全 文 ：第７卷第１期
２００９年１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．１
Ｊａｎ．２００９
收稿日期：２００８０４２４
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０６０６０１８）；国家重点基础研究发展计划（９７３计划）资助项目（２００７ＣＢ７０７８０５）；国家高技术研究发展
计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２Ｚ２４４）；江苏省博士后科研资助计划项目（０７０１０３５Ｂ）
作者简介：杜 军（１９８３— ），男，湖北丹江口人，硕士研究生，研究方向：发酵工程；黄 和（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｂｉｏｔｅｃｈ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
产酸克雷伯氏杆菌发酵产２，３－丁二醇
的培养基优化
杜 军，纪晓俊，黄 和，胡 南，任 潇，聂志奎，李 霜
（南京工业大学 制药与生命科学学院，材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１０００９）
摘 要：采用不同设计方法相结合的策略对耐高糖产酸克雷伯氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ）ＭＥＵＤ３４发酵产２，３－丁
二醇的培养基进行优化。首先在单因素实验的基础上采用ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ设计法对影响ＭＥＵＤ３４发酵产２，３－丁
二醇的相关因素进行研究，筛选到３种有显著效应的因素（Ｐ＜００５）：葡萄糖、玉米浆和ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ。然后利用响
应曲面法（ＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）对这３种因素的最佳水平范围进一步探讨；对得到的回归模型进行分
析，得最佳条件（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２２０、玉米浆１９和ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０４；在最佳条件下，发酵８０ｈ，２，３－丁二醇产量从原
来的５７３ｇ／Ｌ提高到８６１ｇ／Ｌ，生产强度由０７２ｇ／（Ｌ·ｈ）提高到１０８ｇ／（Ｌ·ｈ）。
关键词：２，３－丁二醇；产酸克雷伯氏杆菌；ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ设计；响应面法
中图分类号：ＴＱ９２３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０１－００３４－０５
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｂｙＫｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ
ＤＵＪｕｎ，ＪＩＸｉａｏｊｕｎ，ＨＵＡＮＧＨｅ，ＨＵＮａｎ，ＲＥＮＸｉａｏ，
ＮＩＥＺｈｉｋｕｉ，ＬＩＳｈｕａｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｔｅｒｉａｌｓＯｒｉｅｎｔｅｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｉｎｖｏｌｖｉｎｇａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｄｅｓｉｇｎｓｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｐ
ｔｉｍｉｚｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｂｙＫｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａＭＥＵＤ４ｗｈｉｃｈｔｏｌｅｒａｔｅｄｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆｇｌｕｃｏｓｅ．Ｂａｓｅｄｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｏｆａｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒ，ｔｈｅｔｗｏｌｅｖｅｌＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎｗａｓ
ｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆ１０ｖａｒｉａｂｌｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ．Ｇｌｕｃｏｓｅ，ｃｏｒｎ
ｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ，ａｎｄＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｔｈｅｍｏｓｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆａｃｔｏｒｓ（Ｐ＜００５）．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｓｅｆａｃｔｏｒｓｆｏｒ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ．Ｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｅｌ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｓｅｖａｒｉａｂｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓｆｏｌ
ｌｏｗｓ（ｇ／Ｌ）：ｇｌｕｃｏｓｅ２２０，ｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ１９，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０４．Ａｆｔｅｒ８０ｈｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｆｌａｓｋ，
ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ５７３ｇ／Ｌｔｏ８６１ｇ／Ｌ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｆｒｏｍ０７２ｇ／（Ｌ·ｈ）ｔｏ１０８ｇ／（Ｌ·ｈ）．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ；ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎ；ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
２，３－丁二醇作为一种重要的化工原料，在聚
酯、染料、药物合成、炸药等领域有着广泛的应用前
景［１－２］。随着石油价格的日益攀升，用微生物发酵
法来生产 ２，３－丁二醇并对其衍生物进行开发应用
逐渐引起了人们的关注，获得高浓度的 ２，３－丁二
醇是研究人员的共同目标［３］。
笔者在前期工作的基础上［４－５］筛选到１株可以
耐受葡萄糖质量浓度高达３５０ｇ／Ｌ的 ２，３－丁二醇
生产菌株产酸克雷伯氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ）
ＭＥＵＤ３４，为高密度发酵提供了必要条件。针对
发酵过程中产物浓度较低的问题，对其培养条件进
行优化，为工业化生产 ２，３－丁二醇奠定基础。
１ 材料与方法
１１ 菌 株
产酸克雷伯氏杆菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ）ＭＥＵＤ
３４，本实验室筛选保藏。
１２ 培养基
固体培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ５０～３５０，蛋白胨
１０，牛肉膏 ３，ＮａＣｌ５，琼脂 １８；
液体种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ５０～３５０，蛋白
胨 １０，牛肉膏 ３，ＮａＣｌ５，Ｋ２ＨＰＯ４２；
原始发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ２００，Ｋ２ＨＰＯ４·
３Ｈ２Ｏ１３７，ＫＨ２ＰＯ４２０，（ＮＨ４）２ＨＰＯ４３３，（ＮＨ４）２ＳＯ４
６６，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０２５，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００５，ＺｎＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ０００１，ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ０００１。
上述培养基的初始 ｐＨ均为６８～７０，１２１℃
下灭菌１５ｍｉｎ（ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ溶液配制完成后用孔
径０２２μｍ的无菌双层微孔滤膜过滤备用）。
１３ 培养方法
种子培养：将甘油管保藏的菌种转接至固体培
养基，３７℃下活化１２ｈ。接１环活化的菌种于装有
５０ｍＬ液体种子培养基的２５０ｍＬ三角瓶中，在转速
为１２０ｒ／ｍｉｎ的台式恒温（３７℃）摇床中，培养１２ｈ
获得种子细胞。
发酵培养：将上述种子液以体积分数１０％的接
种量接入装有５０ｍＬ发酵培养基的２５０ｍＬ三角瓶
中，３７℃恒温振荡培养，摇床转速２２０ｒ／ｍｉｎ。
１４ 分析检测方法
２，３－丁二醇浓度检测：利用 Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｎ气
相色谱仪检测，以正丁醇为内标进行定量检测。
菌体生物量测定：使用 ＵＶ１２００型紫外分光光
度计在６００ｎｍ处测其吸光值（Ａ６００）。
葡萄糖质量浓度测定：利用生物传感仪 ＳＢＡ
４０Ｃ测定。
１５ 实验设计
１５１ ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ实验设计
ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ（ＰＢ）法基于不完全平衡块原理，
广泛应用于微生物发酵培养基成分的优化和发酵工
艺关键参数的筛选；通过对实验进行统计学设计和数
据分析，筛选出对目标值影响最大的关键因素［６－７］。
根据产酸克雷伯氏杆菌生长所需营养要素的一般
原则以及微生物发酵影响因子的一般规律，在单因素
试验的基础上，将初步优化后的Ｃ、Ｎ源再加上无机盐
共１０个因素：葡萄糖、玉米浆、尿素、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２分别作为ＰＢ试验的考察因
素。选用ｎ＝１２的ＰＢ设计，每个因素取高低２个水
平，以２，３－丁二醇的产量为响应值；采用软件ＳＴＡＴＩＳ
ＴＩＣＡ６０安排实验，试验重复３次分别取平均值，试验
设计见表１。
表１ ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ设计因子及水平
Ｔａｂｌｅ１ Ｒａｎｇｅｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ
ｗｉｔｈＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ
编号 变量
编码水平
－１ ＋１
１ Ｘ１（葡萄糖） １２００００ １８００００
２ Ｘ２（玉米浆） ８０００ １５０００
３ Ｘ３（尿素） ３０００ ５０００
４ Ｘ４（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４） １６５０ ３３００
５ Ｘ５（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０１２５ ０２５０
６ Ｘ６（Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ） ０４００ ０８００
７ Ｘ７（ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ００２５ ００５０
８ Ｘ８（ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ００１０ ００２０
９ Ｘ９（ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ） ００１０ ００２０
１０ Ｘ１０（ＣａＣｌ２） ００００ ００１０
１５２ 响应面（ＲＳＭ）实验设计
响应曲面法在微生物培养条件方面有广泛应
用［８－９］。由ＰＢ实验设计筛选出影响 ＫｏｘｙｔｏｃａＭＥ
ＵＤ３４发酵产２，３－丁二醇的关键因素，再采用响应
面法对其进一步研究，以获得产 ２，３－丁二醇最佳培
养条件。
２ 结果与讨论
２１ ＰＢ设计筛选影响２，３－丁二醇量的重要因素
实验以 ２，３－丁二醇量为响应值，重复３次取
５３ 第１期 杜 军等：产酸克雷伯氏杆菌发酵产２，３－丁二醇的培养基优化
平均值，结果见表２，实验分析及因素效应见表３。
由表 ３数据可以分析得到，葡萄糖、玉米浆、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ的 Ｐ值（大于 Ｆ值的概率）＜００５，
说明这３个因素为统计重要的，是主效应。这３个
因素对 ＫｏｘｙｔｏｃａＭＥＵＤ３４发酵生产 ２，３－丁二
醇有显著影响，可以进入下一步 ＲＳＭ实验；而其他
不显著因素，不加入培养基优化试验。
表２ ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ实验设计及响应值（ｎ＝１２）
Ｔａｂｌｅ２ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｖａｌｕｅｓｏｆＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ（ｎ＝１２）
Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９ Ｘ１０
ρ（２，３－丁二醇）／
（ｇ·Ｌ－１）
１ －１ １ －１ －１ －１ １ １ １ －１ ６５７
１ １ －１ １ －１ －１ －１ １ １ １ ７１２
－１ １ １ －１ １ －１ －１ －１ １ １ ５３６
１ －１ １ １ －１ １ －１ －１ －１ １ ６３４
１ １ －１ １ １ －１ １ －１ －１ －１ ７８０
１ １ １ －１ １ １ －１ １ －１ －１ ８０６
－１ １ １ １ －１ １ １ －１ １ －１ ５１７
－１ －１ １ １ １ －１ １ １ －１ １ ４６５
－１ －１ －１ １ １ １ －１ １ １ －１ ４８１
１ －１ －１ －１ １ １ １ －１ １ １ ６９３
－１ １ －１ －１ －１ １ １ １ －１ １ ４９９
－１ －１ －１ －１ －１ －１ －１ －１ －１ －１ ４０３
表３ 偏回归系数及影响因子的显著性分析
Ｔａｂｌｅ３ Ｐａｒｔｉａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
变量 系数 Ｔ Ｐ 显著性
Ｘ１（葡萄糖） １１５０８３３ １５３４４４４ ０００４１４９
Ｘ２（玉米浆） ４３０８３３ ５７４４４４ ００１１０８１
Ｘ３（尿素） ０３９１６７ ５２２２２ ０１２０４４８
Ｘ４（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４） －００４１６７ －０５５５６ ０６７７１７１
Ｘ５（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ２８２５００ ３７６６６７ ００１６８９７
Ｘ６（Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ） ０６４１６７ ８５５５６ ００７４０７４
Ｘ７（ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０３２５００ ４３３３３ ０１４４３８５
Ｘ８（ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０４７５００ ６３３３３ ００９９６９６
Ｘ９（ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ） ００７５００ １００００ ０５０００００
Ｘ１０（ＣａＣｌ２） －０８７５００ －１１６６６７ ００５４４３４
２２ ＲＳＭ实验优化发酵培养基
由 ＰＢ实验结果可知，影响 ２，３－丁二醇产量
的３个显著因素分别是葡萄糖、玉米浆和ＭｇＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ，根据响应面中心复合试验设计原理，设计３
因素５水平共１６个试验点的响应面分析实验，以
２，３－丁二醇产量为响应值，各自变量水平见表４，
实验设计及结果见表５。
表４ 中心组合设计各因素水平
Ｔａｂｌｅ４ ＲａｎｇｅｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｆａｃｔｏｒｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｗｉｔｈＣＣＤｄｅｓｉｇｎ
ｇ·Ｌ－１
因素 变量
水 平
－１６８２ －１ ０ １ １６８２
Ａ ρ（葡萄糖） ８２７２０ １１０ １５０ １９０ ２１７２００
Ｂ ρ（玉米浆） ９９５４ １２ １５ １８ ２００４６
Ｃ ρ（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０１３２ ０２ ０３ ０４ ０４６８
６３ 生 物 加 工 过 程 第７卷
表５ 中心组合设计及结果
Ｔａｂｌｅ５ＣＣＤｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｖａｌｕｅｓ
Ａ Ｂ Ｃ ρ（２，３－丁二醇）／（ｇ·Ｌ－１）
－１ －１ －１ ４４８
１ －１ －１ ４５４
－１ １ －１ ４８７
１ １ －１ ５３１
－１ －１ １ ６９４
１ －１ １ ７４６
－１ １ １ ７６３
１ １ １ ８２３
－１６８２ ０ ０ ３７６
１６８２ ０ ０ ８４７
０ －１６８２ ０ ６３５
０ １６８２ ０ ７３９
０ ０ －１６８２ ７１２
０ ０ １６８２ ７４０
０ ０ ０ ７１４
０ ０ ０ ７１５
２２１ 二次回归拟合及方差分析
借助软件 ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ６０对以上实验点的响
应值进行分析得到拟合全变量二次回归方程，各变
量的偏回归系数估计值及方差分析结果见表６。得
到拟合方程为
Ｙ＝７１４８３＋１３８９９Ｘ１－４３５６Ｘ
２
１＋３１９９Ｘ２－
１６８６Ｘ２２ ＋２８５１Ｘ３ －２２１１Ｘ
２
３ ＋０３７５Ｘ１Ｘ３ ＋
０７５５Ｘ１Ｘ３＋０５７５Ｘ２Ｘ３ （１）
其中Ｙ为 ２，３－丁二醇产量（ｇ／Ｌ），Ｘ１、Ｘ２和Ｘ３分别
为葡萄糖、玉米浆、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ的质量浓度。
表６ 二次模型回归方程系数显著性检验
Ｔａｂｌｅ６ Ｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｅｓｔｉｍａｔｅｓｂｙｔｈｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ
ｑｕａｄｒａｔｉｃｍｏｄｅｌ
因素 回归系数 标准偏差 ｔ（６） ｐ
Ｘ１ １３８９８６ ０８１６１ １７０３００ ＜００００１
Ｘ２１ －４３５５５ ０９２０１ －４７３３６ ０００３２
Ｘ２ ３１９９１ ０８１６１ ３９１９９ ０００７８
Ｘ２２ －１６８６２ ０９２０１ －１８３２６ ０１１６５
Ｘ３ ２８５０８ １００８５ ２８２６５ ００３０１
Ｘ２３ －２２１１２ １１１３０ －１９８６７ ００９４１
Ｘ１Ｘ２ ０３７５０ １０６６３ ０３５１６ ０７３７１
Ｘ１Ｘ３ ０７７５０ １０６６３ ０７２６８ ０４９４７
Ｘ２Ｘ３ ０５７５０ １０６６３ ０５３９２ ０６０９１
平均值 ７１４８２７ １７４３３ ４１００２１ ＜００００１
回归各项的方程分析结果表明：Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３的一次
项和Ｘ１的二次项影响都是显著的，Ｘ３的二次项是边际
显著的。决定系数Ｒ２为０９８２７，说明这３个因素能解
释Ｙ变化的９８２７％，模型拟合程度较好。因此可用方
程（１）对２，３－丁二醇发酵过程进行分析和预测。
２２２ ２，３－丁二醇产量响应面分析与优化
借助ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ６０软件对上述回归方程所
作出的响应曲面图见图１～３，各因子及其交互作用
对响应值的影响结果可通过该组图直观反映出来。
图１ 葡萄糖与玉米浆交互影响 ２，３－丁二醇产量的曲面图
Ｆｉｇ．１ Ｓｕｒｆａｃｅｏｆｍｕｔｕａｌｉｎｆｌｕｅｎｃｅｆｏｒｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｃｏｒｎｓｔｅｅｐ
ｌｉｑｕｏｒｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ
图２ 葡萄糖与ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ交互影响
２，３－丁二醇产量的曲面图
Ｆｉｇ．２ ＳｕｒｆａｃｅｏｆｍｕｔｕａｌｉｎｆｌｕｅｎｃｅｆｏｒｇｌｕｃｏｓｅａｎｄＭｇＳＯ４·
７Ｈ２Ｏｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ
由图１～３可以看出，３个关键因素在所确定的
质量浓度范围内对 ２，３－丁二醇产量的影响都是显
著的，但各因素间存在的交互作用仍然存在一定的差
别。为进一步验证最佳点的值，将所得回归方程分别
７３ 第１期 杜 军等：产酸克雷伯氏杆菌发酵产２，３－丁二醇的培养基优化
图３ 玉米浆与ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ交互影响
２，３－丁二醇量的曲面图
Ｆｉｇ３ Ｓｕｒｆａｃｅｏｆｍｕｔｕａｌｉｎｆｌｕｅｎｃｅｆｏｒｃｏｒｎｓｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒａｎｄ
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ
对各自变量取一阶偏导为０，对得到的三元一次方程
组求解。可得模型极值坐标为：Ｘ１＝１７５３，Ｘ２＝
１３３５，Ｘ３＝１１２５，即对应的葡萄糖、玉米浆和ＭｇＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ的质量浓度分别为２２０１２０、１９００５和０４１３ｇ／Ｌ。
此时，模型预测的２，３－丁二醇最大量为８７４０６ｇ／Ｌ。
为了检验模型预测的准确性，同时为了实际操作便利，
取葡萄糖、玉米浆和ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ的质量浓度分别为
２２０、１９和０４０ｇ／Ｌ，其他条件不变。在最佳发酵条件
下进行发酵试验，重复 ３次所得平均质量浓度为
８６１ｇ／Ｌ，为模拟值的 ９８５％，而原始发酵条件下
ＫｏｘｙｔｏｃａＭＥＵＤ３４产２，３－丁二醇的质量浓度为
５７３ｇ／Ｌ，优化后产量提高了５０３％。
３ 结 论
首次将ＰＢ筛选和ＲＳＭ分析相结合应用于产酸
克雷伯氏杆菌产２，３－丁二醇发酵工艺的优化，研
究结果表明：
１）应用 ＰＢ实验设计，对影响 ＫｏｘｙｔｏｃａＭＥ
ＵＤ３４发酵产２，３－丁二醇的诸多因子进行了评
价，显著影响 ２，３－丁二醇质量浓度的因子为葡萄
糖、玉米浆、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ；
２）通过ＲＳＭ分析，对以上３个关键因素进行研
究，得到ＫｏｘｙｔｏｃａＭＥＵＤ３４发酵产２，３－丁二醇的
数学模型；并用统计学方法对其进行分析得到这３个
关键因素的最佳组合为葡萄糖 ２２０ｇ／Ｌ、玉米浆
１９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０４ｇ／Ｌ。在最佳发酵条件下，
２，３－丁二醇质量浓度由５７３ｇ／Ｌ提高到８６１ｇ／Ｌ，
提高了５０３％，生产强度达到１０８ｇ／（Ｌ·ｈ）。
参考文献：
［１］ 纪晓俊，朱建国，高振，等．微生物发酵法生产 ２，３－丁二醇
的研究进展［Ｊ］．现代化工，２００６，２６（８）：２３２７．
ＪｉＸｉａｏｊｕｎ，ＺｈｕＪｉａｎｇｕｏ，ＧａｏＺｈｅｎ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ
ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｂｙｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｄｅｒｎ
ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ，２００６，２６（８）：２３２７．
［２］ ＳｙｕＭＪ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ
ＭｉｃｒｏｂｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，５５（１）：１０１８．
［３］ 李元芳，徐勤，曹学，等．黏质沙雷氏菌产２，３－丁二醇培养基
的优化［Ｊ］．工业微生物，２００７，３７（３）：２４２９．
ＬｉＹｕａｎｆａｎｇ，ＸｕＱｉｎ，ＣａｏＸｕｅ，ｅｔａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＳｅｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］．
ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，３７（３）：２４２９．
［４］ ＪｉＸＪ，ＨｕａｎｇＨ，ＬｉＳ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ２，３ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎｂｙａｌｔｅｒｉｎｇｔｈｅｍｉｘｅｄａｃｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｉｎＫｌｅｂｓｉｅｌａ
ｏｘｙｔｏｃａ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｅｒｓ，２００８，３０（４）：７３１７３４．
［５］ 杜军，纪晓俊，胡南，等．耐高糖高产 ２，３－丁二醇产酸克雷
伯氏杆菌的选育［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００８，２８（６）：
８９９２．
ＤｕＪｕｎ，ＪｉＸｉａｏｊｕｎ，ＨｕＮａｎ，ｅｔａｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌ
ｅｒａｎｔＫｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａｆｏｒｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ２，３ｂｕ
ｔａｎｅｄｉｏｌ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６）：８９９２．
［６］ ＷｅｕｓｔｅｒＤ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉａｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ：ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｅｓｉｇｎｏｒｇｌｏｂａｌｒａｎｄｏｍｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．ＪＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０００，９０（５）：４７３４８３．
［７］ ＰｌａｃｋｅｔＲＬ，ＢｕｒｍａｎＪＰ．Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｏｐｔｉｍｕｍｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ，１９４６，３３（４）：３０５３２５．
［８］ 陈魁．试验设计与分析［Ｍ］．北京：清华大学出版社，１９９６：
９４１８０．
［９］ 胡永红，沈树宝，欧阳平凯．响应面分析法用于微生物培养
基浓度的优化［Ｊ］．工业微生物，２００２，３２（１）：９１２．
ＨｕＹｏｎｇｈｏｎｇ，ＳｈｅｎＳｈｕｂａｏ，ＯｕｙａｎｇＰｉｎｇｋａｉ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅ
ｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ
ｆｏｒｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，３２（１）：
９１２．
８３ 生 物 加 工 过 程 第７卷