免费文献传递   相关文献

Optimization of liquid-fermentation conditions of Monascus polysaccharide

红曲多糖液态发酵工艺条件的优化



全 文 :第7卷第2期
2009年3月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.2
Mar.2009
收稿日期:2008-06-17
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划资助项目(2006BAD27B093)
作者简介:李霞姣(1984—),女,湖南衡山人,硕士研究生,研究方向:发酵工学;许赣荣(联系人),教授,Email:grxu123@126.com
红曲多糖液态发酵工艺条件的优化
李霞姣,夏永军,王铁军,许赣荣
(江南大学 生物工程学院,无锡 214122)
摘 要:实验研究红曲多糖的液态发酵条件,得出优化后红曲菌 ZKOA发酵工艺条件:蔗糖40g/L,酵母粉 45
g/L,KH2PO4·3H2O35g/L,MgSO404g/L,植物油2mL/L,接种量8%,种龄30h,发酵液起始 pH50,发酵时间
90h,在此条件下,摇瓶和中试发酵罐中的粗多糖质量浓度分别为76g/L和734g/L。
关键词:发酵;液态;红曲;优化;多糖
中图分类号:TQ920.6;O539    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2009)02-0013-05
OptimizationofliquidfermentationconditionsofMonascuspolysaccharide
LIXiajiao,XIAYongjun,WANGTiejun,XUGanrong
(SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:TheliquidfermentationofMonascuspolysaccharidebyMonascussp.ZKOAwasinvestigated.
Thefermentationconditionswereoptimizedasfolows:sucrose40g/L,yeastextract45g/L,KH2PO4·
3H2O35g/L,MgSO404g/L,vegetableoil2mL/L,seedcultureage30h,inoculationvolume8%,ini
tialpHoffermentationmedium50,andfermentationlastedfor90h.Undertheseconditions,theyield
ofMonascuspolysaccharidesreached76g/Land734g/Linshakingflaskand20Lfermenter,respec
tively.
Keywords:fermentation;liquid;Monascus;optimization;polysaccharide
  多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而
成的天然高分子多聚物,它们常是细胞表面信号识
别、抗原抗体反应、细胞间信息传递和感受的关键
因子[1],具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等
药理作用[2]。田军等[3]报道了红曲发酵液中存在
着红曲多糖。张建峰[4]对红曲多糖的免疫活性进
行了探索,结果表明红曲多糖同其他的真菌多糖一
样具有提高免疫力、保肝解毒等作用。
  红曲多糖可通过液态深层发酵而实现工业化
生产,但目前国内对红曲多糖的发酵生产工艺研究
较少,尚处于探索阶段。本文利用已筛选出的1株
高产红曲多糖菌种,对其摇瓶发酵工艺进行研究,
并进行发酵罐中试放大实验,以期为红曲多糖的生
产提供一定的基础。
1 材料与方法
1.1 菌种和培养基
111 菌种
  实验室保藏的8株红曲菌编号分别为Monascus
sp.ZKOA、Monascussp.JJLY 4A、Monascussp.ZH6、
Monascussp.34834、Monascussp.ZK 1、Monascus
sp.5а、Monascussp.sjs30、Monascussp.sjs 34。
112 培养基
  斜面培养基(PDA):马铃薯200g(加水煮沸
30min,过滤取上清液),葡萄糖20g,琼脂20g,定容
到1000mL,pH自然。
  种子培养基:葡萄糖40g,大豆水解液120mL,
NaNO325g,KH2PO4·3H2O20g,MgSO410g,玉
米浆15mL,加水定容到1000mL。
  大豆水解液的制作:黄豆100g,浸泡24h,打成
豆浆,取浆液,定容到1000mL,加入1g中性蛋白
酶,37℃水解4h,冰箱保存备用。
  摇瓶发酵培养基:葡萄糖 60g,NaNO325g,
KH2PO4·3H2O25g,MgSO4025g,水1000mL,
pH56。
1.2 发酵方法
  1)孢子悬浮液的制备 取斜面菌种1支,挑取
适量菌层面加入到装有玻璃珠的无菌水中,充分振
荡30min,镜检孢子密度为295×106 个/mL。
  2)种子液的培养 取孢子悬浮液5mL,接种
到种子培养基中,500mL瓶中装100mL发酵液,置
于 32℃往复式摇床中,130r/min培养24h。
  3)菌种筛选发酵培养 将种子液接入到基础
发酵培养基中,接种量为 8%,500mL瓶中装 100
mL发酵液,180r/min,33℃培养96h。
1.3 检测方法
  1)胞外粗多糖的测定采用质量法[5]。
  2)菌体量的测定采用干质量法[5]。
  3)色素测定及含量计算[6]。
  取发酵液5mL过滤,70%乙醇定容到50mL,
60℃恒温水浴2h,每30min混匀一次,以70%乙
醇做空白,测A505。
  色素产量=A505×稀释倍数 (U/mL)
2 结果与分析
2.1 红曲多糖高产菌株的筛选
  红曲菌具有产生色素的能力,大量的红曲色素
会对红曲多糖的提取纯化造成困难,因此本文以低
产色素和高产红曲多糖作为考察指标,筛选适合红
曲多糖生产菌株。按12中的培养方法,对8株红
曲菌进行筛选,实验结果见图1。
  由图1可见,在摇瓶发酵条件下,8株红曲菌都
能产生红曲多糖和色素,其中红曲菌ZKOA的多糖产
量最高,达到44g/L,且色素产量低,只有25U/mL,
因此选定红曲菌ZKOA为进一步实验的菌株。
1—ZKOA;2—JJLY 4A;3—ZH6;4—SP34834
5—ZK 1;6—5а;7—sjs 30;8—sjs 34
图1 8株红曲菌的粗多糖和色素产量
Fig.1 Crudepolysaccharideandtheredpigment
yeildof8strainsofMonascusspp
2.2 C源对红曲多糖产量的影响
  红曲菌能够利用单糖、双糖、多糖等多种C源进
行生长代谢。选用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精和甘油
为C源进行实验(C源质量浓度设定为60g/L),实验
结果见图2。由图2可知,以蔗糖为 C源时,红曲菌
ZKOA粗多糖的产量最高,达到47g/L,同时蔗糖来
源广泛,且价格便宜,可作为较理想的生产用C源。
1—葡萄糖;2—麦芽糖;3—糊精;4—蔗糖;5—甘油
图2 C源种类对粗多糖产量的影响
Fig.2 Efectsofcarbonsourcesonthecrude
polysaccharideyeild
  C源质量浓度对产物的产量也有较大的影响,
设定蔗糖质量浓度30、35、40、45、50、55和60g/L7
个水平,考察不同C源质量浓度对红曲多糖产量的
影响,分批发酵实验结果见图3。
  由图3可知,蔗糖质量浓度的不同对红曲多糖
产量有较大影响,蔗糖质量浓度低于45g/L时,红
曲粗多糖产量随蔗糖质量浓度的增加而增加,最高
可达50g/L,而蔗糖质量浓度高于45g/L时,不利
于红曲多糖菌的生产。
41 生 物 加 工 过 程   第7卷 
图3 蔗糖质量浓度对红曲粗多糖产量的影响
Fig.3 Efectsoftheconcentrationofsucrose
onthecrudepolysaccharideyield
2.3 N源对红曲多糖产量的影响
  N源是影响红曲菌生长代谢的一个重要因素。考
察蛋白胨、酵母粉、NaNO3、(NH4)2SO4和NH4Cl(质量
浓度为25g/L)对红曲多糖产量的影响,结果见图4。
由图4可知,在上述5种N源中,酵母粉最利于红曲多
糖的生产。因为合适的N源浓度既可保证菌体的生长
代谢,又可避免菌体量过大或过小从而影响多糖的合
成,因此有必要考察不同N源质量浓度对红曲多糖产
量的影响,实验结果见图5。
1—蛋白胨;2—NaNO3;3—酵母粉;4—(NH4)2SO4;5—NH4Cl
图4 N源种类对粗多糖产量的影响
Fig.4 Efectsofnitrogensourcesonthecrude
polysaccharideyeild
  由图5可知,随酵母粉质量浓度的增加,红曲多
糖产量逐步上升,当酵母粉质量浓度为40g/L时红
曲多糖产量达最高为58g/L。当酵母粉浓度继续增
高,利于菌体的生长但多糖产量却下降。因此以下实
验选用40g/L的酵母粉为分批发酵时的最佳N源
质量浓度。
2.4 碳氮摩尔比对红曲多糖产量的影响
  碳氮摩尔比对微生物的生长和产物形成常有
很大的影响,碳氮摩尔比不当会妨碍菌丝对营养物
图5 酵母粉质量浓度对粗多糖产量的影响
Fig.5 Efectsoftheconcentrationofnitrogensources
onthecrudepolysaccharideyield
质的吸收,如果碳氮摩尔比偏小,会导致菌体生长
旺盛,造成菌体提前衰老自溶;如果碳氮摩尔比偏
大,菌体则会生长缓慢,产率下降[7],不同的真菌对
C、N要求是不同的。本实验在原有碳氮摩尔比基
础上研究碳氮的摩尔比例关系对红曲多糖发酵的
影响。
  培养基中蔗糖质量浓度为45g/L,含 C浓度为
158mol/L;酵母粉为 4g/L(w(N)=10%),含 N
浓度为 00286mol/L,则每升培养基中 n(C)∶
n(N)为55∶1,以此为基础设定每升培养基中n(C)∶
n(N)分别为35∶1、445∶1和716∶1,以考察不同碳
氮摩尔比对红曲多糖产量的影响,结果见表1。
表1 n(C)∶n(N)对粗多糖产量的影响
Table1 Efectsofratioofn(C)∶n(N)onthecrude
polysaccharideyeild
ρ(C源)/
(g·L-1)
ρ(N源)/
(g·L-1)
n(C)∶n(N) ρ
(粗多糖)/
(g·L-1)
35 50 350∶1 420
40 45 445∶1 605
45 40 550∶1 565
50 35 716∶1 400
  由表1可知,n(C)∶n(N)为445∶1时,红曲多
糖的产量达最高为605g/L。
2.5 矿质元素对红曲多糖产量的影响
  菌体在生长代谢时需一定量的矿质元素。其
中P、S、K、Mg4种矿质元素必须通过外界添加才可
达到菌体生长所需浓度,对于这几种元素来源,首
选KH2PO4·3H2O和MgSO4,它可以同时提供这4种
元素[8]。因此有必要通过实验确定 KH2PO4·3H2O
和MgSO4的最适添加量,实验结果见图6。
51 第2期 李霞姣等:红曲多糖液态发酵工艺条件的优化
图6 KH2PO4·3H2O(a)和MgSO4(b)对多糖产量的影响
Fig.6 EfectsofconcentrationsofKH2PO4·3H2Oand
MgSO4onthecrudepolysaccharideyeild
  由图6可知,当KH2PO4·3H2O和MgSO4的质量
浓度分别为35g/L(图6(a))和04g/L(图6(b))
时,红曲粗多糖产量达到最高达65g/L。
2.6 种龄对红曲多糖产量的影响
  种子的活力对发酵是很重要的,过幼或过老的种
子活力都不强,在发酵培养基中的延滞期较长,且种
子在达到最大生产活力之前需消耗一部分的营养物
质,不利于产物的合成,通过实验研究,结果见表2。
由表2可知,以30h时的种子液接种,发酵培养时间
在96h时,红曲粗多糖的质量浓度最高达到
705g/L,确定30h时的种子为最适接种时期。
表2 种龄对粗多糖产量的影响
Table2 Efectsofseedagesonthecrudepolysaccharide
yeild
种龄/h ρ
(种子液菌体)/
(g·L-1)
ρ(粗多糖)/
(g·L-1)
24 25 660
30 32 705
36 34 615
2.7 培养基起始pH对红曲多糖产量的影响
  多糖的合成在多种酶的共同催化作用下完
成[9],pH可影响酶的催化过程,它能改变体系酶的
反应环境和营养物质的代谢流,从而对菌丝体的生
长和多糖的积累产生较大影响。红曲是一种嗜酸
菌,尤嗜乳酸,实验研究不同起始 pH对红曲多糖产
量的影响,以乳酸调节培养基 pH分别为30、35、
40、45、50和55,考察起始 pH对多糖产量的影
响,结果见图7。由图7可知,pH<4的环境中红曲
菌生长较好,却不利于产物的积累,在 pH=5时,红
曲粗多糖质量浓度最高为70g/L,因此实验中,以
乳酸培养基中调节pH为5,促进菌体生长的同时也
提高了产物的量。
图7 起始pH对红曲粗多糖产量的影响
Fig.7 EfectsofinitialpHonthecrude
polysaccharideyeild
2.8 发酵培养时间对红曲多糖产量的影响
  赵振峰等[5]的研究结果表明,红曲多糖的发酵
周期为96h左右,结合本实验菌种,进一步确立红
曲菌ZKOA发酵产多糖的最佳发酵周期。实验分别
以72、84、90、96和102h为发酵终止时间,测定发
酵液中的粗多糖含量,确立合适的发酵终点(图8)。
图8 发酵时间对粗多糖产量的影响
Fig.8 Efectsoffermentationtimeonthecrude
polysaccharideyeild
  由图8可知,红曲多糖的合成主要集中在发酵40~
90h,发酵90h之后,多糖产量开始有下降。菌体质量浓
度也逐渐下降,利用HPLC测定90h的残余蔗糖质量浓
61 生 物 加 工 过 程   第7卷 
度为95g/L。在C源浓度较低的情况下,菌体进入衰亡
期,多糖的合成和积累受到影响。实验得出,最适发酵时
间为90h,红曲粗多糖质量浓度为76g/L。
2.9 20L发酵罐中试实验研究
  采用摇瓶优化条件,进行2次20L发酵罐发酵
实验,发酵罐其余发酵条件如下:通风量22L/min,
培养温度 33℃,搅拌速度 170r/min,培养时间
112h,每隔8h取样,结果见图9。
图9 发酵罐中菌体及粗多糖变化过程
Fig.9 FermentationtimecourseforBiomassand
crudePolysaccharideyeildina20Lfermenter
  发酵罐发酵结果和摇瓶发酵结果有一定的相
似性。在通风和机械搅拌情况下,发酵液中红曲粗
多糖的含量基本上达到和摇瓶发酵相同的结果。
整个过程可分为3个阶段:
  1)在0~32h菌体生长迅速,镜检可以看到菌
体呈长丝状,表明菌体生长良好;多糖开始合成,pH
上升,残糖明显下降。
  2)在32~88h阶段,菌体浓度继续增加,粗多
糖在菌体生长的中后期迅速合成,在88h时多糖质
量浓度达到最高点734g/L;
  研究小型发酵罐菌体量(X)和红曲粗多糖的质
量分数(w)的变化曲线,得出红曲多糖与红曲菌体
呈现一定的相关性。两次实验的随机误差以变异
系数CV为指标,计算得到 CV(菌体)<5%,CV(多
糖)<55%,说明实验数据准确[10],实验重现性高。
取2次实验结果的平均值,其曲线拟合所得的数学
表达式为w=00007X61898,R2=09845。
  3)88h之后,菌体开始下降,多糖的积累量也
下降,次级代谢产物色素开始合成;镜检菌丝体,呈
短片段,说明菌体在这个时候开始衰老溶解,释放
出胞内物质,导致pH上升。
  在发酵后期,发酵液中粗多糖的含量有所下
降,其原因可能是多糖作为红曲菌的一种贮备营养
物质,在发酵液 C源浓度较低时被分解利用。为使
发酵产物向多糖合成方向进行,有必要对补料发酵
工艺进行深入研究。
  红曲多糖是红曲胞外产物。在发酵工艺条件
优化时,仅对红曲发酵液的粗多糖含量进行了初步
的定量。准确的红曲多糖含量结果应依据提取及
纯化后的纯多糖含量而定。
3 结 论
  对红曲多糖的发酵生产进行了研究,得出红曲
多糖最适培养条件为:蔗糖 40g/L,酵母粉 45
g/L,KH2PO4·3H2O35g/L,MgSO404g/L,植物油
2mL/L,接种量8%,种龄30h,发酵液起始pH50,
发酵时间90h,在摇瓶实验中,多糖质量浓度可达
76g/L,20L发酵罐中的红曲多糖产量最高可达到
734g/L,基本上达到摇瓶水平。
参考文献:
[1] BohnJA,BeMilerJN.(1→3)βDGlucansasbiologicalre
sponsemodifiers[J].CarbohydPolymers,1995,28(1):38.
[2] ChenZhen,GuoQinglong,GaoXiangdong,etal.Tumorinhibitory
efectofYCP(amarinefugalpolysaccharide)(I)[J].ChinJNat
Med,2005,3(6):396400.
[3] 田军,李兆兰,沈晓云,等.红曲多糖的化学结构分析[J].南
京中医药大学学报:自然科学版,1998,14(4):217218.
TianJun,LiZhaolan,ShenXiaoyun,etal.Chemicalstructureof
Monascan[J].JournalofNanjingUniversityofTraditionalChinese
Medicine:NaturalScienceEdition,1998,14(4):217218.
[4] 张建峰.红曲多糖高产菌株的诱变筛选及其提取纯化免疫活
性研究[D].沈阳:吉林农业大学,2005.
[5] 赵振锋,方惠英,诸葛健.红曲霉发酵产胞外多糖工艺的优化
[J].无锡轻工大学学报,2002,2(3):289291;295.
ZhaoZhenfeng,FangHuiying,ZhugeJian.Thefermentationcondi
tionofMonascussppforextraceluarpolysaccharides[J].Journalof
WuxiUniversityofLightIndustry,2003,21(3):289291;295.
[6] 夏永军.红曲菌9903A提高色价降低桔霉素控制技术的研究
[D].无锡:江南大学,2007.
[7] 张婕,黄镇亚.培养基成分对木霉菌合成木聚糖酶的影响[J].
北京林业大学学报,2003,25(6):6870.
ZhangJie,HuangZhenya.Theinfluenceofsubstrateingredienton
thesynthesisofxylanasefromTrichoderma[J].JournalofBeijing
ForestryUniversity,2003,25(6):6870.
[8] 周德庆.微生物学教程[M].2版.北京:高等教育出版社,
2002:92.
[9] 张惠展.途径工程:第三代基因工程[M].北京:中国轻工业出
版社,2002:14
[10]董时富.生物统计学[M].北京:科学出版社,2002.
71 第2期 李霞姣等:红曲多糖液态发酵工艺条件的优化