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Optimization of defined culture medium for L-lactic acid fermentation by Lactobacillus paracasei

拟干酪乳杆菌发酵L-乳酸合成培养基的优化



全 文 :第9卷第5期
2011年9月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.9No.5
Sep.2011
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2011.05.007
收稿日期:2011-05-08
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2007CB714303)
作者简介:张 悦(1985—),女,内蒙古巴彦淖尔人,硕士研究生,研究方向:发酵工程;王永红(联系人),教授,Email:yhwang@ecust.edu.cn
拟干酪乳杆菌发酵 L 乳酸合成培养基的优化
张 悦,王泽建,王永红,钱江潮,张嗣良
(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室,200237)
摘 要:为开发一种适合于乳酸发酵过程代谢流分析(MFA)的合成培养基,以拟干酪乳杆菌 Lactobacilusparacasei
为对象,考察主要营养成分对其生长和乳酸合成的影响。在合成培养基的优化过程中,先确定了影响菌体生长和
乳酸合成的主要营养物质及其浓度范围,针对葡萄糖、混合氨基酸、核苷类物质、维生素等生长因子、混合磷源、
CaCO3六大类营养成分,使用正交试验法先后设计了六因素五水平和四因素三水平正交试验以及氨基酸梯度试验
和氨基酸缺失试验,得到了最佳培养基组成(1L):葡萄糖80g、醋酸钠2g、吐温-801mL、柠檬酸氢二铵1g、金属
离子072g、混合氨基酸 3925g、核苷类物质015g、维生素等生长因子0075g、混合磷源 0g、CaCO335g。以半
合成培养基为对照,考察优化后的合成培养基对菌体生长和乳酸合成的影响。结果表明,菌体在合成培养基中的
乳酸产量、产率均比半合成培养基中高。这些结果为L.paracasei的代谢流定量研究奠定了基础。
关键词:合成培养基;乳酸;拟干酪乳杆菌;正交试验
中图分类号:Q815    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2011)05-0032-06
OptimizationofdefinedculturemediumforLlacticacid
fermentationbyLactobacilusparacasei
ZHANGYue,WANGZejian,WANGYonghong,QIANJiangchao,ZHANGSiliang
(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)
Abstract:InordertodevelopadefinedculturemediumforMFA,theinfluenceofprimecomponentsto
thegrowthandlactateproductiononL.paracaseiwasinvestigated.Fortheoptimizationofdefinedculture
medium,theprimecomponentsofthemediumandtherangesoftheirconcentrationsweredetermined.
Then,theoptimalconcentrationof6kindsofnutrients,includingglucose,aminoacidmixture,nucleo
sides,vitaminsandgrowthfactors,phosphatemixture,andcalciumcarbonate,wasdefinedthroughasix
factorfivelevelorthogonalexperimentandasubsequentfourfactorthreelevelorthogonalexperiment,as
welasaminoacidmixturegradationexperimentandaminoacidshortageexperiment.Thefinaloptimized
compositionswere(1L)asfolows:80glucose,2gsodiumacetate,1mLTween80,1gammoniumhy
drogencitrate,072gmetalions,3925gaminoacidmixture,015gnucleosides,0075gvitamins
andgrowthfactors,0gphosphatemixture,and35gcalciumcarbonate.Ahighercelgrowthandlactic
acidproductioncouldbeobtainedintheoptimizeddefinedmediumthanintheoriginalsemisynthetic
medium.ResultsprovidedabasisformetabolicfluxanalysisinL.paracasei.
Keywords::definedculturemedium;lacticacid;Lactobacilusparacasei;orthogonalexperiment
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  乳酸是一种简单且重要的羟基酸[1],广泛用于
医药、食品、皮革、卷烟、印染、化工等领域[2-5]。由
乳酸聚合而成的聚乳酸(polylacticacid,PLA)是
一种新型材料[6-7],因其具有可降解性,故有代替传
统聚苯乙烯塑料产品的趋势[8-9],这使得乳酸拥有
了巨大的潜在市场。
  拟干酪乳杆菌产乳酸的量很高,因此,研究其
代谢过程为进一步提高其乳酸合成能力在大规模
生产中就显得尤为重要。笔者在参阅文献
[10-13]的基础上,应13C微观代谢流分析所需,使
用正交设计方法,优化得到与半合成培养基生长及
乳酸合成能力相当的合成培养基,为代谢流分析
(MFA)奠定基础。
1 材料与方法
11 菌种
  拟干酪乳杆菌 Lparacasei(生物反应器工程国
家重点实验室筛选得到)。菌种用甘油与水等体积
混合液与MRS种子液1∶1混合后在-80℃下保存。
12 培养基配方
  茄子瓶培养基(1L):葡萄糖40g,蛋白胨10g,
酵母浸膏 10g,牛肉膏 6g,MgSO4·7H2O041g,
MnSO4·4H2O02g,NaCl003g,FeSO4·7H2O
00183g,乙酸钠 4g,柠檬酸氢二铵 2g,K2HPO4·
3H2O2g,吐温 -801mL,CaCO310g(每瓶分装
05g),琼脂 18g(每瓶分装09g)。NaOH调 pH
至60,115℃灭菌15min。
  种子培养基(优化后MRS培养基,1L):葡萄糖
40g(单独配制,接种前加入),蛋白胨 10g,酵母浸
膏10g,牛肉膏10g,MgSO4·7H2O041g,MnSO4·
4H2O02g,NaCl003g,FeSO4·7H2O00183g,乙
酸钠 4g,柠檬酸氢二铵 2g,K2HPO4·3H2O2g,吐
温-801mL,CaCO315g(单独灭菌,接种前加入)。
NaOH调pH至60,葡萄糖115℃灭菌15min,其他
121℃灭菌15min。
  半合成发酵培养基(优化后MRS培养基,1L):
葡萄糖 90g(单独配制,接种前加入),蛋白胨
1333g,酵母膏 1333g,MgSO4·7H2O00273g,
MnSO4·4H2O00133g,NaCl00133g,FeSO4·7H2O
00243g,乙酸钠 067g,CaCO315g(单独灭菌,接
种前加入)。NaOH调 pH至60,葡萄糖115℃灭
菌15min,其他121℃灭菌15min。
  基础合成培养基(1L):葡萄糖 90g(单独配
制,接种前加入),乙酸钠2g,柠檬酸氢二铵1g,吐
温-801mL,金属离子072g[MgSO4·7H2O05g,
CaCl2·2H2O01g,MnSO4·4H2O005g,FeSO4·7H2O
002g,CoSO4·7H2O001g,CuSO4·5H2O001g,
NiSO4·6H2O001g,(NH4)6Mo7O24·4H2O001g,
ZnSO4·7H2O001g],混合氨基酸 157g(Asn
15g,Cys15g,Ser15g,Glu15g,Lys12g,Asp
1g,Gln1g,Ala05g,Arg05g,Gly05g,His
05g,Ile05g,Leu05g,Met05g,Phe05g,Pro
05g,Thr05g,Trp05g,Tyr05g,Val05g,以
上均为L型氨基酸),核苷类物质03g(鸟嘌呤盐
酸盐005g,腺嘌呤005g,胸苷005g,2 脱氧鸟
苷005g,尿嘧啶005g,胞苷005g),维生素等生
长因子 005g(对氨基苯甲酸 0005g,生物素
0005g,氰钴胺素 0005g,叶酸 0005g,肌醇
0005g,烟酸 0005g,泛酸 0005g,吡哆醇
0005g,核黄素0005g,硫胺素0005g),混合磷
源6g(K2HPO4·3H2O3g,KH2PO43g),CaCO315g
(单独灭菌,接种前加入)。混合氨基酸、核苷类物
质、维生素等生长因子用无菌水配成溶液,用045
μm滤头过滤除菌,葡萄糖115℃灭菌15min。其
余盐溶液用NaOH调pH至60,121℃灭菌15min。
13 培养条件
  一级茄子瓶:将-80℃保存的甘油管在4℃冰
箱解冻后取150μL接种到茄子瓶,在37℃下倒置
培养24h得到一级茄子瓶。
  二级茄子瓶:用竹签取一级茄子瓶表面的白色
菌体均匀涂抹到新茄子瓶上,在37℃下倒置培养
24h得到二级茄子瓶。
  种子瓶:取一个新鲜的二级茄子瓶,加入50mL
无菌蒸馏水,使其上的菌悬浮于无菌水中。取悬浮
液15mL接种于半合成种子培养基(250mL锥形瓶
中装100mL种子液)中,在37℃、110r/min的摇床
中培养12h获得种子液。
  发酵瓶:以20%的接种量将种子液接入发酵瓶
(250mL锥形瓶中装200mL发酵液)中,在37℃、
130r/min的摇床中培养48h后放瓶。
14 乳酸的分析方法
  使用高效液相色谱测定乳酸含量,色谱仪为
Agilent1100(检测器:G1314A紫外可见波长检测
器;进样器:G1328A);色谱柱为 MetacarbHplus
column(300mm×78mm,VarianInc,PaloAlto,
CA);流动相为 001mol/L已抽滤 H2SO4;流速为
33 第5期 张 悦等:拟干酪乳杆菌发酵L乳酸合成培养基的优化
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04mL/min;柱温50℃;进样量为10μL;检测波长
210nm。
2 结果与讨论
  以菌体在半合成发酵培养基中的生长和乳酸
产量为对照,预实验通过优化基础合成培养基配方
中各大类营养物质的量,使菌体在合成培养基中的
乳酸产量超过半合成培养基的水平,并且初步确定
了正交试验中各因素的质量浓度范围。
21 六因素五水平正交试验
  六因素五水平正交表记为 L25(5
6)。结果如表
1、表2所示。
表1 六因素五水平正交试验表
Table1 Sixfactorfivelevelorthogonalexperiment g·L-1


因 素
ρ(葡萄糖) ρ
(混合氨
基酸)
ρ(核苷类
物质)
ρ(维生素等
生长因子)
ρ(混合
磷源)
ρ(CaCO3)
ρ(乳酸)
1 1(50) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(15) 300
2 1 2(785) 2(0075) 2(0025) 2(15) 2(20) 429
3 1 3(157) 3(015) 3(005) 3(3) 3(25) 453
4 1 4(2355) 4(0225) 4(0075) 4(45) 4(30) 449
5 1 5(314) 5(03) 5(01) 5(6) 5(35) 437
6 2(60) 1 2 3 4 5 314
7 2 2 3 4 5 1 439
8 2 3 4 5 1 2 450
9 2 4 5 1 2 3 478
10 2 5 1 2 3 4 374
11 3(70) 1 3 5 2 4 347
12 3 2 4 1 3 5 504
13 3 3 5 2 4 1 455
14 3 4 1 3 5 2 398
15 3 5 2 4 1 3 430
16 4(80) 1 4 2 5 3 352
17 4 2 5 3 1 4 549
18 4 3 1 4 2 5 509
19 4 4 2 5 3 1 407
20 4 5 3 1 4 2 515
21 5(90) 1 5 4 3 2 332
22 5 2 1 5 4 3 404
23 5 3 2 1 5 4 458
24 5 4 3 2 1 5 602
25 5 5 4 3 2 1 420
  由表1可知:在所有实验组中,24号实验组的
乳酸产量最高(602g/L),比对照半合成培养基
484g/L高118g/L。该组实验条件(g/L):葡萄
糖90、混合氨基酸2355、核苷类物质015、维生素
等生长因子0025、混合磷源0、CaCO335。
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表2 六因素五水平正交试验直观分析表和方差分析表
Table2 Intuitionisticandvarianceanalysisforsixfactorfivelevelorthogonalexperiment
误差源 葡萄糖 混合氨基酸
核苷类
物质
维生素等
生长因子
混合
磷源
CaCO3
Ⅰj 414 329 397 451 466 404
Ⅱj 411 465 408 442 437 402
Ⅲj 427 465 471 427 414 439
Ⅳj 466 467 435 432 427 435
Ⅴj 443 435 450 409 417 473
极差 55 138 74 42 52 71
偏差平方和 105760 700404 184852 51252 88340 162151
自由度 4 4 4 4 4 4
F比 2064 13666 3607 1000 1724 3164
F临界值 6390 6390 6390 6390 6390 6390
显著性 
  由表2可知:理论上最好的实验条件(g/L)为葡
萄糖80、混合氨基酸2355、核苷类物质015、维生素
等生长因子0、混合磷源0、CaCO335。极差从大到小
依次为混合氨基酸、核苷类物质、CaCO3、葡萄糖、混
合磷源、维生素等生长因子。在以维生素等生长因子
为误差列、P值为005的条件下,进行方差分析,结
果表明:混合氨基酸是显著性影响因子,在选取的范
围内对乳酸合成影响最大。50、60g/L葡萄糖组无糖
剩余,90g/L葡萄糖组乳酸产量比 80g/L组少
2g/L,可能是因为高浓度葡萄糖造成高渗透压环境,
低浓度导致C源缺乏。混合氨基酸与核苷类物质是
主要的N源,影响显著。维生素等生长因子的影响与
预期相违,需继续优化。混合磷源为该菌发酵所不需
要。CaCO3的量与乳酸合成呈正相关,但目前乳酸产
量已远超半合成水平,无需继续提高用量。
22 四因素三水平正交试验
  统计分析3次平行的六因素五水平正交试验,发
现葡萄糖和 CaCO3的趋势重现性良好,最大乳酸产
量分别在80和35g/L水平,因此,在以下实验中照
此添加;混合氨基酸中最大乳酸产量在785、157和
2355g/L水平之间轻微波动;核苷类物质中最大乳
酸产量在015和03g/L水平波动;维生素等生长因
子中最大乳酸产量在0和0075g/L水平波动;混合
磷源中最大乳酸产量在0和45g/L水平波动。
  已知葡萄糖质量浓度为80g/L,CaCO3质量浓
度为35g/L。四因素三水平正交表记为 L9(3
4),结
果如表3、表4所示。
表3 四因素三水平试验表
Table3 Fourfactorthreelevelorthogonalexperiment g·L-1
实验号
因 素
ρ(混合氨基酸) ρ(核苷类物质) ρ(维生素等生长因子) ρ(混合磷源)
ρ(乳酸)
1 1(785) 1(0) 1(0) 1(0) 466
2 1 2(015) 2(00375) 2(225) 520
3 1 3(03) 3(0075) 3(45) 574
4 2(157) 1 2 3 427
5 2 2 3 1 638
6 2 3 1 2 426
7 3(2355) 1 3 2 513
8 3 2 1 3 487
9 3 3 2 1 566
  由表3可知:在所有实验组中,5号实验组的乳
酸产量最高(638g/L),比对照半合成培养基461
g/L高177g/L。该组实验条件(g/L):混合氨基酸
157、核苷类物质015、维生素等生长因子0075、
混合磷源 0。
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表4 四因素三水平正交试验直观分析表和方差分析表
Table4 Intuitionisticandvarianceanalysisforfour
factorthreelevelorthogonalexperiment
误差源 混合氨基酸
核苷类
物质
维生素等
生长因子
混合
磷源
Ⅰj 520 469 460 557
Ⅱj 497 548 504 486
Ⅲj 522 522 575 496
极差 25 80 115 70
偏差平方和 11580 98847 202907 87207
自由度 2 2 2 2
F比 1000 8536 17522 7531
F临界值 19000 19000 19000 19000
显著性
  由表4可知:理论上最好的实验条件(g/L)为
混合氨基酸 2355、核苷类物质015、维生素等生长
因子0075、混合磷源0。极差从大到小依次为维生
素等生长因子、核苷类物质、混合磷源、混合氨基
酸。在以混合氨基酸为误差列、P值为005的条件
下,进行方差分析,结果表明:F比全部小于 F临界
值,即所有因素均不是显著性影响因子,在所选取
的范围内对乳酸合成影响均比较小。综合2次正交
试验,2355g/L混合氨基酸水平的乳酸产量均比
785g/L水平仅高02g/L,故采用785g/L水平。
虽然维生素等生长因子的添加量与乳酸合成呈正
相关,但目前乳酸产量已远超半合成水平,无需继
续提高用量。混合磷源为该菌发酵所不需要。
23 混合氨基酸的进一步优化
  在80g/L葡萄糖、015g/L核苷类物质、0075
g/L维生素等生长因子、35g/LCaCO3条件下,对混
合氨基酸五水平0、19625、3925、58875和785
g/L进行优化,3次重复后取其平均,结果见图1。
图1 混合氨基酸对乳酸产量的影响
Fig.1 Efectsofaminoacidmixtureconcentration
onlacticacidproduction
  由图1可知:混合氨基酸在3925g/L水平乳
酸产量最高,这说明3925g/L的混合氨基酸对该
菌乳酸合成已经足够,在后续实验中照此添加。
24 缺失实验
  按类优化培养基组分的量不能排除某类中的
某个或者某些组分为实验菌乳酸合成所不需要的
可能。由于混合氨基酸较核苷类物质及维生素等
生长因子的种类多、分类明确,故通过缺失实验进
一步研究。
  混合氨基酸总量在3925g/L水平下,按其天
然分类依次缺失中性氨基酸、含羟基或硫氨基酸、
酸性氨基酸及其酰胺、碱性氨基酸、芳香族氨基酸,
考察缺失对实验菌乳酸合成的影响。正交试验表
明:混合氨基酸在3925g/L水平到2355g/L水平
之间对乳酸合成的影响相同,因此,在不引起负效
应的前提下,混合氨基酸总量在2355g/L水平下,
按其天然分类依次缺失中性氨基酸、含羟基或硫氨
基酸、酸性氨基酸及其酰胺、碱性氨基酸、芳香族氨
基酸,考察缺失对实验菌乳酸合成的影响。在
80g/L葡萄糖、015g/L核苷类物质、0075g/L维
生素等生长因子、35g/LCaCO3条件下,分别以添
加3925和2355g/L全氨基酸实验组为对照,3次
重复后取其平均,结果见图2。
图2 氨基酸分类缺失实验
Fig.2 Efectsoflackingincategoryofaminoacidson
lacticacidproduction
  由图2可知:3925g/L水平下的所有缺失组均
比对照组低,说明各类氨基酸的缺失均对乳酸合成
造成了一定的影响,其中,缺酸性氨基酸组所受的
影响最大,其余4组乳酸产量均维持在45到50g/L
之间,全氨基酸对照组乳酸产量为 53g/L;
2355g/L水平下的所有缺失组也均比对照组低,说
明各类氨基酸的缺失均对乳酸合成造成了一定的
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影响,其中,缺中性氨基酸组和缺碱性氨基酸组所
受影响较小,其余 3组乳酸产量均维持在 45~
50g/L,全氨基酸对照组乳酸产量为54g/L;2355
g/L水平下的缺失组对缺失的反应较3925g/L水
平下的缺失组小,这说明过量的他类氨基酸进行了
回补,其中,缺酸性氨基酸最易回补,缺芳香族氨基
酸无法回补。因此,混合氨基酸总量在 3925g/L
水平进行乳酸发酵,无法缺失任何一类氨基酸。
25 基于 2种培养基的摇瓶乳酸发酵过程代谢
特征
  实验菌在250mL摇瓶半合成培养基与合成培
养基中发酵过程OD620、乳酸合成情况,如图3所示。
图3 OD620和乳酸产量在基于两种培养基的
摇瓶发酵变化
Fig.3 ProfilesofOD620andlactateproductionwith
twokindsofmediuminflasks
  由图3可知:在葡萄糖为90g/L的条件下,采
用250mL摇瓶半合成培养基进行乳酸发酵,发酵
48hOD620达到176,乳酸产量达到514g/L,初始
乳酸为68g/L,残糖为285g/L,因此,糖酸转化率
为725%,产率为093g/(L·h)。在葡萄糖为80
g/L的条件下,采用250mL摇瓶优化后合成培养基
进行乳酸发酵,发酵48hOD620达到14,乳酸产量达
到693g/L,初始乳酸为43g/L,残糖为141g/L,
因此,糖酸转化率为986%,产率为135g/(L·h)。
  比较2种培养基下菌体的代谢参数可得,优化
后合成培养基的生长水平略低于半合成培养基,乳
酸产量、糖酸转化率、产率均高于半合成培养基。
3 结论
  以乳酸产量为主要评价指标,以半合成发酵培
养基乳酸产量为对照,通过正交设计优化拟干酪乳
   
杆菌合成培养基,得到了用量最少且乳酸合成效果
更好的合成培养基。综合以上分析,得出拟干酪乳
杆菌合成培养基配方(1L):葡萄糖 80g,醋酸钠
2g,柠檬酸氢二铵 1g,吐温 -801mL,金属离子
072g,混合氨基酸3925g,核苷类物质015g,维
生素等生长因子0075g,CaCO335g。
  核苷类物质和维生素等生长因子中是否存在
实验菌生长和乳酸合成所不需要的组分,可作为下
一步研究的重点。
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73 第5期 张 悦等:拟干酪乳杆菌发酵L乳酸合成培养基的优化
\\DZ19\D\孙桂云\生物加工2011\第5期\SW1105.PS 6校样 排版:孙桂云 修改日期:2011/09/28