８７
９ ３ ３ ２ １ ５６６
由表３可知：在所有实验组中，５号实验组的乳
酸产量最高（６３８ｇ／Ｌ），比对照半合成培养基４６１
ｇ／Ｌ高１７７ｇ／Ｌ。该组实验条件（ｇ／Ｌ）：混合氨基酸
１５７、核苷类物质０１５、维生素等生长因子００７５、
混合磷源 ０。
５３ 第５期 张 悦等：拟干酪乳杆菌发酵Ｌ乳酸合成培养基的优化
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表４ 四因素三水平正交试验直观分析表和方差分析表
Ｔａｂｌｅ４ Ｉｎｔｕｉｔｉｏｎｉｓｔｉｃａｎｄｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｆｏｕｒ
ｆａｃｔｏｒｔｈｒｅｅｌｅｖｅｌｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
误差源 混合氨基酸
核苷类
物质
维生素等
生长因子
混合
磷源
Ⅰｊ ５２０ ４６９ ４６０ ５５７
Ⅱｊ ４９７ ５４８ ５０４ ４８６
Ⅲｊ ５２２ ５２２ ５７５ ４９６
极差 ２５ ８０ １１５ ７０
偏差平方和 １１５８０ ９８８４７ ２０２９０７ ８７２０７
自由度 ２ ２ ２ ２
Ｆ比 １０００ ８５３６ １７５２２ ７５３１
Ｆ临界值 １９０００ １９０００ １９０００ １９０００
显著性
由表４可知：理论上最好的实验条件（ｇ／Ｌ）为
混合氨基酸 ２３５５、核苷类物质０１５、维生素等生长
因子００７５、混合磷源０。极差从大到小依次为维生
素等生长因子、核苷类物质、混合磷源、混合氨基
酸。在以混合氨基酸为误差列、Ｐ值为００５的条件
下，进行方差分析，结果表明：Ｆ比全部小于 Ｆ临界
值，即所有因素均不是显著性影响因子，在所选取
的范围内对乳酸合成影响均比较小。综合２次正交
试验，２３５５ｇ／Ｌ混合氨基酸水平的乳酸产量均比
７８５ｇ／Ｌ水平仅高０２ｇ／Ｌ，故采用７８５ｇ／Ｌ水平。
虽然维生素等生长因子的添加量与乳酸合成呈正
相关，但目前乳酸产量已远超半合成水平，无需继
续提高用量。混合磷源为该菌发酵所不需要。
２３ 混合氨基酸的进一步优化
在８０ｇ／Ｌ葡萄糖、０１５ｇ／Ｌ核苷类物质、００７５
ｇ／Ｌ维生素等生长因子、３５ｇ／ＬＣａＣＯ３条件下，对混
合氨基酸五水平０、１９６２５、３９２５、５８８７５和７８５
ｇ／Ｌ进行优化，３次重复后取其平均，结果见图１。
图１ 混合氨基酸对乳酸产量的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｍｉｘｔｕｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎｌａｃｔｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
由图１可知：混合氨基酸在３９２５ｇ／Ｌ水平乳
酸产量最高，这说明３９２５ｇ／Ｌ的混合氨基酸对该
菌乳酸合成已经足够，在后续实验中照此添加。
２４ 缺失实验
按类优化培养基组分的量不能排除某类中的
某个或者某些组分为实验菌乳酸合成所不需要的
可能。由于混合氨基酸较核苷类物质及维生素等
生长因子的种类多、分类明确，故通过缺失实验进
一步研究。
混合氨基酸总量在３９２５ｇ／Ｌ水平下，按其天
然分类依次缺失中性氨基酸、含羟基或硫氨基酸、
酸性氨基酸及其酰胺、碱性氨基酸、芳香族氨基酸，
考察缺失对实验菌乳酸合成的影响。正交试验表
明：混合氨基酸在３９２５ｇ／Ｌ水平到２３５５ｇ／Ｌ水平
之间对乳酸合成的影响相同，因此，在不引起负效
应的前提下，混合氨基酸总量在２３５５ｇ／Ｌ水平下，
按其天然分类依次缺失中性氨基酸、含羟基或硫氨
基酸、酸性氨基酸及其酰胺、碱性氨基酸、芳香族氨
基酸，考察缺失对实验菌乳酸合成的影响。在
８０ｇ／Ｌ葡萄糖、０１５ｇ／Ｌ核苷类物质、００７５ｇ／Ｌ维
生素等生长因子、３５ｇ／ＬＣａＣＯ３条件下，分别以添
加３９２５和２３５５ｇ／Ｌ全氨基酸实验组为对照，３次
重复后取其平均，结果见图２。
图２ 氨基酸分类缺失实验
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｌａｃｋｉｎｇｉｎｃａｔｅｇｏｒｙｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｎ
ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
由图２可知：３９２５ｇ／Ｌ水平下的所有缺失组均
比对照组低，说明各类氨基酸的缺失均对乳酸合成
造成了一定的影响，其中，缺酸性氨基酸组所受的
影响最大，其余４组乳酸产量均维持在４５到５０ｇ／Ｌ
之间，全氨基酸对照组乳酸产量为 ５３ｇ／Ｌ；
２３５５ｇ／Ｌ水平下的所有缺失组也均比对照组低，说
明各类氨基酸的缺失均对乳酸合成造成了一定的
６３ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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影响，其中，缺中性氨基酸组和缺碱性氨基酸组所
受影响较小，其余 ３组乳酸产量均维持在 ４５～
５０ｇ／Ｌ，全氨基酸对照组乳酸产量为５４ｇ／Ｌ；２３５５
ｇ／Ｌ水平下的缺失组对缺失的反应较３９２５ｇ／Ｌ水
平下的缺失组小，这说明过量的他类氨基酸进行了
回补，其中，缺酸性氨基酸最易回补，缺芳香族氨基
酸无法回补。因此，混合氨基酸总量在 ３９２５ｇ／Ｌ
水平进行乳酸发酵，无法缺失任何一类氨基酸。
２５ 基于 ２种培养基的摇瓶乳酸发酵过程代谢
特征
实验菌在２５０ｍＬ摇瓶半合成培养基与合成培
养基中发酵过程ＯＤ６２０、乳酸合成情况，如图３所示。
图３ ＯＤ６２０和乳酸产量在基于两种培养基的
摇瓶发酵变化
Ｆｉｇ．３ ＰｒｏｆｉｌｅｓｏｆＯＤ６２０ａｎｄｌａｃｔａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈ
ｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｍｅｄｉｕｍｉｎｆｌａｓｋｓ
由图３可知：在葡萄糖为９０ｇ／Ｌ的条件下，采
用２５０ｍＬ摇瓶半合成培养基进行乳酸发酵，发酵
４８ｈＯＤ６２０达到１７６，乳酸产量达到５１４ｇ／Ｌ，初始
乳酸为６８ｇ／Ｌ，残糖为２８５ｇ／Ｌ，因此，糖酸转化率
为７２５％，产率为０９３ｇ／（Ｌ·ｈ）。在葡萄糖为８０
ｇ／Ｌ的条件下，采用２５０ｍＬ摇瓶优化后合成培养基
进行乳酸发酵，发酵４８ｈＯＤ６２０达到１４，乳酸产量达
到６９３ｇ／Ｌ，初始乳酸为４３ｇ／Ｌ，残糖为１４１ｇ／Ｌ，
因此，糖酸转化率为９８６％，产率为１３５ｇ／（Ｌ·ｈ）。
比较２种培养基下菌体的代谢参数可得，优化
后合成培养基的生长水平略低于半合成培养基，乳
酸产量、糖酸转化率、产率均高于半合成培养基。
３ 结论
以乳酸产量为主要评价指标，以半合成发酵培
养基乳酸产量为对照，通过正交设计优化拟干酪乳
杆菌合成培养基，得到了用量最少且乳酸合成效果
更好的合成培养基。综合以上分析，得出拟干酪乳
杆菌合成培养基配方（１Ｌ）：葡萄糖 ８０ｇ，醋酸钠
２ｇ，柠檬酸氢二铵 １ｇ，吐温 －８０１ｍＬ，金属离子
０７２ｇ，混合氨基酸３９２５ｇ，核苷类物质０１５ｇ，维
生素等生长因子００７５ｇ，ＣａＣＯ３３５ｇ。
核苷类物质和维生素等生长因子中是否存在
实验菌生长和乳酸合成所不需要的组分，可作为下
一步研究的重点。
参考文献：
［１］ ＫｏｎｉｎｇｓＷＮ，ＫｏｋＪ，ＫｕｉｐｅｒｓＯＰ，ｅｔａｌ．Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ：ｔｈｅ
ｂｕｇｓｏｆｔｈｅｎｅｗｍｉｌｅｎｎｉｕｍ［Ｊ］．ＣｕｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，２０００，３（３）：２７６２８２．
［２］ 曹本昌，徐建林．Ｌ乳酸研究综述［Ｊ］．食品与发酵工业，１９９３
（３）：５６６１．
［３］ ＤａｔａＲ，ＴｓａｉＳＰ，ＢｏｎｓｉｇｎｏｒｅＰ，ｅｔａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｅｃｏｎｏｍ
ｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）ａｎｄｌａｃｔｉｃａｃｉｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．
ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，１９９５，１６（２／３）：２２１２３１．
［４］ 钱志良，胡军，雷肇祖．乳酸的工业化生产、应用和市场［Ｊ］．
工业微生物，２００１，３１（２）：４９５３．
［５］ ＨｏｆｖｅｎｄａｈｌＫ，ＨａｈｎＨｇｅｒｄａｌＢ．Ｆａｃｔｏｒｓａｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｖｅｌａｃｔｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｒｅｎｅｗａｂｌｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍ
ＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌ，２０００，２６：８７１０７．
［６］ ＧａｒｌｏｔａＤ．Ａｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｏｆｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）［Ｊ］．Ｐｏｌｙｍ
Ｅｎｖｉｒｏｎ，２００１，９（２）：６３８４．
［７］ 李亚滨．绿色纺织材料：聚乳酸纤维的结构和性能［Ｊ］．天津
纺织科技，１９９９（３）：２３２５．
［８］ 李志杰，李倩倩．聚乳酸包装材料合成研究［Ｊ］．中国印刷与
包装研究，２０１０，２（２）：５２５６．
［９］ 占群．聚乳酸（ＰＬＡ）：塑料包装的绿色希望［Ｊ］．印刷质量与
标准化，２００９（１２）：２７２９．
［１０］ ＢｅｒｙＡＲ，ＦｒａｎｃｏＣＭＭ，ＺｈａｎｇＷｅｉ．Ｇｒｏｗｔｈａｎｄｌａｃｔｉｃａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓｉｎａｄｅ
ｆｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔ，１９９９，２１（２）：１６３１６７．
［１１］ ＬｅｄｅｓｍａＯＶ，ＤｅＲｕｉｚＨｏｌｇａｄｏＡＰ，ＯｌｉｖｅｒＧ，ｅｔａｌ．Ａｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｍｅｄｉｕｍｆｏｒｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｉ［Ｊ］．Ａｐ
ｐｌＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７７，４２（１）：１２３１３３．
［１２］ ＣｏｌｏｍｂｉＳ，ＳａｂｌａｙｒｏｌｅｓＪＭ．Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｒｏｌｓｌａｃｔａｔｅｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎｂｙＫ１ＬＤＨ：ａＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｓｔｒａｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ａｂａｃｔｅｒｉａｌＬＤＨｇｅｎｅ［Ｊ］．ＩｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，３１
（５）：２０９２１５．
［１３］ 邱伙琴，徐国谦，庄英萍，等．维生素对乳酸菌细胞活性和代
谢途径相关酶活性的影响［Ｊ］．华东理工大学学报：自然科学
版，２００７，３３（３）：３３０３３５．
７３ 第５期 张 悦等：拟干酪乳杆菌发酵Ｌ乳酸合成培养基的优化
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８