全 文 ：第5卷第2期
2007年5月
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessFngineerj”g
Mav2007
·29．
届一甘露聚糖酶发酵液絮凝条件的
统计学筛选与响应面优化
韩 健，刘朝辉，齐 崴，何志敏
(天津大学化工学院化学工程研究所，天津300072)
摘 要：采用Plackett—Bumlall(PB)和中一心复合设计(c州ⅡHlcⅢnI) Mtt、D(矧gn)对影响地衣芽袍杆菌TJ—10I发酵生
产口一甘露聚糖酶粗发酵液絮凝操作的8个条件进行筛选优化。PB实验设计与统计学分析表明：加水量、阳离子聚
丙烯酰胺(c—P^M)和阴离子聚丙烯酰胺(A—PAM)的体积分数是影响酶活收半的3个关键因素。以酶活收率为响
应目标，对3目素进行中心复合设计，并控响应面法优化分析得到影响酶活收率的二阶模型，确定了口一甘露聚糖酶
发酵液絮凝实验的最优操作条件为：加水量体积分数24055％，cPAM体积分敷143％，^一P^Ⅵ体积分数
1697％，絮凝后发酵液的酶活收率达7042％。
关键词：肛甘露聚糖酶；絮凝；PJackect—Bunllan设计；中心复合设计；响压面；优化
中图分类号：哪】4 l 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)02一0029一()7
optimizationof henocculationconditionsof卢-m粕nanasebrothusing
statisticalscreeningandresponsesurfhcemethod
HANJian，LIuzhao—huj，QIWei，HEzhi-min
(chemicalEn酊neenl璀ResealchCe【1L代，
Tialqln0 mersi‘y
ScIlo出0fCh㈣(。dE“gi㈣“g8nd。lhhn0109y
TiarliiIl300072，chlna)
Abstract：Placketl_BI肼lan(PB)des唔naTldcellt商col”positede ign(CCD)wcj。叩pliedtoscreeni“g
a11doptillliz吨8‰torsfort11enocc山tionof口一mannanas。pmductionby舶ci盯删比^饥扣肌如TJ-101
TheaIlloullfsofwaIer，IIleconcentrationsofC·PAMandA—PAM，asthreekcyfactors，werefoundtohe
signi6canttotheyielda工ldactivi‘yof卢一mannanaseviPBdeslgnandtlle“l㈣i“gstati{；tic戤1a】ysisBy
CCDdesignandresponscsu血ceanalysis，th8quadm“cmodelforIhethrees培ni壬!icantfactorswasestah—
lishedwith声一mannanaseactivityaslhet8蜷et忙8Pollse．AItlleoptimalnocculationconditions，j．e
240．55％waler，14．13％C—PAMand16．97％A—PAM，thevieldofen2yIneactivityachievedat70．42％
Keywords：卢一MarmaIIas。；noccu】atio“；PlackeL卜BuⅡna“；centralcompositedesig“；responsesurface
meth(H10lo鼎；optimization
口一甘露聚糖酶(1，4毋一D—mannanase，Ec
3．21．78)是一类能够随机裂解卢一1，4糖苷键的、F
纤维素内切水解酶”，可通过多种产酶微牛物如芽
孢杆菌弘⋯、曲霉⋯等经发酵培养制得。随着人们
收稿日期：2006—12-14
基金项目：五津市重点科提攻关计划资助项目(05YFczcx04600)
作者简介：韩健(1982)，男，山东威海人，硕士研究生，研究方向：酶工程。
联系^：何志敏．教援，博士生导师，E—l：zhe@uu-educn
万方数据
生物加工过程
对自然界、r纤维索资源的开发和H露寡糖药用价
值的发现，口-H‘露聚糖酶已成为一种极其首要的T
-嘲晦制剂，在食品、医药、造纸、纺织、印染、石浦开
采及牛物技术等请多领域得到广泛应用”。
絮凝是牛物技术下游加T过程特别是对微生
物发酵液进行分离纯化以制备具有实用价值和竞
争力产品的熏要手段“⋯，它涉及各种絮凝剂的组
合混凝作用和絮凝操作条什的优化，以达到去除发
酵液中菌体等杂质，提高产品纯度的目的。
在实验条什优化方向，传统的单冈素实验方法
费时费力，而}=i．没有考虑网素的交互作用致使最优
值并／fi玎J靠””。nackc【卜BurⅡla【1(PB)”u_“1方法广
泛应用于微生物发酵培养基成分的优化和发酵工
艺关键参数的筛选，通过对实验进行统计学设计和
数据分析，筛选出对日标值影响最夫的关键斟素，
可大大减少优化过程考察的凼素数和实验次数，节
省大量人力、财力、物力和时问。响应面分析法
(ResponsesudaceM thodology，简称RsM)是·种优
化工艺条件的有效方法”。“o，其中的中心复合设汁
(ccD)腑用广泛，可用卜确定实验幽素及其交互作
用在工艺过程中对指标响』-t值的影响，精确地表述
因素和响应值之间的关系。与以往采用的正交设
计法不同，响应衙分析法通常是利用中心组合实验
拟合出一个完整的二次多项式模型，在实验设计与
结果挺述方f町更加优良。将PB筛选和响应『町分析
联合应用于发酵产品分离纯化工艺，特别是絮凝工
岂的优化在国内外鲜见报道。
本文将在已有上作”4。”1基础上，对近期经紫外
诱变和热诱变获得的高产菌株(地农芽孢杆菌TJ—
101)培养历所得发酵液进行絮凝上艺优化，即采用
1)B设计方法考察8个絮凝条什，通过统计学筛选得
出3个关键囚素，进一步利用ccl)设计对3个关键
因素进行响应面优化分析，最终得到最优絮凝条
件，以高效制备启一目‘露聚糖酶。
1实验部分
Ll实验材料
酶液：地农芽孢杆菌(B∽珊w址^m扣rm”)TJ-
101经66L发酵罐培养48h得口一甘露聚糖酶发酵
液；cacl，：分析纯，配制成质量分数40％的水溶液；
聚合铝(PAc)：工、『k缴；阳离子聚丙烯酰胺(c—
lHM)、阴离子聚丙烯酰胺(A—1)AM)：均酣制成质量
第5卷第2期
分数o．1％的水溶液。
1 2实验方法
1．21絮凝操作
取适量发酵液，加水稀释，调节搅拌速度，加入
助凝剂cacl，和PAc后涧节pH值，再加入絮凝剂
c—PAM和A—PAM，静置：絮凝液用纱布过滤，取滤
液；滤液经15min离心5000g(BEcKMANAll89ra川
21R)后，取上清液，称量体积。
1 2．2酶活分析
以DNs法”1测定口，甘露聚糖酶酶活。
酶活定义：以质量分数0．5％角豆胶为底物，
50℃反应lomin，每分钟释放出1阻mol还原糖所
需酶量为1个活力单位。
酶活收率定义：y=(絮凝液酶活×絮凝液体
积)／(发酵液酶活×发酵液体积)×loo％
1．3实验设计
以酶活收率作为响应目标，采用两步法进行优
化：首先利用Plackett—Buman设}卜挑选出对响应影
响较大的几个凶素；然后冉利崩响应面方法(RsM)
中的中心复合设计(ccD)进行实验，通过支验数据
拟合得到二阶响心面模型，最终确定最优文验条
什，并进行验证。
1 3．1 筛选实验设计——P1acken-Ru丌nan设计
P1ackett．BullTlan设计rrIP1ackett和mlrmanJ
1946年提Ⅲ，它建立在不完全平衡板块原理的基础
上，通过Ⅳ个实验至多可以研究(Ⅳ一1)个变量(Ⅳ
一般为4的倍数)”o。在实验过程中，通常会预留
m虚拟变量作为误差分析。每个变量有高、低两个
水平，分别以+、一标记，在整个Placken-Burrnan设
计中，每个变量取高、低水平的值各彬2次，而且在
某个因素取得高(低)水平时，其他各个因素取得
高、低水平各劬‘4次。
应用‘DesignExpen’软件(stat-EaseInc，Min—
me8polis，usA)对絮凝实验进行Hackeft—Buman设
计(表1)。对絮凝过程的8个}要冈素进行筛选：即
加水量、caCl，、聚铝(PAc)、阳离子聚丙烯酰胺(c—
1)AM)和阴离子聚丙烯酰胺(A—PAM)的体积分数，发
酵液初始pH位，絮凝时间和搅拌速度，外加3个虚拟
变量。每个变量分别确定(十)和(一)两个水平，共
进行12次实验以确定每个因素的影响因子。
实验没¨中，应用线性雨数进行因素筛选，忽
略交互作用”1，线性模型方程如式(1)。
y=凤+∑声。茸(i=l，2，⋯，妁 (1)
万方数据
2007年5月韩健等：口一甘露聚糖酶发酵液絮凝条件的统计学筛选与响应面优化 ’31
式巾：y为絮凝液的酶活收率响应值；置足考察因
素；启。是回归系数，反映了q的影响程度。每一因素
的影响由F述方程计算：
⋯2∑埘。一时。一 。
“L“。J一——万 o‘’
式中：E(z，)是所考察罔素的主要影响水平；吖。+和
吖：一为囚素i在实验中所测得的酶活收率达到最大
值和最小值时的数值；Ⅳ是实验次数。
表1 Plackett—BunTla¨设计因素水平
Taldel Ha“geofd】腑entfactors1nvestigated
wilhHarkcn—Bllrnlan
y=卢0+善卢。盖：+三三卢。，x．葺+三JB。群(3)
式中：】，代表系统响应_卢0、口。口。分别足偏移项、线性
偏移和■阶偏移系数；口。是交互效应系数；盖。足各因
素水平值。
应用DesignExper【软件，采用ccD方法，对
Pl∽ketI_Bum．蛐筛选出的3个重要因素(水加入量、
c—PAM、A—PAM)进行实验设计(表2)，『_J时同定其
他非关键因素：pH位6．o，助凝剂枭铝体积分数
O．4％，氯化钙的体积分数为O．18％，搅拌速度150
r／mjn，时I司2min。
表2中心组合设计各因素水平
’l-able2 Range0fdmrent{act0惜i岍niga【ed问hccDdes咖
注：所加试剂用景均以200“。发酵液为基准。
2 结果与讨论
1．3．2优化实验设计——中心复合设计(ccD)
由Box和wilson丌发的中心复合设计central2 1 Plackett—Buman实验设计结果与分析
compositeDesign(ccD)是一种常用的响应面设计Placken—Buman实验没计结果见表3。
方法，町以通过最少的实验来拟合响应面模型，每 采用Des培nExpert软件对表3中的酶活收率数
个因素通常设置5个水、F，一般采用二阶经验模型 据进行回归分析，得到各影响因子的偏回归系数及
对变量的响应行为进行表征。 其显著性(表4)。
表3 Plackett_Bu瑚aIl实验设计结果
T出e3 Plack吼t—Bu邢anexpe血nentdesi印andrespon⋯ahles
万方数据
32· 生物加工过程 第5卷第2期
表4偏回归系数及影响园子的显著性分析
Table4 Panialregmsslonc。枷cientsandanalyses
nfthelrslg”1“cance
以因素石．加水量为例：其偏回归系数为
O．100O、标准误差为O．032、影响水、r为E(z，)=
o．210，表明因素置对酶活收率的影响为正效应，即
随着加水量的增加，酶活收率呈增加趋势，因此在
后继冈素优化试验中应该提高肖．值；因素j。的平方
和闩分值(cont曲utionofss)ss％=20890％，较之斟
素砭、x，、■、x，、x。、墨、x。。、x，。的相应值明显增高，
冈此显著性分析结果为重要(s培nim州)。由表4
可明显看出因素丑，(力¨水量)、工，(c—PAM体积分
数)、疋(A—PAM体积分数)为主要影响因子，其影
响值分别为20．890％、35．040％和28．130％，而3
个虚拟因素x，、x，。利盖。．对响应值酶活收率的低值
影响(2．710％、2．060％和O．084％)表明了该线性
模型的适用性。经影响因素筛选，得到以酶活收率
为响应值的线性回归方程
y=0．44+O．10且一O．14B—O．12Cf4、
式中：一=(xl一200)／50；日=(恐一16)／2；c=(瓦
一16)／2。
方差分析模型的Prob(P)>F值为o．0015，表
明所得回归方程达到极显著，即该模型在被研究的
整个同归区域拟合很好；复相关系数砰=o8406，
说明相关性较好；校『F决定系数Adj群=o．7809，表
明78．09％的实验数据的变异性町用此阿归模型束
解释；通常情况下变化系数(c，)越低，实验的可信
度和精确度越高，c，值等于25．74％，表示PB实验
的可倩度和精确度较好；精密度(Adeqprecisjon)是
有效信号与噪声的比值，大于4．O视为合理，本实验
精密度达到11．190(表5)。
表5酶活收率回归模型方程的方差分析
TaI，le5 Analvs⋯矗vanan(-cR)rthre耵℃ssl㈣odPl
8quation0renzy眦㈨tivJ【yyleld
2．2 ccD优化设计结果与响应面分析
通过对加水量、c—PAM、A—PAM进行中心组合
设计(表6)，得到相应的二次方程模型
r=1．14462+O．】42984+00642曰一O028978C一
1 19319×10—34疗+407507x10—4dC+8．9235×
10—3BC一3．39654×10—6A2+505946×10一4丹2+
1 7301×10—3C2 f5)
式中：y足响应值，即絮凝后口一甘露聚糖酶的酶活收
牢；A，B，c分别表示力“入水量、A—PAM和c—PAM体
积分数值。
表6中心组合设计及结果
T出e6 CCDdeslgnandre8ponsevalue8
响应面分析中对实验结果进行拟和的二次模
型方差分析见表7。，值为4．93，多元相关系数为
矗2=0．816O，说明模型对实际情况拟合较好；
万方数据
2007年5月韩健等：芦一甘露聚糖酶发酵液絮凝条件的统计学筛选与响应面优化 ．33
Prob(P)>F值为0．0101(‘Prob(P)>F’<0．05
视为模型姥著)，表明该模型高度显著，可用来进行
响应值预测。
表7 rg,g,组台设计二次模型方差分析
Tat{Ic7 AnalyseofYallancefortheregressior[quadra6c
rondelquationotCCDdesign
二次模型中回归系数的挂著性检验(表8)表
明：凶索B对絮凝效果的线性效应显著，而凶素4
和C不显著；因素A2、B2、c2对絮凝效果的曲面效应
不显著；AB对絮凝效果的交互影响显著，而Ac和
BC不显著。
表8二次模型回归方程系数显著性检验
Table8 Cocftlcientestimatesb)the
regressionquadraticmodel
图l、图2和图3是由多元同归方程式5所做的
响应曲嘶图及其等高线劁。m此可对任阿两』习素
交互影响絮凝后的酶活收率进行分析与评价．以确
定最佳冈素水甲范旧。
图l显不rA—PAM体积分数在最佳值为
16．97％条件下，水的加人量和C-PAM体积分数对
酶活收率的交互影响。当C-PAM处于低水平条件
时(14mL)，随着加水量的增加，响应酶话收率出现
卜升趋势，而在C—PAM处于高水平条件下(18
inL)，随着加水量的增加，响应酶活收率反而出现降
低。这说明C-PAM。』水之问存在显著的交互影响，
4i同比例的C-PAM与水组合，将出现不同的响应值
变化趋势。由于聚丙烯酰胺的成本比水高得多，凶
此确定C-PAM为低水平，加水量为高水平nJ达到较
高的酶活收率值。
图2显不J’C-PAM体积分数处于最伟值
(14，13％)时，由ji水量和A-PAN体积分数对絮凝效
果的交百影响。从i维冈中可以看出，两个冈素的
交互影响并不显著。当加水量4处于高水平时，nJ
以状得很高的酶活收牢，且随着A-PAM体积分数的
增大，酶活收率略有增加，但刁；明显，因此确定A—
PAM体积分数应为较高水平。
图3显示_『加水量体秋分数为最佳值
(240．55％)时，C—PAM和A-PAM对絮凝效果的交
可=影响。从吲3中明显看出，在实骑水平范幽内，当
C-PAM体积分数处_卜低水平时nJ获得较高的酶活
收率，而此时随A-PAM体秽{分数的增加，酶活收率
略有下降，因此A-PAM体秽【分数应为较低水、k
由设计软件得到30组(未列出)优化条件，确
定最优絮凝工艺为：关键因素加水量体积分数
240．55％，C-PAM体积分数14．13％，A．PAM体积
分数为16，97％，理论}卜箅酶活收率达到72．93％，
2．3验证实验
按照优化后的絮凝条件：加水量的体秘分数为
240．55％．C—PAM体积分数14l3％，A—PAM体积
分数16．97％，发酵液初始pH值60，助凝剂聚铝体
积分数0．4％，CaCl：体积分数018％，搅拌速度
150r／min，时间2min，进行了粗发酵液絮凝验证实
验，实测酶活收率达到7042％，与预测位7293％
较接近，预测精度达96．56％，证明了对口一甘露聚糖
酶发酵液进行絮凝处理时PB和CCD力‘法联用的可
行7降和准确性，而该套统计学实验设计与筛选优化
方法刘于其他生物加工过程亦具有．定的参考
价值。
3结论
将PB筛选和RSM分析牛曰结合成功地应用于
卢一H。露聚糖酶发酵液絮凝纯化工艺的优化，研究
证胡：
(1)PB方法可从影响发酵液絮凝上艺的众多
操作条件中高效地筛选出关键凶素；
(2)CCD设计和RSM分析，可实现关键因素的
合理优化，在最佳条件下，粗发酵液絮凝提纯后的
酶活收率达到70．42％，接近理论预测值72．93％。
万方数据
生物加工过程 第5卷第2期
图l 加水量和CPAM对酶活收率交互影响的三维曲面图和等高线图
Fig1 Surfbeeandcontourplotsofnmtual—il】tluenceforwaterandC-PAMoiltheyieldofenzymeactivity
图2 加水量和A．PAM对酶活收奉交互影响的三维曲面图和等高线图
Fig2 Surtacendcontourplotsofmutual-influenceforwaterandA—PAMontheyieldofenzymeucLivity
图3 C-PAM和A—PAⅥ对酶活收率交互影响的三维曲面图和等高线图
hlig3 Surfacendcontourplots_mutual—influenceforA-PAMandC-PAMOlltheyieldotenzymeactivity
万方数据
2007年5月豸健等：口一甘露聚糖酶发酵液絮凝条件的统计学筛选与响应面优化 ·35
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Lctt20024161】．】6l3
国内简讯
琼将建年产10万t生物柴油基地
联合国丌发计划署中同少数民族地区绿色能源减贫项目办公室等有关专家一行专程来琼，对海南麻风
树项目进行实地考察。专家组认为海南发展麻风树生物能源具有得天独厚的气候和资源条件。
麻肛l树规模化种植及生物柴油产业化是困家大力支持的呵再生能源项目。海南中海新能源产业开发
有限公司已率先在I临高县障厚镇种植麻风树种苗，是目前海南省规模最人的麻风树种植基地。在“十一五”
期间，建立年产10万t生物柴油及其副产品的深加工企、忆形成林油一体化以新能源为主、综合发展的产、『k
格局。
(张春鹏)
O，；4
5
6
7
万方数据