全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０５．０１３
收稿日期：２００９－０１－２１
基金项目：贵州省委组织部高层次人才科研条件特助经费项目（ＴＺＪＦ２００６０２）
作者简介：张蓉娇（１９８４—），女，辽宁沈阳人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术；吴天祥（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｗｕｔｉａｎｘｉａｎｇ０８０８＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
基于姬松茸深层发酵的 ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选
张蓉娇１，吴天祥２
（１贵州大学　化学与化工学院，贵阳 ５５０００３；２贵州大学　生命科学学院，贵阳 ５５００２５）
摘　要：对姬松茸液体深层发酵培养工艺条件进行单因素实验：应用 Ｍｉｎｉｔａｂ１５软件设计 ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选实
验，筛选出蔗糖及酵母膏质量浓度、培养温度、微量元素配比４个显著性影响因素，通过正交试验对其进行优化。
确定最佳培养工艺条件：蔗糖质量浓度４５ｇ／Ｌ，酵母膏质量浓度３ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４质量浓度２５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４质量浓度
１２５ｇ／Ｌ，培养温度２７℃，培养时间７ｄ，多糖产量可达４６４ｇ／Ｌ。
关键词：姬松茸；深层发酵；工艺优化
中图分类号：Ｑ９３３３５　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０５－００６４－０５
ＳｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡｇａｒｉｃｕｓｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌ
ＺＨＡＮＧＲｏｎｇｊｉａｏ１，ＷＵＴｉａｎｘｉａｎｇ２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆｌｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡｇａｒｉｃｕｓｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌｗａｓｓｔｕｄｉｅｄＰｌａｃｋ
ｅｔＢｕｒｍａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｃａｒｉｅｄｏｕｔ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｉｎＭｉｎｉｔａｂ１５ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｉｎｗｈｉｃｈ
ｆｏｕｒｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎａｓｆｏｌｏｗｓ：ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｃｒｏｓｅａｎｄｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，
ａｎｄｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔｒａｔｉｏＴｈｅｆｏｕｒｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｓｉｇｎ
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｓｕｃｒｏｓｅ４５ｇ／Ｌ，ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ３ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ２５ｇ／Ｌ，
ＭｇＳＯ４１２５ｇ／Ｌ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ２７℃，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｒｅａｃｈｅｄ４６４ｇ／Ｌａｆｔｅｒ７ｄｃｕｌｔｕｒｅ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｇａｒｉｃｕｓｂｌａｚｅｉｍｕｒｉｌ；ｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅ；ｐｒｏｃｅｓｓｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　　姬松茸（ＡｇａｒｉｃｕｓｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌ）在分类学上隶属
担子菌亚门，学名柏氏蘑菇。原产于北美南部、巴
西和秘鲁等地，１９９２年由我国福建省从日本引进了
姬松茸并进行栽培，后相继传入其他省份［１－２］。
姬松茸是一种药食两用的珍稀真菌，主要功能
成分为多糖，近年来，研究发现姬松茸多糖具有降
血糖［３］、抗肿瘤［４－５］、抗辐射［６］、抗突变［７］及抗炎［８］
等药用功效。对姬松茸进行液体深层发酵是提高
其多糖产量的有效途径之一，而且具有生产成本
低，不受地域、季节性限制等优点［９］，因此有必要对
姬松茸深层发酵条件进行研究。目前，国内相关研
究多以生物量为考察指标［１０－１１］，笔者以酵液中真菌
多糖的含量为主要检测指标，对姬松茸液体深层发
酵培养工艺进行了优化，从而确定生产姬松茸多糖
的最佳工艺参数，提高其生产率。
１　材料与方法
１．１　菌种
姬松茸（ＡｇａｒｉｃｕｓｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌ，ＡＢＭ），由贵州大
学食品科学实验室筛选保藏（０７１６）。
１２　培养基
１２１　斜面培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（ＰＤＡ）培养基。
１２２　液体种子培养基（ｇ／Ｌ）
葡萄糖 ２０，玉米粉１０，酵母膏３，ＫＨ２ＰＯ４０２，
ＭｇＳＯ４０１。ｐＨ６０。
１２３　基础发酵培养基（ｇ／Ｌ）
葡萄糖 ３０，酵母膏５，ＫＨ２ＰＯ４０２，ＭｇＳＯ４０１。
ｐＨ值６０。
１３　培养方法
１３１　斜面培养
从活化后的母种试管中切取黄豆大小的菌丝
块，接于斜面中部，（２８±１）℃，培养１２ｄ。
１３２　液体种子培养
将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体
培养 基 中，２５０ｍＬ三 角 瓶 装 液 量 为 １００ｍＬ，
（２６±１）℃、１６０ｒ／ｍｉｎ，摇床培养９～１０ｄ。
１３３　基础发酵培养
按１０％的接种量取液体种子进行接种，２５０ｍＬ
三角瓶装液量为１００ｍＬ，（２６±１）℃，１６０ｒ／ｍｉｎ，摇
床培养５～９ｄ。
１４　方法
１４１　生物量测定
将１００ｍＬ发酵液经４０００ｒ／ｍｉｎ离心２５ｍｉｎ后，用
无菌蒸馏水冲洗菌丝滤饼３次，将其置于９０℃电热
恒温干燥箱中，烘干至恒质量，用分析天平称其质量。
１４２　多糖含量测定
将１００ｍＬ发酵液经４０００ｒ／ｍｉｎ离心２５ｍｉｎ后，
所得滤液用３，５ 二硝基水杨酸比色法［１２］测定还原
糖、苯酚 硫酸法［１３］测定总糖，多糖产量等于总糖量
与还原糖量之差［１４］。
１４３　发酵工艺条件优化
对Ｃ、Ｎ源及其质量浓度、微量元素配比、培养
温度和培养时间做单因素试验，利用Ｍｉｎｉｔａｂ１５软件
设计了５因素２水平的 ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选试验，
从５个因素中筛选出有显著性的因素，并通过正交
试验对其进行优化。
２　结果与分析
２１　单因素试验
２１１　Ｃ、Ｎ源的确定
　　１）Ｃ源的确定
分别以不同 Ｃ源代替基础发酵培养基中葡萄
糖，其他条件不变，设不加 Ｃ源为对照进行实验，实
验结果如图１所示。
图１　不同Ｃ源对姬松茸深层发酵的影响
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｔｈｅ
ｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡＢＭ
　　Ｃ源是姬松茸能量代谢的来源，不同 Ｃ源对姬
松茸深层发酵产多糖影响差异很大。由图１可知，
姬松茸对单糖、双糖及多糖均能较好地利用，其中
以蔗糖为 Ｃ源时多糖产量最高，多糖质量浓度是
２９９ｇ／Ｌ，菌体生物量仅次于可溶性淀粉，故选蔗糖
为最佳Ｃ源。
　　２）Ｎ源的确定
分别以５ｇ／Ｌ的不同 Ｎ源代替基础发酵培养基
中Ｎ源（５ｇ／Ｌ酵母膏），其他条件不变，设不加Ｎ源
为对照进行实验，实验结果如图２所示。
图２　不同Ｎ源对姬松茸深层发酵的影响
Ｆｉｇ２　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎ
ｔｈｅｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡＢＭ
　　Ｎ是构成菌体成分的重要元素之一，适宜的Ｎ源
可以为菌体细胞提供营养。由图２可知，姬松茸对有
机氮的利用明显优于无机Ｎ，多糖产量及菌体生物量
显著提高，其中以酵母膏为Ｎ源效果最佳，其多糖质
量浓度为３９１ｇ／Ｌ，故选酵母膏为最佳Ｎ源。
５６　第５期 张蓉娇等：基于姬松茸深层发酵的ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选
２１２　Ｃ源质量浓度对姬松茸发酵的影响
向发酵培养基中添加１０～６０ｇ／Ｌ不同质量浓度
的蔗糖，其他条件不变，研究其对多糖产量的影响，
结果如图３所示。由图３可知，随着蔗糖质量浓度
的增加，姬松茸多糖产量及菌体生物量均随之增
加。当蔗糖质量浓度达到５０ｇ／Ｌ时，姬松茸深层发
酵效果最优，此时多糖质量浓度为４１５ｇ／Ｌ。
图３　蔗糖质量浓度对姬松茸深层发酵的影响
Ｆｉｇ３　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｓｕｃｒｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅ
ｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡＢＭ
２１３　Ｎ源质量浓度对姬松茸发酵的影响
向发酵培养基中添加不同质量浓度的酵母膏，
其他条件不变，研究其对多糖产量的影响，结果如
图４所示。由图４可知，酵母膏质量浓度过高或过
低都不利于姬松茸的生长，当酵母膏质量浓度为
３ｇ／Ｌ时，姬松茸多糖产量为３５８ｇ／Ｌ达到最大值，
且菌体生长良好。
图４　酵母膏质量浓度对姬松茸深层发酵的影响
Ｆｉｇ４　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ
ｔｈｅｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡＢＭ
２１４　微量元素配比对姬松茸发酵的影响
微生物的生长离不开各种无机离子的摄入，其
中 Ｐ、Ｋ、Ｍｇ元素为微生物生长所必需。将
ｍ（ＫＨ２ＰＯ４）∶ｍ（ＭｇＳＯ４）为２∶１的比例添加进行合
并考察，结果如图５所示。由图５可知，当 ＫＨ２ＰＯ４
和ＭｇＳＯ４质量浓度分别为３ｇ／Ｌ和１５ｇ／Ｌ时，姬松
茸深层发酵效果最优，多糖质量浓度为３７０ｇ／Ｌ。
图５　不同微量元素配比对姬松茸深层发酵的影响
Ｆｉｇ５　Ｅｆｅｃｔｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｍｉｎｅｒａｌｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎ
ｔｈｅｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡＢＭ
２１５　培养温度对姬松茸发酵的影响
选择不同温度作为培养温度，测定培养基中生
物量和多糖含量，结果如图６所示。由图６可知，在
２６℃下培养，姬松茸生长效果最好，此时多糖质量
浓度达到２７９ｇ／Ｌ，温度过低和过高都会抑制微生
物的生长，影响其多糖产量的增加，故选择２６℃为
最适培养温度。
图６　培养温度对姬松茸深层发酵的影响
Ｆｉｇ６　Ｅｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｓｕｂｍｅｒｇｅｄ
ｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡＢＭ
２１６　培养时间对姬松茸发酵的影响
选择１～９ｄ作为发酵周期，测量培养基中生物
量和多糖含量，结果如图７所示。由图７可知，第
７ｄ两项指标均达到最大值，其中多糖质量浓度为
３４５ｇ／Ｌ。此后，随时间的延长，多糖产量和菌体生
物量趋于平稳，故选７ｄ为最适培养时间。
２２　显著性因素的筛选
根据Ｃ、Ｎ源浓度、培养温度、培养时间及微量
元素配比的单因素试验结果，设计了 ｎ＝１２的
ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选试验。每个因子取高（＋１）低
（－１）２个水平，以发酵液中多糖产量为响应值 Ｙ，
６６ 生　物　加　工　过　程　　 第７卷　
图７　培养时间对姬松茸深层发酵的影响
Ｆｉｇ７　Ｅｆｅｃｔｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｏｎｔｈｅ
ｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆＡＢＭ
结果如表１所示。各因素的效应评价及系数估计见
表２。“Ｐｒｏｂ＞Ｆ”小于００５，说明该因素是显著的，
可进一步对其进行考察。由表２可知，蔗糖质量浓
度、培养温度、微量元素配比及酵母膏质量浓度对
姬松茸深层发酵产多糖有显著性影响。
表１　ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ设计矩阵及结果
Ｔａｂｌｅ１　ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
序
号
因素
蔗糖 培养时间
培养
温度
微量元
素配比 酵母膏
Ｙ／
（ｇ·Ｌ－１）
１ －１ －１ １ １ １ ３１３
２ １ １ １ －１ １ ２６８
３ －１ －１ －１ １ １ ２９８
４ １ １ －１ １ －１ ２９２
５ １ －１ １ １ －１ ２９６
６ １ －１ １ －１ －１ ２８７
７ －１ １ １ １ －１ ３２０
８ －１ １ －１ －１ －１ ３０４
９ １ １ －１ １ １ ２７２
１０ －１ １ １ －１ １ ２９７
１１ －１ －１ －１ －１ －１ ３１１
１２ １ －１ －１ －１ １ ２６１
表２　ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ设计实验的结果分析
Ｔａｂｌｅ２　ＡｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
因素 效 应 系 数 系数标准误 Ｔ Ｐ
常量 — ２９３２３００１０３４２８３５４０
蔗糖质量浓度 －０２７６７－０１３８３００１０３４－１３３８０
培养时间 －００２１３－００１０７００１０３４－１０３０３４２
培养温度 ００７００００３５０００１０３４ ３３８００１５
微量元素配比 ０１０１０００５０５００１０３４ ４８８０００３
酵母膏质量浓度 －０１６６３－００８３２００１０３４－８０４０
注：置信度９５％，α为００５
２３　正交试验
根据ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选试验结果，采用正交
试验对蔗糖质量浓度、培养温度、微量元素配比及
酵母膏质量浓度４因素进行优化。根据２１单因素
试验中４因素的试验结果，本试验取各因素的最大
值作为中间水平，进行Ｌ９（３
４）正交试验。各因素的
选取水平见表３，试验设计及结果分析见表４和图８
所示。
表３　正交试验因素水平
Ｔａｂｌｅ３　Ｆａｃｔｏｒａｎｄｌｅｖｅｌｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
水 平 ρ
（蔗糖）Ａ／
（ｇ·Ｌ－１）
培养温度
Ｂ／℃
ρ（ＫＨ２ＰＯ４
＋ＭｇＳＯ４）
Ｃ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（酵母膏）
Ｄ／（ｇ·Ｌ－１）
１ ４５ ２５ ２５＋１２５ ２５
２ ５０ ２６ ３＋１５ ３
３ ５５ ２７ ３５＋１７５ ３５
表４　正交试验设计及结果分析
Ｔａｂｌｅ４　Ｒｅｓｕｌｔｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
试验号
因　　素
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
ρ（多糖）／
（ｇ·Ｌ－１）
１ １ １ １ １ ３３５
２ １ ２ ２ ２ ３５０
３ １ ３ ３ ３ ３２５
４ ２ １ ２ ３ ２６８
５ ２ ２ ３ １ ２８２
６ ２ ３ １ ２ ３５２
７ ３ １ ３ ２ ２９８
８ ３ ２ １ ３ ３０２
９ ３ ３ ２ １ ２７６
表５　误差分析
Ｔａｂｌｅ５　Ｅｒｒｏｒｏｆａｎａｌｙｓｉｓ
均值１ 均值２ 均值３ 极 差
３３７ ３０１ ２９２ ０４４
３００ ３１１ ３１８ ０１８
３３０ ２９８ ３０２ ０３２
２９８ ３３３ ２９９ ０３６
　　正交试验结果表明：蔗糖质量浓度是姬松茸液
体深层发酵产多糖的最显著性因素，其余３种因素
对姬松茸发酵的显著性影响程度依次、酵母膏质量
浓度，微量元素配比，培养温度。由图８可知，４因
素的最佳组合为 Ａ１Ｂ３Ｃ１Ｄ２，即蔗糖质量浓度
４５ｇ／Ｌ，培养温度２７℃，ＫＨ２ＰＯ４２５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４
１２５ｇ／Ｌ，酵母膏质量浓度３ｇ／Ｌ。按所得最优发酵
条件将姬松茸液体深层培养７ｄ，并取３个平行，得
到的多糖质量浓度分别为４６６、４６２、４６４ｇ／Ｌ，平
７６　第５期 张蓉娇等：基于姬松茸深层发酵的ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选
均值为４６４ｇ／Ｌ，与其他有关姬松茸深层发酵培养
工艺研究的报道相比，按本文优化后的条件进行培
养，姬松茸多糖产量明显提高。
图８　因素水平与指标关系
Ｆｉｇ８　Ｔｈｅｔｒｅｎｄｏｆｆａｃｔｏｒｓａｎｄｉｎｄｅｘｓｉｎ
ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
３　结　论
通过对姬松茸进行液体深层发酵，研究了其对
不同种单糖、双糖、多糖、有机Ｎ及无机Ｎ的利用效
果，筛选出蔗糖和酵母膏为最适Ｃ、Ｎ源。
应用Ｍｉｎｉｔａｂ１５软件对影响姬松茸深层发酵的
５个因素进行了Ｐｌａｃｋｅｔ Ｂｕｒｍａｎ筛选试验，得出蔗
糖质量浓度、培养温度、微量元素配比及酵母膏质
量浓度为显著性因素，并采用正交试验对其进行优
化，确定最佳培养工艺条件：蔗糖４５ｇ／Ｌ，酵母膏
３ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４２５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４１２５ｇ／Ｌ，培养温度
２７℃，培养时间７ｄ，此时多糖质量浓度为４６４ｇ／Ｌ。
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８６ 生　物　加　工　过　程　　 第７卷