全 文 ：第９卷第３期
２０１１年５月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．３
Ｍａｙ２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０３．００３
收稿日期：２０１０－０５－１９
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００９ＣＢ７２４７０１）
作者简介：卢圣国（１９８５—），男，浙江温州人，硕士研究生，研究方向：工业微生物；孟庆雄（联系人），副教授，Ｅｍａｉｌ：ｑｘｍｅｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
原生质体紫外诱变技术选育１，３ 丙二醇高产菌株
卢圣国，熊　骏，祝扬扬，郭凡财，孟庆雄
（昆明理工大学 生命与科学技术学院，昆明 ６５０２１６）
摘　要：以肺炎克雷伯氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）为研究对象，应用原生质体紫外诱变技术提高其对甘油及
１，３丙二醇的耐受性，获得１，３丙二醇高产菌。在原生质体制备过程中，运用滤膜去除酶解后细胞悬液中的正常
菌体，简化菌体酶解过程，提高再生率及形成率。经过原生质体诱变后，以耐受高浓度甘油和１，３ 丙二醇及高产
酸能力为筛选方向，最终筛选到了３株高产菌株（Ｋｐ １、Ｋｐ ４和 Ｋｐ ５）。在补料发酵实验中，上述诱变菌产
１，３丙二醇能力分别为７０２４、６５２１和７５５１ｇ／Ｌ，比野生菌株 ＷＴ（５５７８ｇ／Ｌ）分别提高了２５９２％、１６９１％
和３５３７％。
关键词：１，３丙二醇；肺炎克雷伯氏杆菌；甘油；原生质体；诱变
中图分类号：Ｑ９３３　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０３－００１１－０６
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆ１，３ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｈｉｇｈｙｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｂｙＵＶｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ＬＵＳｈｅｎｇｇｕｏ，ＸＩＯＮＧＪｕｎ，ＺＨＵＹａｎｇｙａｎｇ，ＧＵＯＦａｎｃａｉ，ＭＥＮＧＱｉｎｇｘｉｏｎｇ
（ＦａｃｕｌｔｙｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＫｕｎｍｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２１６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄ１，３ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｔｏｌｅｒａｎｃｅｓｔｒａｉｎｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙ
ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ．Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇｂｙｍｉｌｉｐｏｒｅｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｔｈｅｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｅｎ
ｈａｎｃｅｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｔｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ａｉｍｅｄａｔｔｈｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄ１，３ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌａｎｄｈｉｇｈ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｃｉｄ，ｔｈｒｅｅｈｉｇｈｙｉｅｌｄｍｕｔａｎｔｓ，Ｋｐ１，Ｋｐ４ａｎｄＫｐ５，ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｉｎｆｅｄｂａｔｃｈｆｅｒ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｂｏｖｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅ７０．２４ｇ／Ｌ，６５．２１ｇ／Ｌ，ａｎｄ７５．５１ｇ／Ｌ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ２５９２％，１６９１％ ａｎｄ３５３７％ ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：１，３ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ｇｌｙｃｅｒｏｌ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
　　１，３ 丙二醇是一种重要的化工原料，可直接
作为抗冻剂，也是多种洗涤剂、防腐剂及乳化剂等
的合成原料［１］，还是合成新型聚酯 ＰＴＴ的单体之
一［２］。利用微生物法产１，３ 丙二醇，其优越性在
于廉价的原料、温和的反应条件，同时可有效缓解
化工产品对石油的压力。因此，高产性能１，３ 丙
二醇生产菌株的选育是生物法生产 １，３ 丙二醇
的关键。
在１，３ 丙二醇发酵过程中，细胞的生长受到底
物和多种产物的抑制［３－４］。为了提高１，３ 丙二醇
产量和底物转化率，必须克服底物甘油、产物１，３
丙二醇和其他副产物对细胞生长的抑制作用。赵
红英等［５］通过提高培养基中甘油浓度和平板包埋
培养的方法驯化出了底物耐受力和厌氧生长能力
较高的Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ突变株，１，３ 丙二醇发
酵终浓度和转化率均有所提高。ＡｂｂａｄＡｎｄａｌｏｕｓｓｉ
等［６］通过亚硝基胍诱变和质子自杀的方法筛选出
的Ｃｂｕｔｙｒｉｃｕｍ突变株可耐受高浓度甘油和１，３
丙二醇，并且产乙酸途径发生突变，１，３ 丙二醇产
量大幅提升。
原生质体技术已成为工业微生物菌种选育的
一种重要手段，较一般常规诱变方法好，且能在较
短时间内较大幅度地提高菌种的突变率。盛翠
等［７］通过原生质体紫外诱变选育鸟苷高产菌，获得
鸟苷产量达到２４０ｇ／Ｌ的高产菌，比出发菌株提高
了３０％。朱林东等［８］应用原生质体紫外诱变技术
获得一株高产普纳霉素的突变始旋链霉菌，普纳霉
素产量达到 １５９ｇ／Ｌ，比出发菌提高了 １０１３％。
但是利用原生质体诱变技术选育１，３ 丙二醇高产
菌，国内外还少有研究。
笔者采用原生质体诱变技术对 Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ菌株进行选育，应用该技术改良１，３ 丙二醇
生产菌株，以期能应用于工业生产。
１　材料与方法
１１　菌株
出发菌株ＷＴ来自肺炎克雷伯氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ２５９５５。
１２　培养基及方法
１２１　培养基
１）ＬＢ液体培养基（ｇ／Ｌ）蛋白胨 １０，酵母膏 ５，
ＮａＣｌ１０。
２）完全固体培养基（ｇ／Ｌ）蛋白胨 １０，葡萄糖
１０，酵母膏 ５，ＮａＣｌ５，牛肉膏５，琼脂 ２２；ｐＨ７０。
３）再生固体培养（ＲＣＭ）（ｇ／Ｌ）蔗糖 １７１５，
ＭｇＣｌ２４２７３，其余同完全固体培养基。
４）种子培养基（Ｍ１）（ｇ／Ｌ）酵母膏 ３，麦芽糖
３，蛋白胨５，ＮａＣｌ５；调ｐＨ至７０。
５）发酵培养基（Ｍ２）（１Ｌ） 酵母膏 ５ｇ，
Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ１０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４２ｇ，ＮＨ４Ｃｌ１ｇ，ＮａＣｌ
０５ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０１ｇ，ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ３０ｍｇ，
ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ５ｍｇ，ＶＢ１２ ５ｍｇ，甘油 ５０ｇ；调 ｐＨ
至７０。
６）筛选培养基 基于种子培养基，另外加入甘
油１３０ｇ／Ｌ，１，３ 丙二醇６０ｇ／Ｌ，琼脂２２ｇ／Ｌ。
１２２　试剂
１）高渗缓冲液（ＳＭＭ）０５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，００２
ｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，００２ｍｏｌ／Ｌ顺丁烯二酸，ｐＨ７０，灭菌
备用。
２）溶菌酶 使用前用ｐＨ为８０的ＳＭＭ即刻溶
解溶菌酶，配制１０ｍｇ／ｍＬ的贮存液，过滤除菌，使
用时稀释。
１２３　培养方法
筛选到的菌株在装有 １００ｍＬ种子培养基的
２５０ｍＬ摇
!
中培养 ８ｈ，作为种子液；按接种量
２％接种到装有１００ｍＬ发酵培养基的 ２５０ｍＬ摇
!
内培养３０ｈ。培养条件：微氧（窄口的摇瓶用橡
胶塞）、３７℃、转速 １４０ｒ／ｍｉｎ。补料发酵实验在
７Ｌ发酵罐中进行，补料过程甘油浓度维持在
２０ｇ／Ｌ，装液量为 ４Ｌ，接种量 ５％，发酵温度
３７℃，转速３００ｒ／ｍｉｎ，单位时间单位体积的发酵
液中通气量为０２５个体积，用１０ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶
液维持 ｐＨ７０。
１２４　产物、底物和菌体量分析
生物量测定采用比浊法，在分光光度计（ＤＵ
６４０，Ｂｅｃｋｍａｎ，ＵＳＡ）上于６００ｎｍ处进行测定。发酵
液中甘油、１，３ 丙二醇、乳酸等用高效液相色谱仪
（ＨＰＬＣ）测定。色谱条件：ＢｉｏＲａｄＨＰＸ ８７Ｈ柱，柱温
６５℃，流动相为 ０００５ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４，流速为 ０８００
ｍＬ／ｍｉｎ；检测器为ＳｈｏｄｅｘＲＩ１０１型折光示差检测器。
１３　原生质体制备方法
１３１　传统的原生质体制备方法
１）菌体预处理 菌株经ＬＢ液体培养基活化６ｈ
后，按２％的接种量转入液体 ＬＢ培养基，添加不同
浓度的甘氨酸，３７℃、１４０ｒ／ｍｉｎ培养６ｈ。取培养
后的菌液适当稀释（细胞１０７～１０８个／ｍＬ），于４０００
ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ，收集菌体，加入５ｍＬＳＭＭ
洗涤离心２次，最后将菌体保持在５ｍＬＳＭＭ成菌
悬液。
２）原生质体制备 取１ｍＬ菌悬液，加入 ＥＤＴＡ
００１ｍｏｌ／Ｌ，常温处理０５ｈ后，按１）中的方法洗涤
菌悬液；加入溶菌酶液（２ｍｇ／ｍＬ），混匀后水浴保温
酶解破壁一定时间，每隔３０ｍｉｎ镜检。将酶解后的
细胞悬液３０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ，收集细胞，
用ＳＭＭ洗涤离心２次。
１３２　高纯度原生质体制备方法
１）菌体预处理过程经ＬＢ培养基活化６ｈ后，不
经过含甘氨酸的 ＬＢ培养基处理，适当稀释后于
４０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ，收集菌体，加入５ｍＬ
ＳＭＭ洗涤离心２次，最后将菌体保持在５ｍＬＳＭＭ
成菌悬液。加入溶菌酶液（２ｍｇ／ｍＬ），混匀后水浴
保温酶解破壁一定时间，每隔３０ｍｉｎ镜检。将酶解
２１ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
后的细胞悬液３０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ，收集细
胞，用ＳＭＭ洗涤离心２次。
２）经过ＳＭＭ洗涤离心后的细胞悬液经过不同
规格的滤膜（０２２和０４５μｍ）处理，于无菌条件下
滤除正常菌体。
１４　原生质体形成率及再生率计算
将１３中不同方式处理的菌悬液或细胞悬液适
当稀释，取５０μＬ涂布完全平板和再生平板。
原生质体形成率＝（Ｃ－Ｂ）／Ｃ×１００％
原生质体再生率＝（Ｃ－Ｂ）／Ａ×１００％
式中：Ａ为加酶液之前的菌悬液在完全平板生长的
总菌落数；Ｂ为原生质体悬液或经滤膜过滤后原生
质体悬液经无菌水稀释完全培养板上的残余正常
菌落数；Ｃ为酶解后或酶解完并经滤膜过滤后再生
培养板生长的菌落数。
１５　原生质体诱变及诱变菌筛选
１）紫外诱变 将１ｍＬ原生质体悬液置于培养皿
内进行紫外诱变。紫外灯功率为１５Ｗ，照射距离为
３０ｃｍ，照射时间分别为３０、６０、９０、１２０、１５０和１８０ｓ。
２）原生质体再生 将诱变后的细胞悬液适当稀
释，涂布于再生培养板，３７℃下培养４８～７２ｈ。对
再生菌落进行筛选。
３）致死率计算 培养４８～７２ｈ后，进行菌落计
数。致死率＝（对照１ｍＬ的菌液中活菌数 －诱变
后１ｍＬ的菌液中活菌数）／对照１ｍＬ的菌液中活
菌数。
４）菌株筛选 将再生菌落逐一接种到再生培养
板。挑取再生培养板上耐受较高浓度甘油和１，３
丙二醇的菌落转入装有 Ｍ２的１０ｍＬ摇管中培养，
２０ｈ后用ｐＨ试纸检测并选取测试ｐＨ较低的菌落。
将高产酸菌落接种到含Ｍ１摇
!
培养８ｈ后，转到含
Ｍ２的摇
!
培养，培养条件同摇
!
发酵，分析代谢产
物及生长情况。最终筛选到的优良菌株进入发酵
罐培养分析。
２　结果与讨论
２１　原生质体制备方法比较
原生质体的制备和再生是进行原生质体诱变、融
合和基因组重排等相关遗传育种方法的先决条件。
因此，笔者对影响肺炎克雷伯氏杆菌原生质体制备和
再生的因素进行深入研究，比较２种不同制备方法。
２１１　传统的原生质体制备方法
甘氨酸可以替代丙氨酸参与细胞壁合成，使菌
体无法形成正常的细胞壁结构［９］。采用含不同浓
度甘氨酸的 ＬＢ培养基培养菌体，考察其对菌体生
长的影响，结果见图１。由图１可知：随着甘氨酸浓
度的增高，其对菌体生长抑制作用逐渐加强，当甘
氨酸质量分数大于１２％时，菌体生长明显受到抑
制。在酶解质量浓度为２ｍｇ／ｍＬ、１００ｒ／ｍｉｎ、３７℃
下作用 １ｈ，采用 ３个质量分数（０６％、０９％和
１２％）考察甘氨酸对原生质体形成的影响，结果见
表１。由表１可知：伴随着甘氨酸浓度的增加，原生
质体形成率逐渐增加，分别为 ８６％、９１％和 ９５％。
原生质体再生率随甘氨酸浓度先增加，在０９％甘
氨酸培养时，再生率达到最高（７５％），之后开始下
降。在１２％甘氨酸培养时，再生率仅为６１％。综
合考虑再生率和形成率的最优化，选择添加甘氨酸
的最适浓度为０９％。
图１　甘氨酸对菌体生长的影响
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｉｎｅｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｓｔｒａｉｎ
表１　甘氨酸对原生质体形成和再生的影响
Ｔａｂｌｅ１　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｉｎｅｏｎｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｗ（甘氨酸）／％
酶解前的
细胞数／
（１０７个·ｍＬ－１）
酶解后可生长
的细胞数／
（１０７个·ｍＬ－１）
酶解后残余的
正常细胞数／
（１０６个·ｍＬ－１）
原生质体
形成率／％
原生质体
再生率／％
０ ３５０ ２９０ ８８０ ７０ ５７
０６ １００ ８０ １１０ ８６ ６９
０９ ２６ ２１ １９ ９１ ７５
１２ ２１ １３ ６５ ９５ ６１
３１　第３期 卢圣国等：原生质体紫外诱变技术选育１，３丙二醇高产菌株
２１２　制备高纯度原生质体的新方法
利用滤膜可以截留正常菌体的原理，考察不同
规格滤膜分离获得高纯度的原生质体的可行性。
根据菌体及原生质体大小，以不加滤膜为对照，考
察了孔径为０２２和０４５μｍ的滤膜对原生质体的
影响。初始酶解条件根据文献［１０］及在显微镜下
目测形成率确定，菌体不经过甘氨酸预处理及 ＥＤ
ＴＡ处理，结果见表２。由表２可知：酶解后的菌悬
液经０２２、０４５μｍ滤膜后，再生菌落分别为 ０、
２１×１０７个／ｍＬ，原生质体形成率分别为 ０和
９９９％，无任何处理获得的再生菌落数为６３×１０７
个／ｍＬ，但原生质体形成率仅为７３％。通过计算发
现：过 ０４５μｍ滤膜后原生质体再生菌落约为
２１×１０７个／ｍＬ，与 ２１１中最佳酶解条件下原生
质体再生菌落数同属一个数量级，而且原生质体纯
度更高。该方法通过过滤除去正常菌体，有效减少
正常菌体对筛选过程的干扰和优化酶解条件繁琐
的工作量，获得高纯度较高再生率的原生质体，尤
其适合原生质体融合、基因组重排等育种工程。
表２　不同规格滤膜过滤酶解后菌悬液的效果
Ｔａｂｌｅ２　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｓｔａｎｄａｒｄｍｉｌｉｐｏｒｅｓｆｏｒｆｉｌｔｅｒｉｎｇｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｓｔｒａｉｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｐｒｏｃｅｓｓ
滤膜孔径／
μｍ
酶解前的细胞数／
（１０８个·ｍＬ－１）
酶解后可生长
的细胞数／
（１０７个·ｍＬ－１）
原生质体裂解后的
细胞数／
（１０４个·ｍＬ－１）
原生质体
再生率／％
对照 １１ ８６ ２３０００ ７３０
０２２ １１ ０ ０ ０
０４５ １１ ２１ １９ ９９９
　
２２　原生质体诱变剂量的确定及诱变菌株的筛选
表３为致死率与诱变剂量关系。由表３可知：
随着紫外照射时间增加，致死率也增加。经验表明
高诱变剂量有助于提高诱变率，但同时也会带来高
致死率。综合考虑，照射时间为９０ｓ比较合适，此
时致死率达到８７９８％。因此，采用紫外线照射９０ｓ
作为１，３ 丙二醇产生菌原生质体紫外诱变的处理
时间。原生质体诱变后，５０个固体筛选培养基上获
得了１０８０个菌落。从肺炎克雷伯氏杆菌的甘油代
谢途径分析，乙酸途径可以积累还原当量，促进
１，３ 丙二醇的合成［１１］。因此，在菌株筛选过程中
考察诱变菌产酸能力具有一定的科学性。虽然面
临乳酸干扰的问题，但该方法进一步缩小了有效筛
选的范围。摇管培养后，ｐＨ试纸检测，发现共有８
株诱变菌发酵液ｐＨ低于５０。
表３　紫外线照射不同时间对原生质体致死率的影响
Ｔａｂｌｅ３　ＥｆｅｃｔｓｏｆＵＶｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅｏｆｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｔ／ｓ ３０ ６０ ９０ １２０ １５０ １８０
致死率／％ １０１３±２１ ２３２１±３１ ８７９８±１８１ ９９８０±２５４ １００ １００
　
２３　摇
!
发酵分析
将８株产酸菌进行摇
!
发酵分析，结果如表４
所示。由表４可知：８株产酸突变菌株可分为乙酸
积累菌和乳酸积累菌，其中乙酸积累菌株产１，３ 丙
二醇浓度高，且菌体生物量也较多，如突变株
Ｋｐ １、Ｋｐ ４和 Ｋｐ ５，１，３ 丙二醇终质量浓度为
２３２１、２００１和２５８８ｇ／Ｌ，ＯＤ６００分别为９９２、８９７
和１２０１。更多生物量有助于１，３ 丙二醇生物合
成［２］。而乳酸积累菌的１，３ 丙二醇产量较低，推测
乳酸合成途径与１，３ 丙二醇合成途径竞争还原力，
改变Ｃ源代谢流［１２］。
２４　突变菌的遗传稳定性
将筛选到的 ３株诱变菌（Ｋｐ １、Ｋｐ ４和
Ｋｐ ５）在ＬＢ液体培养基上连续传代培养４０代后，
接种至摇瓶发酵培养基中培养３０ｈ，测定其产物，结
果见表５。由表５可知：３株诱变菌关于１，３ 丙二
醇产量的变化率均在４％以内，表明高产诱变菌遗
传稳定性良好。
４１ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
表４　诱变菌的摇
!
培养分析
Ｔａｂｌｅ４　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｕｔａｎｔｓｏｎｓｈａｋｅｆｌａｓｋ
菌株
ρ（产物）／（ｇ·Ｌ－１）
１，３丙二醇 乳酸 丁二酸 乙酸 乙醇
ＯＤ６００
Ｋｐ １ ２３２１ ２２５ ０９１ ３９１ ４２１ ９９２
Ｋｐ ２ １３０１ ３９２ ０９４ ２２１ ５１５ ８０１
Ｋｐ ３ １５６１ ３８５ １１９ ３２７ ４０２ ７９８
Ｋｐ ４ ２００１ ２８６ １０２ ３６５ ４６３ ８９７
Ｋｐ ５ ２５８８ １２０ ０９９ ４７９ ２２８ １２０１
Ｋｐ ６ ８２１ ４０１ １０３ １０５ ０８７ ４７８
Ｋｐ ７ ５７９ ３２１ １２３ ２８７ ２４５ ４０３
Ｋｐ ８ １０１２ ３６５ ０９７ ２１５ ２１８ ５６８
　
表５　诱变菌传代后的相对稳定性
Ｔａｂｌｅ５　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｕｔａｎｔｓ
ａｆｔｅｒｓｕｂｃｕｌｔｕｒｉｎｇ
菌株 Ｋｐ １ Ｋｐ ４ Ｋｐ ５
产量变化率／％ ９７８ ９６１ ９８２
　　　注：产量变化率为传代后的诱变菌株相对出发时诱变菌株的
１，３ 丙二醇产量比。
２５　补料发酵分析
将筛选到的且经传代培养过后的３株诱变菌
（Ｋｐ １、Ｋｐ ４和 Ｋｐ ５）进行补料发酵，以初始野
生菌ＷＴ为空白对照，结果如表６所示。由表６可
知：Ｋｐ １、Ｋｐ ４和Ｋｐ ５这３株诱变菌合成１，３
丙二醇代谢途径明显增强，分别达到７０２４、６５２１
和７５５１ｇ／Ｌ，较野生菌株 ＷＴ（５５７８ｇ／Ｌ）提高了
２５９２％、１６９１％和３５３７％；１，３ 丙二醇摩尔转化
率分别达到了６３％、６０％和６７％，较 ＷＴ（５３％）提
高了 １８８７％、１３２０％和 ２６４１％；ＯＤ６００分别达到
了１６３７、１５６８和 １７８３，较 ＷＴ（１２３１）提高了
３２９８％、２７３８％和４４８４％。
表６　野生菌和诱变菌在补料发酵实验中的比较
Ｔａｂｌｅ６　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｆｅｄｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｗｉｌｄｓｔｒａｉｎａｎｄｍｕｔａｎｔｓ
菌株 ρ
（甘油消耗）／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（产物）／（ｇ·Ｌ－１）
１，３丙二醇 ２，３丁二醇 丁二酸 乙酸 乙醇 乳酸
摩尔转化率／
％
生产强度／
（ｇ·ｈ－１·Ｌ－１）
ＯＤ６００
ＷＴ １３０５８ ５５７８ ４１ ５８１ ９７６ ９２４ ３１１２ ５３ １３９ １２３１
Ｋｐ １ １３４４５ ７０２４ ６１ ８９１ １５２３ １１２９ ３１８８ ６３ １７５ １６３７
Ｋｐ ４ １３１６８ ６５２１ ５４ ８６０ １３６９ １０２６ ４５５７ ６０ １６４ １５６８
Ｋｐ ５ １４７７６ ７５５１ ８１ ７９１ １９３５ １１０２ ２０２７ ６７ １８８ １７８３
　
３　结论
通过对产１，３ 丙二醇野生型菌株进行原生质
体诱变技术的育种，研究高纯度原生质体制备的方
法，以耐高浓度甘油和１，３ 丙二醇为初筛条件，高
产酸突变为复筛条件，获得３株产酸突变菌Ｋｐ １、
Ｋｐ ４和Ｋｐ ５。在补料发酵实验中，上述诱变菌
１，３ 丙二醇合成质量浓度分别为７０２４、６５２１和
７５５１ｇ／Ｌ，较野生菌株ＷＴ（５５７８ｇ／Ｌ）分别提高了
２５９２％、１６９１％和３５３７％。以上实验结果，初步
展现了原生质体紫外诱变技术在选育１，３ 丙二醇
高产菌中的应用。
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櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
９６５９７２．
国内简讯
“纤维素乙醇产业化关键技术研究及示范”项目通过验收
中国科学院过程工程研究所陈洪章研究员主持的中国科学院知识创新工程重要方向项目“纤维素乙醇
产业化关键技术研究及示范”以工艺工程一体化研究的总体思路为指导，通过多学科交叉和多种高新技术
集成，创立了具有完全自主知识产权的经济合理的秸秆发酵燃料乙醇产业化关键新技术，实现了３０００ｔ／ａ
秸秆酶解发酵燃料乙醇示范生产线的连续稳定运转，并使秸秆乙醇的综合成本达到５２００元／ｔ，促进了粮食
发酵燃料乙醇的经济竞争能力。
生物补片技术为腹壁疾病患者带来福音
上海交通大学医学院附属第九人民医院普外科成功应用新型生物组织再生材料实施大面积腹壁缺损
重建手术。此次手术中用于大面积修补缺损腹壁的新型生物材料将于手术后４个月左右在体内完全降解，
最终被人体再生的血管化组织取代，缩短了患者的康复时间。
我国首只人乳铁蛋白转基因克隆奶山羊诞生
２０１１年４月９日，我国第一只人乳铁蛋白转基因克隆奶山羊“欣欣”在山东曹县五里墩顺利诞生，其转
基因克隆鉴定工作随后将在南京农业大学实验室进行，这标志着我国生物新品种培育又获得重大突破。
（胡晓丽）
６１ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷