全 文 ：Mav2007
·46·
生物加工过程
ChilleseJonmal硝BiopmcessEn爵nee“”g
第5卷第2期
2007年5月
如Znc￡o，n弘esg o￡r：c危umY25产脂肪酶条件的优化
阎金勇，杨江科，闫云君
(华中科技大学生命科学与技术学院，武汉430074)
摘要：应用响应面法对‰打"fom"档胛o#一chnlY25液体发酵产脂肪酶的暑件进行了优化，首先采用Plackett-
B㈣n设计对影响产酶因素的效应进行评价．筛选出黄豆粉、王米装和发酵时问3个对产酶彰响显著的因素用
最陡爬坡路轻逼近最大产酶区域后．利用响应面设计对显著因素进行优化，得出黄豆粉、王米蒙最佳质量分数分剐
为251％、212％，最佳发酵时间10195h。优化后液体发酵液中脂肪酶活力提高到3465u／mT．，比初始酶活力
9．6u／mL提高了361倍。表明响应面法可显著优化如2Ⅱ“om"部雕oonc^“mY25液体发酵产脂肪酶条件：
关键词：脂肪酶；cⅡfⅡc如彤c洲船o￡丌c^“mY25；Ha(，kett—Buman设计；响应面法；优化
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：1672—3678【2007)02一0046—06
Optimizationoflipaseproductionconditio璐byGⅡ肠cfo打砂cFs舻劬记^HmY25
YANJjn—yong，YANGJjang—ke，YANYun_jun
(collo驴ofJ』忙sⅢnc㈨dTechn0109y．HuazhongLJniversityofsclence卸dTechnology，wuhan430074，china)
Abstract：ThefeⅡnentationconditionsofljpas。pmductionby血ZocfonlFe5肜。mc^umY25were叩ti-
mizedwithre8ponsesudhcemethodolog)7．Initially，screeningdesignbyPlacken·Burmanmethodwas
usedtoevaluatethe饪ectsofelevenfactorsrelatedoliPaseproductionandthreestatisticallysignincant
Iactors(i．e．，soybeannour，comste8pliquorandculturetime)weres kcted．Thepatofste8pestas—
ccnLwasusedto8Pproachtheoptimalregionflipas。productions bs。quentlv．Then，theoptimalcom—
b．ncdcofldiIiuIIs如fmaximumenzymeactivitywerefurtherop出nizedbyre8Pollsesut{acemet}10d矗。影
andweredetemlincdasf埘ows：so、山eannour2．5l％，comste。pliquor2．12％，andculturetlme
l叭95h．UnderlheoptimalcondjIions，theenzymeacdvitymprovedfmm9．6U／mLto34．65U／mT一，
a3，6l—foldjncrease，wbjchind a￡ed出出fhef船ponseudoceme出od0109ywasaneⅡ音ctjvem 出odfor
optimiz撕onoflipaseproductionconditi咖sof＆fncfo”廿∞m舻。删吐umY25．
1沁ywords：lipas。；Ga2n诎)m"℃5酽。仉出umY2 ；Plackeu—Burmandesig“；re8ponsesu什acm thod010—
gy；op“miza“on
脂肪酶(甘油i酰酯水解酶，Ec3．1．1．3)足一
类水解和合成长链脂肪酸甘油酯的生物催化剂，杠
食品加工、医药、化妆业、皮革加工、饲料加工、造纸
业等诸多领域有着J’泛的应用¨”。本文以提高脂
肪酶产量为目的，对从四川油污_十壤小筛选到的
白mmm，∞ge。￡“曲“mY25产脂肪酶条件进行优化
研究，为后续该脂肪酶的应用研究奠定r基础。
传统的优化力法是单凶予、部分出子及全因子
收稿日期：2006-1】一10
基金项目：国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2003AA214061)
作者简介：阎金勇(1979一)，男，湖北荆州人，硕士，研究方向：微生物脂肪酶。
联系人：闰云君，教授，博士生导师，E咖ll：ya“yuqun@fomcom
万方数据
!!!：笙!旦 l塑叁里量：c“妇c??竺竺!竺兰!竺里!主!重!重堕叁竺塑垡堕 。。7
设计法，当考察的冈子较多和存在交且作用时，试
验次数会大增．甚全实验结果不准确”1。Plackett．
Bu丌¨an设计和响应而法(R泖oⅢes“，舡re且如f^o南z一
。∥)在微生物培养摹组成和培养条件的优化工作中
取得了良好效果⋯。本文借助sAs(stat㈨calAnal—
ysjsystem)9．o统计软件应用响应面法对G。fⅢo—
m声es∥。frzch—Y25产脂肪酶条件进行J，优化
研究．、
1材料与方法
1．1菌种
∞fnc^o”叮c郫俨Drr}c^!‘mY25从叫川油污土壤中
筛选得到。
i 2 培养基
种子培养基(质量分数)：黄豆粉15％，卡米浆
1 5％，蔗{糖1．O％，(NH。)：s0。01％，K，IIP0。
0 2％，MgSO。·7H，00．01％。
初始发酵产酶培养基(质嚣分数)：黄豆粉
1．5％．_{{米浆15％，蔗糖1．0％，(NH。)，s0。
(1I％，K2IIP040．2％，Mgs04·7H20ooI％，橄榄
油体积分数l％，培养条件均取表l中的低水平．
1 3发酵培养
将活化24h后的种子培养液以体秋分数lo％
的接种量接种至发酵产酶培养基巾，一定条什下摇
床培养。培养液于4℃，8ooor／min离心loInim
取上清发酵液测定脂肪酶活力。
1，4脂肪酶水解活力测定方法
橄榄油乳化滴定法5I做适当修改：在40℃、
O05moL／L、pH7．5的’肺s-Hcl缓冲液，2mm彤L
cacl：的条件下，将每毫升脂肪酶酶液水解橄榄油每
分钟产生f“moi游离脂肪鳆所需的酶量定义为一
个脂肪酶活力单位(u／mL)。
1 5 P1ackefI_Buman设计筛选影响产酶的显著
因素
影响G．g∞￡ric^u，nY25液体发酵产酶的可能
因素包括黄豆粉、玉米浆、蔗糖、(NH。)，sO。、
K2HP04、Mgs04·7H2 、橄榄油、培养基起始pII
值、摇床转速、发酵温度、发酵时问。为对这11个因
素进行全面考察，选用Ⅳ=15的P1ackett-Bl】rnlan设
计，并设4个窀白作为误差分析项。每个因素取高
(+1)低(一1)阿个水平⋯。运用sAs9．o软件分
别计算各因素的效应值．，译对各因素效城进行≠检
验，选择置信度较高的冈素作为显著因素作进一步
考察。PI∽kcu—Bunllall设计见表1，刖～爿15分别代
表参数(NH。)2sO。、M毋0，·7H：O、K：}{P0。、黄豆粉、
空[j项、玉米浆、空白项、蔗糖、空白项、橄榄油、温
度、发酵时问、转速、培养基初始pH、空白项。各因
素水平见农2。
J 6最陡爬坡实验逼近最大产酶区
响应而拟台方程在等察的邻近医域才能较好
地反映真实情形，所以，脏先逼近最大产酶区域后，
再建立有效的拟台方程7。根据Plackm．Buman
法筛选出的显著冈素效应大小漩定它”J的步长进
行鼎陡爬坡实验设计(表3)，寻找最大产酶R。
l 7响应面设计确定显著因素的最优永平
逼近最大产酶区历，进行响鹰面实验鼓fJ(表
4)，以实验结果拟合建立描述响应量(产酶量)与自
变量(影响产酶的挂著闪素)关系的多项式同归模
型”。．运硐sAs9．o软什程序对实验数据进行同归
拟合，并对拟合方程作显著件榆蝓及方差分析，再
对拟合方程进行规范形分析，寻找回归模型的稳定
点，得到最大产酶量时显著因素的最优水平。
2结果与讨论
2．1 Pkrk《一Bu—an设计筛选影响脂肪酶液体发
酵的显著因素
Plackell_BuⅡnan设计实验测得的酶活力结果见
表l，各凼素效应评价见表2。由表2可知，对脂肪
酶液体发酵过程有显著影响(置信度人于95％)的
因素有黄豆粉、卡米浆和发酵时间，且对产酶均旱
现Ⅲ1￡效应。要提高产酶量，应适当提高黄豆粉、
玉米浆的浓度，延长发酵时间。其他因素对产酶影
响小娩著，维持枉低水平。
2．2最陡爬坡实验确定响应面实验因素水平的中
心点
黄豆粉、玉米浆、发酵时问的步长依次为
十o．20、+010、+6h。设计及实验测得的酶活力结
果见表3。由表3nJ‘知，最大产酶区在第4次实验
附近，故以实验4的条件为响应面实验冈索水平的
中心点，响应面实验因素水平见表4。
万方数据
54： 生疆一¨H翻
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万方数据
50· 生物加工过程 第5卷第2期
图l(A，a)、(B，b)、(c，c)分别表示发酵时间、玉米浆、黄豆粉编码水平处于O时
另外两个因素对酶活力的反应曲面和等高线
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