全 文 ：超高浓度培养基条件下酵母细胞生长及
酒精生成的准稳态动力学研究
陈丽杰!，白凤武!，"# #$%&’()$*，+ +)),-).$/*!
（!0 大连理工大学 生物科学与工程系，大连 !!12*3；
*04&56’78&$7 )9 :;&8<=6> ?$/<$&&’<$/，@$
摘 要：在 !0G E搅拌式发酵罐中，使用葡萄糖质量浓度分别为 !*2、*22、*H2 / I E的培养基进行酿酒酵母 !"##$"%
&’()#*+ #*&*,-+-"*连续发酵生成酒精的动力学研究。研究发现，当培养基中葡萄糖浓度为 *22和 *H2 / I E时，发酵液
中残糖浓度、酒精浓度以及菌体生物量从小幅度波动的准稳态发展到大幅度波动的振荡状态。提出了伴有周期性
振荡现象准稳态过程的概念，并针对该过程，建立了兼有底物和产物抑制的酵母细胞生长和产物酒精生成动力学
模型。
关键词：酿酒酵母；超高密度；准稳态；酵母细胞生长；酒精生成；动力学模型
中图分类号： JH!G 文献标识码： # 文章编号： !1K*,31KH,*22L,2*,22*G,2G
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目前，用酿酒酵母 !"##$"&’()#*+ #*&*,-+-"* 发酵 生产酒精仍然是最经济的方法。因为发酵液中的高
! 收稿日期：*22L,23,!*
作者简介：陈丽杰（!X1G,），女，硕士，副教授，研究方向：生物化工。
联系人：白凤武，?,86<>：9RV6
第 *卷第 *期
*22L年 G月
生 物 加 工 过 程
:;<$&(& Z).’$6> )9 O<)5’)=&(( ?$/<$&&’<$/
+6B *22L
·*G·
万方数据
酒精浓度可以显著降低精馏操作能耗，并减少废糟
液总量，进而降低废糟液处理能耗，超高密度酒精发
酵技术（!"#$ %&’% ’#(!&)$，*+,）———即采用含糖质量
分数高于 -./的培养基［0］，使发酵终点酒精体积浓
度达 0./以上，正在引起人们的关注［- 1 2］。
细胞生长和产物生成动力学是工艺过程优化和
放大设计的理论依据。对酒精发酵而言，长期以来
的动力学研究工作多针对批式培养和发酵系
统［. 1 3］。低浓度培养基条件下，酵母连续发酵生成
酒精的稳态动力学模型也有一些报道［4 1 05］。近年
来，不仅酒精连续发酵生产技术已普遍应用于工业
生产中，同时 *+,技术也在不断发展，但相应的动
力学研究工作尚未见报道。
酒精是酵母细胞的强毒性代谢物，因其抑制酵
母细胞的生长，进而抑制酒精的生成。对于 *+,技
术来说，底物抑制也出现在多级串联系统中的前几
级反应器中。另外，不同于低培养基密度条件下的
稳态或拟稳态过程，在 *+,条件下，我们观察到：发
酵液中残糖浓度、酒精浓度以及菌体生物量不仅呈
小幅度波动的拟稳态行为，而且还表现出周期性的
大幅度振荡。本文对这一过程的动力学行为，包括
酵母细胞生长和产物酒精生成，进行了研究。
! 材料和方法
060 菌种
菌种，!"##$"%&’(#)* #)%)+,*,")，加拿大滑铁卢大
学化工系 78##($ 799:;98<’教授课题组提供。
06- 培养基
摇瓶种子培养基（’ = >）：葡萄糖 ?5，酵母粉 .，蛋
白胨 ?。
发酵罐连续培养培养基（’ = >）：葡萄糖 0-5，酵
母粉 .，蛋白胨 ?。
发酵罐连续发酵培养基（’ = >）：葡萄糖分别为
0-5、-55和 -45，酵母粉 .，蛋白胨 ?。
以上培养基在 0-0 @下灭菌 05 A&<后，置于自
来水槽中迅速冷却至室温，以避免抑制物的形成。
06? 培养方法
摇瓶培养：将菌种接入装有 055 A> 培养基的
-.5 A>锥形瓶中，在 ?5 @、转数 0.5 # = A&<条件下培
养 -2 %。
发酵罐接种及培养：将摇瓶培养的种子约 -55
A>，接入装有生长培养基的 06. > B&9CD9搅拌式发酵
罐中，搅拌转数控制在 ?55 # = A&<，保证发酵罐达到
理想全混流状态。培养与发酵的温度均控制在 ?5
@，E+值为 26.，通气量为 565. !!A。当发酵罐中残
糖质量分数达到 0 ’ = >左右时，开始流加培养基连
续培养，控制培养基流加的稀释速率使流出发酵液
的残糖水平保持在 0 1 - ’ = >。当发酵罐中菌体密度
达到 . 1 F ’ = >时，培养阶段结束，切换为发酵用培
养基。改变培养基流加的稀释速率，当系统达到平
衡时，分析残糖浓度、酒精浓度和菌体生物量。稳态
条件下，至少运行 ? G；在准稳态和振荡现象出现时，
系统的保持时间取决于培养基浓度和稀释率。
062 分析方法
酒精：由 +H .4I5气相色谱仪测定，35@恒温毛
细管柱，固定相为 J#9KKL9
测温度为 -.5@，H"(NK&AED" O()( +(
残糖：采用试剂盒（P&’A( ,D8Q9K" O&(’<9K)&Q R&)，
J()(D9’ S9600.:T）进行测定。
菌体生物量：由干重法测定。将 0A>培养液离
心、蒸馏水洗涤 ? 次，然后置于 4.@烘箱中烘至恒
重，称量干菌体。
酵母细胞活性：采用次甲基蓝染色法定性评价。
" 结果与讨论
-60 稳态、准稳态和振荡
采用葡萄糖质量浓度分别为 0-5、-55、-45 ’ = >
的培养基，在稀释率为 565-3 %:0条件下进行连续发
酵实验。切换不同浓度培养基后，系统经历足够长
时间，使发酵液中的酒精浓度、残糖浓度和菌体生物
量与培养基中糖的消耗量相对应，然后开始间隔 2 %
取样，检测残糖、酒精浓度和菌体生物量，实验结果
如图 0 1 ?所示。
向发酵罐加料的葡萄糖浓度为 0-5 ’ = >的低浓
度培养基（图 0）时，发酵液中残糖浓度为零，酒精浓
度平均值为 .46- ’ = >，酵母浓度平均值为 F6? ’ = >。
在此条件下，完全没有底物抑制，酒精抑制也较小。
酒精浓度和酵母菌体生物量基本上处于稳态，波动
幅度分别为各自平均值的 U ?/和 U 4/，属正常分
析误差范围。
当培养基中葡萄糖浓度增加到 -55 ’ = >时，发酵
液中残糖浓度仍然保持在较低的水平，但出现波动
·-F· 生物加工过程 第 -卷第 -期
万方数据
现象（图 !）：残糖浓度最小值、最大值和平均值分别为
!"#$ % & ’、((#) % & ’和 $*#( % & ’，波动幅度在+$$#",与
! -./0123 " 4526077
图 8 培养基中糖质量浓度为 8!) % & ’时发酵参数随
时间变化
95%#8 9:;6:1.0.521 <0;06:.:;7 =:;7>7 .56:（!) ? 8!) % & ’）
—#—@:75A>03 B3>C27:；—"—-./0123；—!—4526077
图 ! 培养基中糖质量浓度为 !)) % & ’时发酵参数随
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图 $ 培养基中糖质量浓度为 !D) % & ’时发酵参数随
时间变化
95%#$ 9:;6:1.0.521 <0;06:.:;7 =:;7>7 .56:（!) ? !D) % & ’）
E ((#),之间，在此残糖浓度范围内，底物抑制作用
仍不明显。酒精浓度平均值增加到 D)#( % & ’，对酵
母细胞生长有明显抑制。仔细观察实验数据可以发
现，残糖浓度、酒精浓度和菌体生物量的波动状况相
似，从其趋势上看，可将波动分为两种类型。其一，
波动幅度相对较小、保持时间长，即准稳态过程；其
二，波动幅度大、持续时间短，各发酵参数的最大值
和最小值均在该阶段中出现。
继续增加培养基中葡萄糖浓度至 !D) % & ’，发酵
液中酒精浓度略有降低，其平均值为 F"#$ % & ’，残糖
浓度平均值增至 88F#! % & ’；上述的波动现象仍然出
现（图 $）。
为了考察大幅度波动是否是稳定的实验现象，
以葡萄糖浓度为 !D) % & ’的培养基，连续运行两个
月，取样频率为每天 8次。在系统运行期间，严格控
制温度、
现，且以发酵参数平均值为轴线呈对称分布，呈振荡
特征，引发这种振荡的机理有待于进一步深入研究。
—"—@:75A>03 %3>C27:；—!—-./0123；—#—4526077
图 " 超高浓度培养基条件下的持续性准稳态和振荡行为
95%#" H>7.051:A I>075+7.:0AJ 7.0.: 01A 27C5330.2;J K:/0=52;7 >1A:;
LGB C21A5.521（!) ? !D) % & ’，" ? )#)!F /+8）
!#! 动力学模型的建立及动力学特性参数的推导
!#!#8 动力学模型的建立
酵母细胞的强毒性代谢物酒精生成后，特别是
在 LGB技术条件下，发酵液中酒精的累积对酵母细
胞的生长有强抑制作用。
以前的诸多研究［8!］中已经表明，酒精对酵母细
胞生长的抑制与非竞争性产物抑制的酶催化反应相
似，即产物酒精只影响细胞最大比生长速率!MNO ?
#（$）
两者间关系可由广义非线性方程表示［8$］：
!MNO ?!60P ?（8 Q
$
$60P
）! （8）
对于有底物抑制的情况，引入底物抑制系数 %&
对 " 可得到 M212A方程的修正［8$ R 8(］，表达式：
!S ?!MNO ?
!
%! E ! E !! ’ %&
（!）
合并（8），（!），（$），得到兼有产物抑制和底
物抑制的动力学模型方程如下：
!))"年 (月 陈丽杰等：超高浓度培养基条件下酵母细胞生长及酒精生成的准稳态动力学研究 ·!F·
万方数据
!! "!#$% "
!
"! & ! & !’ # "$
（( ) %%*+,
）! （-）
在连续培养过程中，当稀释率非常低且为低浓
度培养基时，系统中限制性底物通常是检测不出来
的，然而在此条件下，酵母细胞的生长和酒精的生成
确有发生，令此条件下的细胞比生长速率为".，细
胞实验比生长速率应为：
!"!*+, "
!
"! & ! & !’ # "$
（( ) %%*+,
）!&!. （/）
酒精是酵母细胞的初级代谢产物，其生成与酵
母细胞生长密切偶联，因此酒精的比生成速率"可
用与酵母细胞生长相似的动力学模型表示：
"""*+, "
!
"! & ! & !’ # "$
（( ) %%*+,
）#&". （0）
（0）式中的".为以低稀释率流加低浓度培养基
条件下酒精比生成速率，其值可以由实验测定。理
论上，"、"*+,和!、!*+,可以通过得率系数关联。酵
母细胞生长进入稳定期，酵母菌体的净增加量为零
时，但一些酵母细胞仍在出芽或增加胞内物质的储
藏，还需要糖酵解提供维持能量。考虑到这种复杂
的生物现象的影响，在式（0）中引入修正的 #1213常
数 "!!和修正的底物抑制常数 "!!替换（0）式中的
相应常数 "!和 "$，得到式（4）：
"""*+, "
!
"!! & ! & !’ # "$!
（( ) %%*+,
）#&$.（4）
在连续的悬浮培养系统中，对菌体生物量进行
物料衡算得到：
3&
3 ’ "!& ) (& （5）
在稳态和准稳态条件下，
3&
3 ’". （6）
( "! （7）
对酒精进行物料衡算得到：
3%
3 ’ ""& ) (% （(.）
在稳态和准稳态条件下，
3%
3 ’". （((）
""
(%
& （(’）
对于连续培养过程，在控制稀释率 ( 为定值的
条件下、测定酵母菌体量和酒精浓度后，便可确定酵
母细胞比生长速率和酒精的比生成速率。
’8’8’ 动力学模型参数的估值
准稳态和振荡发生在高浓度培养基条件下的发
酵过程中，但是相对发酵全过程而言，由于振荡持续
时间短、且对称地在发酵参数平均值上下波动，我们
提出了伴有短期周期性振荡现象的准稳态过程，其
动力学数据如表 (所示。
表 ( 酒精连续发酵试验数据
9+:;< ( =,>!. " (’. G H I，EA<+3J EA+A
K(） .8.-. .8.0. .8.6- .8(.. .8((4 .8(/.
! #（G H I） . .8(/ (58- ’.8’ -’80 //85
% #（G H I） 068’ 0580 /78- /58’ /’80 -080
& #（G H I） 48-- 08/- /874 /85- /84- /8’-
"#（FK(） .8’50 .80’7 .86’/ .8775 (8.40 (8(50
!. " ’.. G H I，1:E! #（F
K(） .8.(6 .8./. .8.45 .8(.. .8(’. .8(/4
! #（G H I） (/8/ 4(8/ 6486 ((.85 ((686 (’78.
% #（G H I） 7’8’ 468- 0486 //86 /.80 -08/
& #（G H I） /8. /86 /84 /8( /8/ /8.
"#（FK(） .80-. .8047 .86’5 (8.7’ (8(.0 (8’7’
!. " ’6. G H I，1:E! #（F
K(） .8.(6 .8.’4 .8.0- .8.6. .8(.4
! #（G H I） 7486 ((58’ (/-87 (508- ’(-8’
% #（G H I） 6680 558- 468- 0’8’ --80
& #（ G H I） -85 /8’ /8’ -84 -80
"#（FK(） .8/-. .8/55 .864( (8(4. (8.(0
! =AF+21; C12C<2A?+A@12E ;@EA<3 @2 9+:;< ( F+L< :<<2 *13@B@<3 :J
C12E@3?13DC<3 +23 +@? +>@2G
;1EE8
当 !#"!、%# %!（对于细胞生长而言）及 !
#"!!、%# %!（对于酒精生成而言）时，模型参数
".和$.分别为 .8.-和 .8’4’ F
K(；当 ! 、% 大于上述
相应参数时，!.和".的影响可以忽略。方程（/）、（4）
中的其他模型参数通过数值计算法得到，列入表 ’
中。
表 ’ 动力学特性参数
9+:;< ’ P+;D
K(） "! #（G H I） "$ H（G H I） %*+, H（G H I） !
.8/4- 7867 ’748’ (458. /
")*+ "!! #（G H I） "$! H（G H I） %! H（G H I） #
(804 ’-8/ ’.’.86 608. (
对于酵母细胞生长以及酒精生成而言，所能耐
受的最大酒精质量浓度是 (458. G H I，远高于以前
文献中报道的数值［4］，但非常接近最近研究工作报
道的极限值 ’-R（L）［(4］。在方程（/）和（4）中，引
·’6· 生物加工过程 第 ’卷第 ’期
万方数据
入酵母细胞的初始比生长速率和酒精的初始比生成
速率，校准了低浓度培养基及低稀释率条件下酿酒
酵母 ! ! "#$#%&’&(# 的动力学行为。)!和 )!!大于文献
［"，##］中的数值，表明在高产物酒精浓度和高底物
残糖浓度下酵母细胞对底物的亲和性降低。)*和
)*!与 !$ 基本上在一个数量级上，说明当底物浓度
较高时，底物抑制作用不可忽略。
实验数据与模型预测值的比较见图 % 和图 &。
对于酵母细胞生长，相关系数 +$ ’ (!")；对于酒精
生成相关系数 +$ ’ (!"%。由此可见本文建立的动
力学模型比较准确地反映了高浓度培养基条件下酿
酒酵母 ! ! "#$#%&’&(# 发酵的动力学特征。
图 % 酵母细胞生长动力学实验数据与模型预测值的比较
*+,!% -./012+3.4 .5 678 89082+/8461: ;161 <+67 678 /.;8: 028;+=6>
8; 5.2 ,2.<67
图 & 酒精生成动力学数据与模型预测值的比较
*+,!& -./012+3.4 .5 678 89082+/8461: ;161 <+67 678 /.;8: 028;+=6>
8; 5.2 582/84616+.4
! 结论
以上研究表明，不同低浓度培养基条件下的稳态
或拟稳态过程，在高浓度培养基条件下的酒精连续发
酵过程中，残糖浓度、酒精浓度和菌体生物量处于伴
有周期性振荡现象的准稳态。本文建立了酿酒酵母
生长和酒精生成的这一特定准稳态动力学模型。
参考文献：
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