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Extraction of total flavoniods from Artemisia annua

栽培青蒿中总黄酮提取工艺



全 文 :第7卷第1期
2009年1月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.1
Jan.2009
收稿日期:20080717
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371334);海南省自然科学基金资助项目(80413);海南大学自然科学基金资助项目(kyj0430)
作者简介:朱 伟(1971—),女,浙江绍兴人,博士,副教授,研究方向:免疫药理学;朱 迅(联系人),教授,博士生导师,Email:zxunzhux@sohu.com
黄芩有效成分提取及对炎症反应的影响
朱 伟1,张守勤2,孙红光3,朱 迅3
(1.海南大学 海洋学院制药工程系,海南省热带水生生物技术重点实验室,海口 570228;
2.吉林大学 生物与农业工程学院,长春 130025;3.吉林大学 基础医学院免疫教研室,长春 130021)
摘 要:利用常温超高压方法提取黄芩中黄酮类物质,得到黄芩甲醇提取物(SBM)。对该物质抗炎作用研究发现
SBM(3125~500mg/L)可抑制刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖和脂多糖(LPS)诱导的腹腔巨噬细胞
TNFα合成,SBM(125mg/L)的抑制率分别可达96%、99%;SBM(10mg/kg、20mg/kg)也可抑制大鼠棉球性肉芽肿,但
不影响IκBα蛋白磷酸化。常温超高压方法可有效提取黄芩中黄酮类物质,黄芩提取物SBM可通过抑制淋巴细胞功
能、炎症介质发挥抗炎作用。
关键词:炎症;IκBα;黄芩;TNFα
中图分类号:R2842;R2855    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2009)01-0069-05
SeparationofScutelariabaicalensisanditsantiinflammatoryactivity
ZHUWei1,ZHANGShouqin2,SUNHongguang3,ZHUXun3
(1.DepartmentofPharmaceuticalEngineering,HainanKeyLaboratoryofTropicalHydrobiologicalTechnology,
OceanologyColege,HainanUniversity,Haikou570228,China;2.ColegeofBiologyandAgriculturalEngineering,JilinUniversity,
Changchun130025,China;3.DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China)
Abstract:Theextract—SBMwasisolatedfromScutelariaeradixbyhighhydrostaticpressureTheefectsof
SBMonConAinducedsplenocyteproliferation,LPSinducedTNFαproduction,andproteinphosphorylation
ofIκBαwerestudiedinvitro,andthetherapeuticefectsofSBMoncotonpeletinducedratgranuloma
wasalsoinvestigatedSBM (3125500mg/L)inhibitedConAinducedsplenocyteproliferationin
miceSBM(3125250mg/L)inhibitedLPSinducedTNFαproductionCotonpeletinducedratgranulo
mawassignificantlydecreasedbySBMwiththedosesof10mg/kgand20mg/kgSBMcouldinhibitin
flammatoryreactionItsmechanismswererelatedtothesuppressionofinflammatorymedium produc
tionHighhydrostaticpressuretreatmentcouldbeenusedtoseparatethemedicalplant.
Keywords:inflammation;IκBα;Scutelariabaicalensis;TNFα
  黄芩为唇形科草本植物黄芩(Scutelariaba
icalensisGeorgi)的根,具有清热燥湿、泻火解毒等功
效。黄酮类化合物如黄芩苷(baicalin)、黄芩苷元
(baicalein)、汉黄芩素、千层纸素A等是黄芩的主要
组成成分及活性成分,其中以黄芩苷的含量最高,
约占总质量的4%~52%,黄芩苷元次之。研究发
现:黄芩苷元可抑制 Ca2+载体 A23187诱导的大鼠
腹腔巨噬细胞合成白三烯,通过抑制脂氧化酶、干
扰花生四烯酸的代谢,抑制炎症反应;黄芩苷元还
可抑制大鼠佐剂性关节炎及角叉菜胶诱导的大鼠
足肿胀[1]。Nakahata等[2]研究表明,黄芩苷可抑制
葡萄球菌外毒素诱导的 T细胞增殖,抑制白细胞介
素1β(IL1β)、白细胞介素 6、肿瘤坏死因子 α
(TNFα)合成。此外,黄芩黄酮类化合物还具有抑
菌、杀菌,防辐射,抑制人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移
植瘤生长的作用[3-4]。
  黄芩有效成分提取常用水煮酸沉法,该方法周
期较长、费时。本研究利用常温超高压方法提取黄
芩中黄酮类物质,此法省时、方便,得率高,重复性
好,得到的提取物命名为SBM。前期工作表明:SBM
体外可明显抑制IL1β合成、COX2蛋白表达;并可
抑制大鼠佐剂性关节炎、甲醛诱导的大鼠足肿胀及
醋酸诱导的腹腔渗出[5]。本文观察 SBM对炎症因
子产生及慢性炎症动物模型的影响,进一步证实其
抗炎作用效果,期待为类风湿性关节炎治疗提供新
的治疗药物。
1 材料与方法
11 实验材料
  Wistar大鼠,♂,体质量160~180g;昆明种小
鼠,♂,体质量18~20g,由吉林大学动物部提供。黄
芩购于河北安国药材市场;刀豆蛋白A(ConA)、脂多
糖(LPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、角叉菜胶为美国
Sigma公司产品。Aprotinin购于Calbiochem公司。抗
磷酸化的NFκB抗体购于NewEnglandBiolabs。
12 实验方法
121 超高压法提取黄芩有效成分
  黄芩粉碎,加入体积分数为65%的甲醇溶液,
混匀后利用超高压设备,分别在200、600MPa的压
力下,持续作用5min,除去沉渣得到黄芩甲醇提取
物,命名为SBM。
122 水煮酸沉法提取黄芩有效成分
  取黄芩200g,粉碎,加水2L,煎煮1h。过滤,
药渣再加水15L,煎煮1h。过滤,合并2次滤液,
滴加浓HCl,酸化至pH=1。将酸化液置水浴80℃
保温1h,倒去上清液,沉淀用水洗涤至pH=5,沉淀
干燥后命名为SBZ。
123 淋巴细胞增殖实验
  按常规方法,将脾细胞分别与 ConA25mg/L、
ConA25mg/L与待测试样(SBM15625~500mg/L
或SBZ15625~500mg/L)的混合液共同培养48h,
加入H3TdR收集细胞并测定 cpm值。结果表示方
法:SI=实验组cpm值/空白对照组cpm值。
124 Westernblot检测SBM对IκBα蛋白磷酸化的
影响
  无菌取小鼠脾脏,用无血清IMDM制成单细胞悬
液1×1010个/L,取1mL单细胞悬液于24孔板中培
养12h,弃上清液,将细胞分别与ConA25mg/L、待
测试样及ConA25mg/L和待测试样的混合液共同
培养15min,收集细胞,利用 Westernblot检测 SBM
对IκBα蛋白磷酸化的影响[6]。
125 SBM对LPS诱导腹腔巨噬细胞TNFα合成的
影响
  按常规方法无菌杀鼠,制备腹腔巨噬细胞。将已
制备的腹腔巨噬细胞制成单细胞悬液1×109个/L,分
别与5mg/LLPS及5mg/LLPS和待测试样混合液
共同培养24h,收集上清液,采用 ELISA方法检测
TNFα活性。
126 大鼠棉球性肉芽肿
  大鼠50只,按体质量随机分为5组(模型组,阿
司匹林(30mg/kg)组,SBM分为5、10、20mg/kg组)。
将50mg无菌棉球,植入大鼠腋下,8d后取出棉球、
剔除脂肪组织,置烤箱内70℃烘4h,称质量,将此
质量减去棉球原来的质量,即得肉芽肿质量,并计算
每100克大鼠肉芽质量(M,mg/100g)。
127 统计学处理
  数据以 x±s表示,样本间比较采用t检验。
2 结果与分析
21 黄芩有效成分的分离、纯化
  黄芩是传统常用中药材,黄芩有效成分的提
取方法一直沿用传统的水煮酸沉法,该方法周期
较长、费时。本研究根据浸提基本原理,利用高压
作用可使蛋白等大分子变性、细胞膜通透性增高、
内容物外泻而不影响小分子的特点,通过常温超
高压的方法提取黄芩中黄酮类物质。目前,超高
压方法已广泛用于食品的高压灭菌及蔬菜的保
鲜[7],但极少用于提取中药有效成分的报道。利
用超高压方法提取黄芩有效成分,分别观察黄芩
在200、400MPa压力下持续作用10min及在200、
600MPa压力下持续作用5min提取的得率,结果
表明:黄芩在200、600MPa压力下持续作用5min
的得率最高,可达36% ~38%。电喷雾质谱检
测结果表明:超高压提取物 SBM的主要成分为黄
芩苷元(分子离子峰为 2721),其质量占总质量
的50%以上。水煮酸沉法提取物 SBZ的主要成分
07 生 物 加 工 过 程   第7卷 
为黄芩苷(分子离子峰为 4448)及黄芩苷元(分 子离子峰为2691)(图1)。
1—IMDM;2—ConA25mg/L;3—ConA25mg/L+SBM625mg/L;
4—ConA25mg/L+SBM125mg/L;5—SBM625mg/L;6—SBM125mg/L
图3 Westernblot检测SBM对ConA诱导的小鼠脾细胞IκBα蛋白磷酸化的影响
Fig.3 EfectsofSBM onConAinducedproteinphosphorylationofIκBαinmice
图1 电喷雾质谱检测SBM、SBZ组成成分
Fig.1 ESIMSdetectingthecomponentofSBM andSBZ
22 SBM、SBZ对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
  T细胞在类风湿(RA)的发病、细胞因子的产
生及病情发展中起重要作用。抑制 T细胞功能的
药物,如雷公藤提取物、免疫抑制剂 FK506均可有
效地治疗 RA[8-9]。首先对比观察 SBM、SBZ对小
鼠脾淋巴细胞增殖的影响。实验结果表明:SBM
(3125~500mg/L)、SBZ(625~500mg/L)均可
明显抑制 ConA(25mg/L)诱导的小鼠脾淋巴细
胞增殖,呈一定的剂量依赖关系,且 SBM的抑制作
用强于 SBZ(图2)。
23 SBM对IκBα蛋白磷酸化的影响
  NFκB是调节淋巴细胞功能的主要转录因子,
可通过促进至少 27种细胞因子、趋化因子、黏附
分子 基 因 表 达,调 节 炎 症 时 机 体 的 免 疫 功
能[10-11]。静止的细胞当中,NFκB与其抑制蛋白
IκB相结合,以无活性的形式存在于细胞当中。当
外界刺激作用于细胞后,可导致 IκBα磷酸化,释
放 NFκB。NFκB与靶基因的 κB启动子或增强子
结合,调节基因转录。细胞外多种刺激如炎性因
子、射线照射、细菌及病毒产物等均可活化 NFκB,
其中 IκBα苏氨酸残基磷酸化是释放NFκB的关键
图2 SBM、SBZ对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
Fig.2 EfectsofSBM,SBZonConAinduced
splenocyteproliferationinmice
步骤。本研究在证实 SBM可明显抑制 ConA诱导
的小鼠脾淋巴细胞增殖基础上,进一步观察 SBM
对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞 IκBα磷酸化的影
响。Westernblot实验结果表明:SBM625、125
mg/L均不能抑制 IκBα蛋白磷酸化(图 3)。SBM
不干扰 NFκB信号传导途径,可能通过影响其他信
号传导途径抑制淋巴细胞增殖。
24 SBM对TNFα合成的影响
  TNFα、IL1β等促炎细胞因子在RA发病过程中
17 第1期 朱 伟等:黄芩有效成分提取及对炎症反应的影响
起重要作用,TNFRp75与IgG1的FcR形成的融合蛋
白、IL1R的拮抗剂均可有效的缓解RA患者病情的
发展[12-13]。前期工作表明:SBM可抑制IL1β合成,
大鼠佐剂性关节炎及角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀[5],
本实验进一步证实SBM(3125~250mg/L)可明显抑
制LPS诱导巨噬细胞 TNFα合成(图4),TNFα的质
量浓度分别为26764、113、005和001μg/L,呈一
定的剂量依赖关系。
图4 SBM对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞
合成TNFα的影响
Fig.4 EfectsofSBM onLPSinducedTNFαproduction
inperitonealmacrophagesinmice
25 SBM对棉球性肉芽肿的影响
  大鼠棉球性肉芽肿是研究慢性炎症反应的常用
动物模型,本实验前期工作表明:SBM可抑制大鼠佐
剂性关节炎,并可抑制角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀,
为此,本研究通过大鼠棉球性肉芽肿模型进一步验证
SBM的抗炎作用效果。结果表明:SBM(5、10和20
mg/kg)均可抑制棉球性肉芽肿的形成(图5),抑制率
分别可达1928%、2213%、2614%。SBM慢性炎症
反应具有一定的抑制作用。
1—Model;2—Aspirin30mg/kg;3—SBM20mg/kg;
4—SBM10mg/kg;5—SBM5mg/kg。P<005,P<001
图5 SBM对大鼠棉球性肉芽肿的影响
Fig.5 EfectsofSBM oncotonpelet
inducedgranulomainrat
3 结 论
  常温超高压方法可有效提取黄芩中黄酮类物
质,该方法得率高(可达36%~38%)、重复性好、
节省时间。超高压提取物 SBM的主要成分为黄芩
苷元,且不含黄芩苷。SBM可明显抑制 ConA诱导
的小鼠脾淋巴细胞增殖和 LPS诱导的巨噬细胞
TNFα合成,并可抑制大鼠棉球性肉芽肿,但不影响
IκBα蛋白磷酸化。以黄芩苷元为主要成分的黄芩
甲醇提取物SBM可通过干扰免疫细胞功能,抑制炎
症介质的产生,发挥抗炎作用。黄芩苷元是黄芩主
要抗炎成分之一,其临床应用价值值得进一步深入
研究。
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21962204.
国外动态
《Nature》:DNA复制转录互相排斥干扰的分子机制
DNA的复制和转录通常在体内同时发生。在DNA链上用于进行DNA复制的DNA合成酶与用于转录
的RNA合成酶迎头碰撞会使DNA合成过程停止,但一个复制体(replisome)碰到一个在DNA模板上沿同一
方向工作的一个RNA聚合酶会发生什么情况呢?
美国洛克菲勒大学的RichardPomerantz和 MikeO’Donnel发现,复制体(一种集聚合与校对活性于一
身的多酶复合物)碰到障碍时可以灵活完成自己的任务。RNA聚合酶被从DNA中移走,但复制体和新生成
的mRNA仍然附着在其上。一个复制组装因子(betaclamp)会找到 mRNA的3′端,并与仍然结合在一起的
复制体相连,后者利用mRNA作为一个引子来重新启动DNA的合成。
日本开发出生物乙醇取代石油不消耗粮食
由静冈大学教授中崎清彦领导的研究小组,利用高效率的技术由竹子炼取生物乙醇,既不用担心和人
类竞争粮食,而且竹子成长得比木材还快,是极具魅力的生物燃料。
由竹子炼取乙醇需将纤维质主要成分的纤维素(Celulose)转变成葡萄糖(Glucose)后加以发酵,研究小
组开发出新技术,把竹子磨成50μm的超细粉末,是以往的1/10,接着利用雷射除去细胞壁内含有的高分子
木质素,再加上使用分解率高的微生物,使得纤维素的糖化效率提高至75%。
(文伟河)
37 第1期 朱 伟等:黄芩有效成分提取及对炎症反应的影响