全 文 ：May2008
·24·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第3期
2008年5月
添加有机酸对Clostridiumacetobutylicum
合成丙酮和丁醇的影响
唐 波，余晓斌，李灵巧
(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：为提高丙酮．丁醇梭茵厌氧发酵生产丙酮和丁醇的能力，在发酵过程中添加有机酸(乙酸和丁酸)，考察其
对茵体生长、溶剂合成影响。实验表明：当添加1．5∥L乙酸时能够促进茵体的生长，促进丙酮的合成，在600nm
处的最大OD值比参照值高出18．4％，丙酮的最终质量分数提高了21．05％，但不能促进丁醇的合成；"-3添加1．O
g／L丁酸时能够促进菌体生长，促进丁醇的合成，在600nm处的最大OD比参照值高22．29％，丁醇的最终质量分
数比对照组提高了24．32％，但不能促进丙酮的合成。
关键词：丙酮；丁醇；丙酮丁醇梭茼；发酵；有机酸
中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0024一05
Effectofaceticandbutyricacidsonfermentationproduction
ofacetone-butanolyClostridiumacetobutylicum
TANGBo，YUXiao—bin，LILing—qiao
(TheKeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyofMinistryofEducation，CollegeofBiotechnology，
JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：Toimproveacetone—butanolproductionefficiencybyClostridiumacetobutylicum，aceticandbu—
tyrica idwereaddedtothefermentationbrothoinvestigatetheffectoncellgrowthandproductionof
acetone—butan01．Additionof1．5s／Laceticacidincreasedthcellgrowthandenhancedacetoneproduc—
tion，thefinalconcentrationof cetonewas21．05％，andthebutanolproductionWasnotimproved．Ad—
ditionof1．0s／Lbutyricacidincreasedthcellgrowthandenhancedbutanolproduction，thefinalcon—
centrationofbutanolWas24．32％，whiletheacetoneproductionWasnotimproved．
Keywords：acetone；butanol；Clostridiumacetobutyl um；fermentation；organicacid
丙酮和丁醇作为重要的溶剂，具有广泛的用途。
从20世纪50年代以来丙酮和丁醇发酵工业受到石
油工业的严重冲击，丙酮和丁醇发酵工业走向衰退。
随着石油资源逐步走向枯竭，世界原油价格的飞涨，
古老的丙酮和丁醇发酵技术，作为一项有效的、利用
生物质资源生产燃料的生物转化技术，又重新被人们
所认识，特别是丁醇作为一种极具潜力的新型燃料已
经引起国内外的高度重视，2005年美国进行了完全
以丁醇为燃料的汽车实验，前景广阔‘卜21。
虽然微生物发酵生产丙酮、丁醇等溶剂产品与
收稿日期：2007-08—14
基金项目：长江学者与创新团队发展计划资助项目(IRT0532)
作者简介：唐波(1981一)，男，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向：生化工程。
联系人：余晓斌，教授，博士生导师，E-mail：xbyu@jiangnan．edu．cn
万方数据
2008年5月唐波等：添加有机酸对Clostridiumacetobutylicum合成丙酮和丁醇的影响·25·
化学法合成相比具有很多优点，但是在发酵过程中
伴有乙酸、丁酸等副产物口J，乙酸和丁酸的过度积
累在一定程度上影响菌体的生长和代谢，导致丙酮
和丁醇发酵合成效率较低，缺乏市场竞争力，极大
地抑制了丙酮和丁醇发酵工业的发展。
针对丙酮和丁醇合成效率较低的问题，本文根据
代谢支路互相耦联的特性，向培养基中添加适量的代
谢副产物有机酸(乙酸和丁酸)，研究其对丙酮一丁醇梭
菌生长以及丙酮和丁醇合成的影响，并对相关机制进
行初探。结果表明，添加有机酸可以促进丙酮和丁醇
的最终质量浓度，减少副产物的积累，这为生物发酵法
高效生产丙酮和丁醇提供了重要参数，对今后的菌体
代谢过程分析和该技术的工业化有—定参考价值。
1材料与方法
1．1菌株
实验所用菌株为丙酮一丁醇梭菌(Clostridium
acetobutylicum)，江南大学酶工程实验室筛选保藏。
1．2培养基
种子培养基：质量分数5％玉米醪培养基，称取
过40目筛的玉米粉50g，加1L自来水，煮沸
50rain后，补足挥发的水分。灭菌121℃，30min。
发酵培养基：质量分数7％玉米醪培养基，配制
过程如上。
1．3培养条件
从玉米醪试管中以10％的接种量转接至种子
培养基中，厌氧培养24h(37℃)，再以5％的接种
量转接至发酵培养基进行厌氧培养。
1．4分析方法
溶剂(丙酮、丁醇、乙醇)的测定：发酵液经过离
心后，取上清液5mL，经过O．45Ixm孔径的微滤膜
过滤，得到的滤液采用GC-2010气相色谱仪顶空进
样检测。色谱柱为PEGl701—30M，0．53mm×
1．0am；检测器FID；进样温度为150℃；检测温度
为260℃；柱温为40(保温3min)～180℃(保温
2min)；载气为N2，流速为5mL／min；H2流速47
mL／min；顶空进样条件：起始温度70℃，保温
25min，加压5min；传输线温度130℃。
有机酸的测定：发酵液经过离心后，取上清液
5mL，经过0．45pin孔径的微滤膜过滤，得到的滤液用
于HPLC分析，色谱条件：惠普1100系列(HPll00)，色
谱柱为Di舢d1MCl8；流动相组成为o．1mol／L的
KI也PO,(体积分数5％甲醇)；进样量10止；流速为
0．15mL／min；紫外检测器210rim；柱温，室温。
pH值的测定用pH计。
菌浊度的测定：用去离子水稀释发酵液至适宜
的浓度，用分光光度计测叩鼬。
2结果与讨论
2．1菌体生长及溶剂的合成
将在厌氧瓶中活化的种子以5％的接种量接种至
发酵培养基，在厌氧瓶中进行厌氧培养，培养温度为
37℃，定时取样测定OD、溶剂(丙酮、丁醇、乙醇)产量
及副产物(乙酸、丁酸)的产量，结果如图1—3所示。
6
5
4
岔s
2
1
0 10 20 30 40 50 60
t／h
图1丙酮．丁醇梭菌生长曲线
Fig．1CellgrowthcurveofClostridiumacetobutylicum
12
产10
÷8
望6
藿4
气2
O lO 20 30 40 50 60
t／h
图2丙酮．丁醇梭菌厌氧发酵产物积累曲线
Fig．2Accumulationofproductsduringtheanaerobic
cultureofClostridiumace幻butylwum
2．5
，2．0
一
堇L5
链1．0
{L
qO．5
O 10 20 30 40 50 60
t／h
图3丙酮．丁醇梭菌厌氧发酵副产物积累曲线
Fig．3Accumulationofby-productsringheanaerobic
cultureofClostridiumacetobutylicum
万方数据
· 26· 生物加工过程 第6卷第3期
由图1～3可以看出，在丙酮和丁醇发酵过程
中，主要的副产物是乙酸和丁酸，在前发酵期(0—
30h)菌体生长迅速，在这一阶段主要积累乙酸和丁
酸，丙酮和丁醇积累量很少，在30h乙酸和丁酸的
产量达到最高值，这一阶段主要是产酸阶段。进人
主发酵阶段(30—60h)，细菌繁殖达到顶峰，还原的
程度超过氧化的程度，在前发酵过程中合成的乙酸
和丁酸被部分转化为丙酮和丁醇，这一阶段主要是
产溶剂阶段。发酵40h后，由于营养物质的消耗，
副产物乙酸和丁酸的过度积累，菌体开始衰退，溶
剂的合成也减缓。所以为了提高溶剂的产量，要避
免菌体生长过早停滞，抑制菌体的衰退。
2．2添加有机酸对丙酮一丁醇梭菌生长的影响
过早或过晚添加有机酸均不利于菌体的生长
和溶剂的合成，根据前期的实验结果向培养基中添
加有机酸的最佳时间为14h。
在培养14h后向培养基中添加有机酸，从最大
OD值、最终OD值、对数期等方面研究其对菌体生
长的影响，结果如表1所示。从表1可以看出适量
添加有机酸(乙酸和丁酸)时，菌体的最大OD值和
对数期较参照值(未添加有机酸)都有所增加，但当
添加的有机酸过量时菌体的生长反而受到抑制，其
最大OD值和对数期均有所减少。培养14h后添加
适量有机酸，其最大OD值都在5．0以上，而参照值
低于5．0，同时对数期也比参照值长，发酵60h测定
其最终OD值，可以发现适量添加有机酸后最终OD
值比参照值高。其中添加1．5g／L乙酸和1．0s／L
丁酸的效果最为明显，最大OD值分别比参照值提
高了18．4％和22．29％，同时其对数期和最终OD
值也比参照值高，可见添加适量的有机酸可以促进
菌体的生长抑制菌体的衰退。
表1 添加有机酸对菌体生长的影响
TableEffectofadditionof rganicacidsoncellgrowth
2．3 添加有机酸对丙酮．丁醇梭菌合成溶剂的影响
在培养14h后向培养基中添加不同质量浓度
的乙酸和丁酸，发酵60h取样测定溶剂(丙酮、丁醇
和乙醇)质量浓度，考察有机酸的添加对菌体合成
溶剂的影响，结果见表2。由表2可知，添加适量质
量浓度的有机酸对溶剂质量浓度的提高有一定程
度的帮助，其中分别添加1．5g／L乙酸和1．0g／L丁
酸对溶剂质量浓度的提高最为明显，当添加1．5g／L
乙酸时，溶剂的质量浓度比参照值提高了8．23％，
当添加1．0g／L丁酸时，溶剂的质量浓度比参照值
提高了14．63％。由此可见，在发酵过程中添加一
定质量浓度的乙酸或丁酸能够促进溶剂的合成，同
时实验结果与2．2的结果一致，这说明丙酮-丁醇梭
菌的生长和溶剂的合成是耦联的H。-。
表2添加有机酸对丙酮．丁醇梭菌合成溶剂的影响
Table2 Effectofadditionorganicacidsonthe
solventproduction g·L‘1
添加物质 添加量P(丙酮)P(丁醇)P(乙醇)
乙酸 1．0 5．45 9’56 1．96
乙酸 1．5 5．98 9．64 2．14
乙酸 2．0 4．80 9．48 1．92
丁酸0．5 4．97 10．21 1．87
丁酸 1．0 4．96 11．91 1．94
丁酸 1．5 4．76 9．21 1．62
参照值 一4．949．58 1．89
2．4添加乙酸对发酵过程影响
在培养14h向发酵培养基中添加1．5g／L的乙
酸，副产物的积累和溶剂合成如图4和图5所示。
由图4可以看出添加乙酸后，发酵液中乙酸质
量浓度大幅提高，随着发酵的进行，发酵30h后乙
酸和丁酸的质量浓度逐渐减低，从图5可以看出，在
发酵30h后溶剂合成能力增强，溶剂的质量浓度逐
渐提高，与参照值相比丙酮的最终质量浓度由
4．94g／L提高到5．98g／L，提高了21．05％，丁醇和
乙醇的最终质量浓度几乎没有变化。由图4可知，
发酵结束时乙酸的质量浓度比参照值降低了
19．02％，同时丁酸的质量浓度也降低了12．3％，这
表明添加的乙酸可以促进丙酮的合成，提高丙酮的
最终质量浓度，但不能明显提高丁醇和乙醇的最终
质量浓度，同时能降低副产物乙酸和丁酸的积累。
万方数据
2008年5月唐波等：添加有机酸对Clostridiumacetobutylicum合成丙酮和丁醇的影响·27·
3．0
—2．5
●2．0
≤1．5
锚
{L1．0
q
0．5
O 10 20 30 40 50 60
t／h
图4添加1．5s／L乙酸后副产物的积累曲线
Fig．4Accumulationofby—productsduringtheanaerobic
cultureafteradding1．5s／Lacetate
12
一10
78
耋6
幂
缝4
q
2
0 10 20 30 40 50 60
t／h
图5添加1．5g／L乙酸后产物的积累曲线
Fig．5Accumulationofproductsdi ringa aerobic
cultureafteradding1．5g／Lacetate
2．5添加丁酸发酵过程的影响
在发酵14h时向培养基中添加1g／L丁酸，其
副产物的积累和溶剂的合成分别如图6和图7所
示，由图6可以看出，添加丁酸后，使发酵液中丁酸
的质量浓度增加，但是随着发酵的进行丁酸逐渐被
利用，在发酵结束丁酸最终质量浓度比参照值降低
了46．1％，而且乙酸的最终质量浓度也下降了
15．08％．由图7可知添加丁酸后，发酵结束时丁醇
的最终质量浓度与参照值相比提高了24．32％，由
9．58g／L提高到11．91g／L，丙酮的最终质量浓度变
化不大。表明添加丁酸能显著提高丁醇的最终质
量浓度，但是不能提高丙酮的最终质量浓度，同时
促进乙酸和丁酸的转化利用，降低乙酸和丁酸的
积累。
2．6添加有机酸后发酵液缓冲能力的变化
以未添加有机酸的发酵液为对照组，考察添加
有机酸后，pH的变化情况，结果如图8所示，由图8
可以看出，与对照组相比，添加有机酸后，发酵液的
pH下降较慢，变化幅度较小，发酵结束时的pH明
显高于对照组，这说明由于有机酸的添加，促进了
菌体对乙酸和丁酸的利用，降低了乙酸和丁酸的过
度积累，使发酵液的缓冲能力期高于对照组，从而
减轻了对菌体生长的抑制，减缓了菌体的衰退，从
而在一定程度上促进了菌体合成丙酮和丁醇的
能力。
，2．0
岛1·5
锱1．o
|}L
气o．5
O
t，lI
图6添加1．0g／L丁酸后副产物的积累曲线
Fig．6Accumulationofby-productsringheanaerobic
cultureafteradding1．0s／Lbutyricacid
，：：
量：
藿42
0 10 20 30 40 50 60
玑
图7添加1．Og／L丁酸后产物的积累曲线
Fig．7Accumulationofproductsduringtheanaerobic
cultureafteradding1．0g／Lbutyricacid
4．8
4．6
4．4
王4．2
厶4．0
3．8
3．6
3．4
图8添加有机酸后对pH变化的影响
Fig．8EffectofadditionorganicacidsonpH
changeduringthefermentation
3结论
为提高丙酮一丁醇梭菌厌氧发酵生产丙酮和丁
万方数据
· 28· 生物加工过程 第6卷第3期
醇的能力，在发酵过程中添加有机酸(乙酸和丁
酸)，考察其对菌体生长、溶剂及副产物合成的影
响。实验结果表明，添加有机酸提高了培养基中游
离的乙酸和丁酸的质量浓度，增强了培养基的缓冲
能力，促进了菌体的生长，抑制了菌种的衰退，同时
由于乙酸和丁酸的添加，使代谢流更多地流向丙酮
和丁醇支路，削弱了副产物的积累，提高丙酮、丁醇
最终质量浓度旧。71。添加一定浓度的有机酸(乙酸
和丁酸)可以显著促进菌体的生长，抑制菌体衰退，
当添加1．5g／L乙酸时，最大OD值比参照值提高
18．4％，最终OD值比参照值提高34．12％；添加
1．0g／L丁酸时，最大OD值比参照值提高了
22．29％，最终OD值比参照值提高了35．44％。同
时添加一定浓度的乙酸或丁酸能够不同程度地提
高溶剂的产量，当外源添加1．5g／L乙酸时，丙酮的
最终质量浓度由4．94g／L提高到5．98g／L，丁醇和
乙醇的最终质量浓度变化不明显；当添加1．0g／L
丁酸时，丁醇的最终质量浓度由9．58g／L提高到
11．91g／L，丙酮和乙醇的最终质量浓度几乎没有变
化。这为发酵法生产丙酮和丁醇提供了参考依据，
但是相关的机理尚不明确，下一步将在酶水平研究
外源添加有机酸对代谢支路相关酶的影响，进一步
研究其相关代谢机制，以更好地指导发酵生产。
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华东设计院生物燃料装置设计取得突破
由中国石油工程建设公司华东设计院设计的山东石大胜华化工股份有限公司生物燃料装置一次喷油
投产成功。经过半个月的运行，目前装置运转正常，操作稳定，处理量达到设计要求。该装置既能满足年30
万t两段提升管催化裂化操作，也能满足生物燃料装置操作。
华东设计院设计的山东石大胜华化工股份有限公司生物燃料装置采用中国石油大学化学化工学院研
制开发的生物燃料技术，以动、植物油脂为原料，在催化剂的作用下生成液化气、丙烯、轻质生物燃料和重质
生物燃料。
(张春鹏)
万方数据