全 文 :第 12卷第 5期
2014年 9月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol 12 No 5
Sep 2014
doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2014 05 012
收稿日期:2013-10-10
基金项目:留学回国人员科研启动基金(K308021301);西北农林科技大学科研启动经费(2010BSJJ016)
作者简介:李春梅(1985—),女,江苏南通人,科研助理教授,研究方向:植物药理,食品科学;郭 佳(联系人),讲师,E⁃mail: berylgj8353@
nwsuaf edu cn
绿杨春绿茶的抗氧化作用
李春梅1,高 山2,郭 佳3
( 1 檀国大学 食品科学与营养系,韩国 龙仁 448701; 2.扬州绿杨春茶社有限公司,扬州 225001;
3.西北农林科技大学 园艺学院 旱区作物逆境生物学国家重点实验室,杨凌 712100)
摘 要:对绿杨春茶社的绿茶进行了体外抗氧化研究,结果表明:绿茶含有很高的酚(单宁酸,576 mg / g)和类黄酮
(儿茶酚,108 77 mg / g),具有很强的自由基清除能力,其对 DPPH·和超氧分子清除能力为 IC50值 8 79 和 62 86
μg / mL;还原能力和总抗氧化能力也很显著,总抗氧化能力超过了正对照 BHT; 绿茶能很好地保护由自由基所引起
的蛋白损伤,并且抑制酪氨酸酶的活性,其酪氨酸酶抑制作用可以和天然氧化物维生素 C 相抗衡。 该结果表明了
绿杨春茶社的绿茶是一个很好的抗氧化剂,并且对美白具有一定的作用。
关键词:绿茶;自由基;抗氧化作用
中图分类号:Q819 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2014)05-0069-05
Antioxidant activity of Lüyangchun green tea
LI Chunmei1,GAO Shan2,GUO Jia3
(1 Department of Food Science and Nutrition,Dankook University,Yonginsi 448701,South Korea;
2 Lüyangchun Tea Shop in Yangzhou,Yangzhou 225001,China;3 State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,
College of Horticulture,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100,China)
Abstract:The antioxidant activity of green tea from Lüyangchun Tea Shop was investigated by several in
vitro antioxidant properties,including total phenolic and flavonoid contents,DPPH free radical scavenging
activity,superoxide scavenging activity,reducing power activity,total antioxidant activity,and protective
effects on protein damages. Results showed that,the green tea contained high contents phenolic (tannin,
576 mg / g) and flavonoids(catechin,108 77 mg / g),and significant free radical scevenging activity,the
IC50 value of the DPPH and superoxide free radical scevenging activity were 8 79 and 62 86 μg / mL,
respectively. The green tea also showed high reducing power activity, protective effect on damaged
protein,and total antioxidant activity. The total antioxidant activity was higher than BHT. Furthermore,the
green tea demonstrated significant α⁃tyrosinase inhibitory effect All the results implicated that the green
tea has the potential for use as a source of natural antioxidants in the food and cosmetic industries.
Key words:green tea;free radical;antioxidant activity
氧化性损伤是引起众多疾病的元首,包括心血
管疾病、糖尿病、关节炎、癌症、帕金森病和阿尔茨
海默病等[1];而自由基是引起氧化损伤的关键,它
们是一组含有不饱和电子对的分子或原子,具有很
强的氧化性。 作为人体的代谢产物,自由基会不断
攻击细胞,造成脂质、RNA、DNA 和蛋白等的损伤,
损伤积累易导致人体疾病和衰老[2]。 而自由基的
产生与压力、环境污染和辐射等有关联。
抗氧化物在维持人体健康中起到很大的作
用[3-4]:可以结合自由基,使其失去攻击能力,从而
降低由自由基所带来的损伤和疾病。 大自然中有
很多天然抗氧化植物,其富含的维生素 C、维生素
E、胡萝卜素和酚等抗氧化物质都具有很好的抗氧
化功能[5]。
中国的饮茶历史可以追溯到上千年前,其中绿
茶是中国的主要茶类之一。 绿茶对人体有诸多有
益的功效,比如降血脂、抗肿瘤和预防心血管疾病
等。 近年来,绿茶的有益功效被认证为和绿茶的抗
氧化性有关。 绿茶中的茶多酚和维生素等可以有
效阻止自由基[6],因此,绿茶也被应用于化妆品行
业。 目前针对绿茶抗氧化的研究很多,主要集中为
对龙井、毛尖等茶的研究[7]。 实验方法集中于
DPPH·等自由基清除能力的测定和茶多酚等抗氧
化物质的鉴定[8-9]。
在本实验中,笔者对江苏扬州百年老店“绿杨
春”的一等品绿茶进行了相对全面的体外抗氧化实
验,包括总酚和总类黄酮含量、DPPH·和超氧分子
清除能力、还原能力、总抗氧化能力以及对由自由
基引起的蛋白损伤的保护作用的测定。 通过实验
结果的比较探索,以期发现 “绿杨春”绿茶的抗氧化
机制以及开发利用的价值。
1 材料和方法
1 1 材料
绿茶由江苏省扬州市绿杨春茶社有限公司提
供,为绿茶一级品。 20 g 茶叶浸泡在 80 ℃、1 L 热
水里 30 min。 提炼 2次后的提取液过滤合并后用真
空旋转蒸发器干燥,得到 6 44 g 粉末状水提取物。
提取物储存在-20 ℃冰箱中备用。
1 2 总酚和总类黄酮含量的测定
总酚含量的鉴定以单宁酸为标准。 1 mg / mL提
取物 0 1 mL 和反应剂 0 9 mL:10 倍稀释的 Folin⁃
Ciocalteu 和质量分数为 7 5% Na2CO3,混合后在室
温下反应 30 min。
总类黄酮含量的测定以儿茶酸为标准。 1
mg / mL提取物 0 25 mL、H2O 1 25 mL 以及质量分
数为 5% NaNO2 75 μL混合后反应 6 min,再加入质
量分数为 10% AlCl3溶剂 150 μL后反应 6 min,加入
1 mol / L NaOH 0 5 mL 和 H2O 0 275 mL,在总反应
溶液达到 5 mL后于 510 nm下测吸光度。
1 3 DPPH·清除能力和超氧分子清除能力的测定
0 1 mmol / L 1, 1⁃diphenyl⁃2⁃pic⁃rylhydrazyl
(DPPH)溶液 50 μL和各种浓度的绿茶提取物溶液
充分混合后在避光条件下反应 30 min,再于 515 nm
下测定其吸光值,DPPH·清除能力由式(1)计算。
DPPH 自由基清除能力 = [ A空白对照 - ( A试样 -
A背景)] / A空白对照×100% (1)
50 μL各质量浓度的绿茶提取物和 1 mL 含有
0 1 mmol / L 乙二胺四乙酸(EDTA)、 50 μmol / L 硝
基四氮唑蓝 ( NBT)、 78 μmol / L 还原型辅酶Ⅰ
(NADH) 和 3 3 μmol / L 吩嗪硫酸甲酯( PMS)的
0 1 mol / L缓冲液( pH 7 4)混合。 混合溶液在 25
℃下反应 8 min 后于 560 nm 下测定吸光值。 超氧
化物的清除能力由式(2)计算。
超氧化物清除能力 = [A′空白对照-(A′样品-A′背景)] /
A′空白对照×100% (2)
1 4 还原能力的测定
各质量浓度的 1 mL 绿茶提取物,0 2 mmol / L、
pH 6 6缓冲液 2 5 mL 和质量分数为 1%铁氰化钾
(C6FeK3N6)1 mL 混合,混合溶液在 50 ℃下反应 2
min,再加入质量分数为 10%三氯乙酸(TCA)溶液 1
mL后在 3 000 r / min 下离心 10 min。 取上清 1 mL
与 1 mL H2O 和质量分数为 0 1%的 FeCl3 0 2 mL
混合后于 700 nm下测吸光值。
1 5 总抗氧化能力的测定
0 2 mL 质量浓度为 6 25 ~ 100 μg / mL 的绿茶
提取物,0 6 mL 包括 0 6 mol / L H2 SO4、28 mmol / L
Na3PO4和 4 mmol / L 钼酸铵(H8MoN2O4)的混合反
应试剂,充分混合后在 95 ℃下反应 90 min,在 695
nm下测吸光值。 以 2,6 二叔丁基对甲酚(BHT)为
正对照,吸光值读数和总抗氧化能力成正比。
1 6 对自由基引起的蛋白损伤的保护作用的测定
本实验过程中用的蛋白为牛血清蛋白(BSA)。
4 μg / mL BSA 200 μL和 200 μL H2O或者各种浓度
的绿茶提取物混合后,与 600 μL 的包括 50 μmol / L
FeCl3、1 mmol / L H2O2和 100 μmol / L 抗坏血酸维生
素 C(Vitamin C)的反应试剂在 37 ℃下反应 3 h。 以
不加任何试剂的 BSA作为参照,以五倍子酸保护的
损伤蛋白作为正对照。 反应后的蛋白在 95 ℃下高
温变性处理 10 min。 处理后的蛋白用 12 5%(质量
07 生 物 加 工 过 程 第 12卷
分数)SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。 2 h
后,胶用 R 250 染色 12 h再清洗 24 h。
1 7 酪氨酸酶抑制作用的测定
绿茶提取物 40 μL、125 U / L酪氨酸酶 40 μL和
67 nmol / L PBS缓冲液(pH 6 8) 80 μL 在 37 ℃下
预处理 5 min,加入 25 nmol / L反应底物 L 3,4 二
羟基苯丙氨(L DOPA)40 μL。 反应后的酪氨酸酶
活性的鉴定由 492 nm下的吸光值计算获得,抑制率
由式(3)计算。
酪氨酸酶的抑制率 = [A″空白对照 -(A″样品 -A″背景)] /
A″空白对照×100% (3)
1 8 统计分析
所有实验的结果都是 3次重复实验的结果取平
均值。
2 结果与讨论
2 1 绿杨春绿茶中总酚和总类黄酮含量
Ardestani等[10]证实了酚类、黄酮类物质具有很
高的自由基清除能力和抗氧化能力。 因此,对总酚
和类黄酮含量的测定是抗氧化实验中的 1种基本手
段。 另外,还有很多研究指出,酚类和黄酮类物质
的存在和很多其他生理活性包括抗炎、抗癌和抗心
血管疾病等有关系[11-12]。
绿茶中重要的抗氧化物质是茶多酚。 在本实
验中,总酚和类黄酮类物质的含量分别由单宁酸和
儿茶酸等量表达。 绿杨春绿茶中总酚的含量可达
到(576±0 87)mg / g,类黄酮的含量达到(108 77±
2 66) mg / g。 其含量明显高于信阳毛尖、黄山毛峰
和营州芽峰的乙醇提取物的总酚和总黄酮含量[8],
该结果预示着绿杨春绿茶将有很好的抗氧化作用。
2 2 绿杨春绿茶的自由基清除能力
以 DPPH·和超氧分子作为自由基代表,用来检
测绿杨春绿茶的抗氧化能力,结果如图 1 所示。 由
图 1可知:绿杨春绿茶的自由基清除能力十分明显,
20 μg / mL的提取物能清除几乎 90%的 DPPH·。维
生素 E 作为自然抗氧化剂被证实具有很强的
DPPH·自由基清除能力。与作为正对照的维生素 E
(IC50 值为 12 59 μg / mL) 相比,绿杨春绿茶的
DPPH·清除能力( IC50值为 8 79 μg / mL)仍然略高
一筹[13]。 由此可见,绿杨春绿茶的自由基清除能力
非常显著。
超氧分子在人体代谢氧平衡中起很大的作用,
但是过多的代谢产物堆积会对人体有害[14]。 在本
图 1 绿杨春绿茶的 DPPH·清除能力
Fig 1 DPPH·scavenging activity of
Lüyangchun green tea
研究中,把 NADH PM反应体系作为超氧分子的来
源鉴定绿杨春绿茶提取物的抗自由基能力。 被用
作正对照的五倍子酸也是自然界常见的抗氧化物,
对超氧分子具有很好的清除能力。 但是本研究中
的绿茶提取物却表现出了更高的超氧分子清除能
力(图 2)。 由图 2 可知:100 μg / mL 提取物的清除
能力比相同质量浓度的五倍子酸高出近 20%; IC50
值也低于五倍子酸,提取物和正对照的 IC50值分别
为 62 86 和 96 37 μg / mL。 综上所述,绿杨春绿茶
提取物表现出的超强的自由基清除能力和其中所
含很高的酚类和类黄酮类物质有关。
图 2 绿杨春绿茶的超氧分子清除能力
Fig 2 Superoxide radical scavenging activity of
Lüyangchun green tea
2 3 绿杨春绿茶的还原能力
还原能力被证实和抗氧化之间有密切的关
系[15]。 在本实验中,检测绿杨春绿茶的还原能力是
通过检测 Fe3+到 Fe2+的变化程度,还原能力的表达
由 700 nm下的吸光值表示,绿杨春绿茶提取物的还
原能力见图 3。 由图 3可知:维生素 E 作为正对照,
在 125 μg / mL时能彻底还原所有的 Fe3+,在之后的
高质量浓度的处理中,700 nm下的吸光值一直趋于
平衡。 绿杨春绿茶提取物的还原能力比正对照维
17 第 5期 李春梅等:绿杨春绿茶的抗氧化作用
生素 E 稍低,但是其还原能力仍是很显著的。 一些
物质的抗氧化性在某种程度上是由于它的还原性,
因此,绿杨春绿茶的还原性表明了绿茶的抗氧化性
的存在。
图 3 绿杨春绿茶的还原能力
Fig 3 Reducing power activity of Lüyangchun green tea
2 4 绿杨春绿茶的总抗氧化能力
钼蓝法是灵敏的检测提取物总抗氧化能力的
方法,有很明显的颜色变化,在检测过程中会呈现
蓝色,和抗氧化性呼应[16],因此选择该法测定绿杨
春绿茶提取物的总抗氧化能力。 绿杨春绿茶的总
抗氧化能力见图 4。 由图 4 可知:与正对照 BHT 相
比,绿茶提取物的总抗氧化能力比 BHT 略高一点
点。 但作为粗提取物,绿杨春绿茶总抗氧化性已经
很显著,这应该与酚类、类黄酮类、类胡萝卜素等自
然抗氧化物质有关。 也有报道指出,酚类是抗氧化
活性的重要指示剂[10]。 因此,绿杨春绿茶明显的抗
氧化活性应该与其较高的酚类和类黄酮含量有密
切的联系。
图 4 绿杨春绿茶的总抗氧化能力
Fig 4 Total antioxidant activity of Lüyangchun green tea
2 5 绿杨春绿茶对蛋白损伤的保护作用
在代谢过程中,蛋白质也是过量自由基攻击的对
象,这样的破坏会导致细胞的功能下降,最终导致人
体的衰老[2]。 因此,检测物质对自由基引起的蛋白损
伤的保护作用也是一项重要的抗氧化检测。 运用
SDS PAGE检测蛋白的相对含量,结果见图 5。
图 5 绿杨春绿茶对有自由基引起的蛋白损伤的保护作用
Fig 5 SDS PAGE profile of BSA protein treated
with Fe3+ / ascorbate / H2O2 system in
presence of green tea
由图 5 可知:经自由基处理的蛋白含量明显下
降,经不同质量浓度的绿茶提取物处理后的蛋白含
量明显升高,并且在高浓度时,蛋白条带的颜色显
示高于空白组的蛋白含量。 由此推测,绿茶提取物
不但可以保护由“Fe3+ / ddH2O / VC”体系产生的自由
基损伤,并且能保护蛋白免遭空气中一些自由基的
损伤。
综上所述,绿杨春绿茶具有极好的抗氧化作
用。 除了饮食,还可以考虑将其运用到化妆品行
业,通过在皮肤表层的涂抹来阻止大气中的自由基
对皮肤的损伤。
2 6 绿杨春绿茶对酪氨酸酶的抑制作用
自由基损伤皮肤会引起皱纹、斑点、衰老等,其
间黑色素会越积累越多,而黑色素的形成过程中酪
氨酸酶起了很重要的作用[17-18],它能控制黑色素细
胞的活性,影响黑色素形成的速率。 黑色素是美白
的天敌,因此在检测物质有没有美白作用时,最重
要的是检测对酪氨酸酶是否有抑制作用,绿杨春绿
茶对酪氨酸酶的抑制作用见图 6。
图 6 绿杨春绿茶对酪氨酸酶的抑制作用
Fig 6 α⁃tyrosinase inhibitory activity of
Lüyangchun tea
27 生 物 加 工 过 程 第 12卷
由图 6可知:在酪氨酸酶的抑制能力比较中,绿
杨春绿茶的抑制作用略低于维生素 C,它们的 IC50
值分别为 559 52和 285 84 μg / mL。 但是在质量浓
度低于 200 μg / mL时,绿杨春绿茶提取物的酪氨酸
酶抑制作用可以和天然氧化物维生素 C 相抗衡。
这说明,绿杨春绿茶也具有很强的美白作用。 利用
纯天然物质对肌肤进行美白和保护在化妆品行业
已有很多先例,结合绿杨春绿茶的超强抗氧化能
力,适当浓度的绿杨春绿茶也可以考虑用于化妆品
的开发利用。
3 结 论
绿杨春绿茶具有很高的抗氧化能力。 表现在
其含有很高的抗氧化物质(酚和类黄酮),对 DPPH·
和超氧分子等自由基有很强的清除能力、还原能力
和高于 BHT的总抗氧化能力,可以很好地保护被自
由基损伤的蛋白等,并且能抑制黑色素形成的关键
酶(酪氨酸酶)的活性。 由此推测,绿杨春绿茶在食
品保健及化妆品开发应用中具有很好的前景,相关
的动物实验和深入的机制研究也正在进行中。
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(责任编辑 周晓薇)
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