全 文 ：第 34 卷第 23 期
2014年 0月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.23
Jan.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(31071744); 浙江省教育厅课题(Y201329611)
收稿日期:2014鄄04鄄16; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄05鄄19
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: han鄄insect@ 263.net
DOI: 10.5846 / stxb201404160745
周宁宁, 王梦馨,崔林,潘铖,张新亭,韩宝瑜.基于 COI基因全长序列的假眼小绿叶蝉地理种群遗传分化研究.生态学报,2014,34(23):6879鄄6889.
Zhou N N, Wang M x, Cui L, Pan C, Zhang X T, Han B Y.Genetic variation of Empoasca vitis (G觟the) (Hemiptera: Cicadellidae) among different
geographical populations based on mtDNA CO I complete sequence.Acta Ecologica Sinica,2014,34(23):6879鄄6889.
基于 CO I基因全长序列的假眼小绿叶蝉
地理种群遗传分化研究
周宁宁, 王梦馨, 崔摇 林, 潘摇 铖, 张新亭, 韩宝瑜*
(中国计量学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室, 杭州摇 310018)
摘要:假眼小绿叶蝉 Empoasca vitis (G觟the) 是我国大陆茶区分布最广、为害最重的茶树害虫,其种群世代重叠严重,数量大。 从
我国 13个主要产茶省份各选出一个重点产茶县(市),采集假眼小绿叶蝉标本,首次扩增得到其线粒体 CO I 基因全长序列,并
以此探讨了假眼小绿叶蝉 13个地理种群间的遗传多样性、分子变异、遗传分化程度及基因流水平。 在 13个地理种群中共得到
了 176条 CO I基因序列,发现了 113个变异位点,形成了 105个 CO I单倍型。 总群体单倍型多样性 Hd为 0.9720,种群内单倍
型多样性在 0.804 —1.000范围内,总群体和各种群的 Tajima忆s D检验结果均不显著,说明茶园假眼小绿叶蝉的进化符合中性模
型,种群数量较为稳定。 AMOVA分子变异分析结果表明,茶园假眼小绿叶蝉的遗传分化主要来自于种群内部。 Mantel 检验显
示各地理种群的遗传距离与地理距离之间不具有显著的相关性。 总群体的遗传分化系数 Gst 为 0.03652,固定系数 Fst 为
0郾 10876,基因流 Nm为 4.097,表明地理种群间存在较频繁的基因交流,遗传差异较小。 推测,20 世纪 90 年代以来的省际之间
频繁的茶树鲜叶贩运、异地茶苗的大批量调拨等因素促进了假眼小绿叶蝉的长距离迁移,加强了不同种群间的基因交流。
关键词:假眼小绿叶蝉; 线粒体 CO I; 遗传分化; 基因流
Genetic variation of Empoasca vitis (G觟the) (Hemiptera: Cicadellidae) among
different geographical populations based on mtDNA CO I complete sequence
ZHOU Ningning, WANG Mengxin, CUI Lin, PAN Cheng, ZHANG Xinting, HAN Baoyu*
Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China
Abstract: The tea green leafhopper, Empoasca vitis(G觟the), is one of the most important tea鄄plant pests that causes
significant losses on tea leaf production throughout all growing regions in mainland of China. The multiple occurrences of the
overlapping generations of this pest have led to serious infestation on tea leaves. Adults were collected from the thirteen
primary tea鄄producing provinces respectively, with each representing one geographic population in the southeastern China.
The complete sequences of the entire mtDNACO I gene (x bp) of E. vitis were compared among 13 populations. The genetic
structure of these populations was further investigated based on the CO I DNA sequences. A total of 176 CO I gene complete
sequences with 113 variable sites and 105 haplotypes were obtained. The haplotype diversity index (Hd) was 0.9720 among
all populations, ranging from 0.804 to 1.000 within single population. The Tajima忆s D tests for all populations or each single
population did not reach any significant level, which suggest that the evolution and the abundance of E. vitison tea
plantations remained on quantitative level, which fits well with the neutral model. The Results of ANOVA analyses
demonstrated that genetic differentiation of E. vitis mainly occurred within populations. The Mantel test disclosed that the
genetic distance among populations was not correlated with the geographic distance. Among the 13 populations, the total
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genetic differentiation coefficient (Gst) was 0.03652, the total fixation index (Fst) was 0.10876, and the gene flow (Nm)
was 4.097. This indicates that the high level of gene exchange does exist in the different geographical populations, but not in
genetic variation. We believe that the massive and frequent transportation and plantation of fresh tea leaves and seedlings in
different host plant locations among 13 provinces since the 1990s promote the long鄄distance migration of E. vitis and
reinforce the gene flow among these geographically different populations.
Key Words: Empoasca vitis (G觟the); mtDNA CO I; genetic differentiation; gene flow
摇 摇 假眼小绿叶蝉 Empoasca vitis (G觟the) 隶属于半
翅目(Hemiptera) 、叶蝉科(Cicadellidae)、小绿叶蝉
属(Empoasca),广泛分布于我国大陆茶区,繁殖快,
世代重叠严重,抗药性强,防治难度大,是我国茶树
上为害最重的害虫。 常年假眼小绿叶蝉可致长江中
下游茶区夏、秋茶减产 10%—15%,严重发生年份达
50%以上[1]。 研究者们对于假眼小绿叶蝉生物学习
性、地理分布、危害损失估计和防治等进行了深入的
研究[2鄄3],但关于其地理种群遗传和分化情况的报道
甚少,仅应用 RAPD鄄PCR 技术鉴定了茶园小绿叶蝉
类的优势种[4]。 我国幅员辽阔,茶树广泛种植于秦
岭淮河以南的祖国南半壁,各茶区的自然地理条件
差别大,茶树种植制度不同,可以造就不同地理区域
的种群或生态型;另一方面,假眼小绿叶蝉成虫善爬
善跳还具有一定的飞行能力,若虫也善于爬行和跳
跃,成、若虫能适应各种茶园生境。 如果这种非远距
离的扩散连续地或渐次地发生,则有可能使得不同
地理区域的种群发生基因交流[5]。
随着分子系统地理学的发展,分子标记技术越
来越多地应用到分子系统学研究中。 mtDNA具有严
格遵循母系遗传,不发生重组、倒位、易位等突变现
象以及进化速率快等特点,而常被用于分析昆虫物
种间及物种内种群的分化程度[6鄄7]。 CO I 基因是线
粒体蛋白编码基因之一,密码子第三位碱基可相对
自由变异[8]。 且 CO I 的演化速率是其他线粒体蛋
白编码基因的 3倍,两端序列相对保守,是较好的分
子标记[9鄄10],已被用于研究玉米黄翅叶蝉 Dalbulus
maidis、黄条脊冠叶蝉 Aphrodes leafhoppers 等叶蝉的
遗传多样性[11鄄12]。
目前主要以 CO I 基因的部分序列进行遗传多
样性研究。 本实验首次扩增得到我国 13 个主要茶
叶种植省份的茶园假眼小绿叶蝉线粒体 CO I 基因
的全长序列,通过滑动窗口分析确定其突变位点的
分布,并发现了茶园假眼小绿叶蝉线粒体 CO I 基因
存在不完整的终止密码子。 再利用此序列分析了茶
园假眼小绿叶蝉种群间的遗传多样性、遗传分化程
度、基因流水平及分子变异情况等,以探讨长期的地
理阻隔对其种群遗传特性的影响及其生态适生性、
以及该叶蝉自身扩散和人工助迁等因素造成的种群
变异,为针对不同地理区域假眼小绿叶蝉种群的控
制策略提供参考。
1摇 材料和方法
1.1摇 供试虫源
本实验所用茶园假眼小绿叶蝉,在 2011 年 10
月—2013年 10月期间采集于山东青岛、河南西九华
山、江苏苏州、安徽敬亭山、湖北英山、四川乐山、重
庆永川、江西婺源、浙江兰溪、湖南长沙、福建武夷
山、广西桂林、和云南勐海等 13 个产茶省的重点产
茶县市,详情见表 1。 采集的成虫和若虫浸泡于无水
乙醇中,放置于-20益长期保存备用。
1.2摇 基因组 DNA的提取
取单头假眼小绿叶蝉,放在加有适量液氮的 1.5
mL离心管中,用无菌的研磨棒磨成粉末,采用动物
组织快速提取试剂盒(VWI),按照试剂盒说明书步
骤进行基因组 DNA 提取。 从提取的 DNA 样品中取
1 滋L 用 Nanodrop 2000c 仪器 ( Thermo Scientific 公
司)和 1%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度,基因
组 DNA保存于-20益备用。
1.3摇 CO I基因全长扩增和序列测定
根据叶蝉科线粒体 CO I 基因两端的保守区域,
设计特异性引物用于扩增 CO I基因全长序列(扩增
产物包括 CO I 基因两端的侧翼序列,5忆包括基因
NADH 脱氢酶亚基 2 的部分序列,以及 tRNATrp、
tRNACys、tRNATyr 3 个相连的 tRNA 序列;3忆端包括
tRNALeu(UUR)序列以及 CO II 基因部分序列)。 引物
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序 列: CO I鄄F ( 正 向 引 物 ): 5忆鄄 AACAACAGC
TTTCTAGAAATTTGC鄄 3忆, CO I鄄R (反向引物): 5忆鄄
TTCCATAGTTGGTGAAGAAGC鄄3忆。 扩增片段的长度
约为 1773 bp。
表 1摇 假眼小绿叶蝉地理种群采集信息及供试个体数量
Table 1摇 Collecting data and number of assayed individuals of Empoasca vitis (G觟the) in this study
种群代码
Population code
采集地点
Sampling location
地理坐标
Geo鄄coordinates
采集时间
Collection date
分析个体数
Number of individuals assayed
SDQD 山东青岛 36.28毅N, 120.32毅E 2013.1 12
HNXJHS 河南西九华山 31.81毅N, 115.81毅E 2013.08 12
JSSZ 江苏苏州 31.06毅N, 120.37毅E 2012.11 12
AHJTS 安徽敬亭山 30.97毅N, 118.69毅E 2012.07 18
HBYS 湖北英山 30.80毅N, 115.78毅E 2013.08 15
SCLS 四川乐山 29.60毅N, 103.55毅E 2011.1 15
CQYC 重庆永川 29.38毅N, 105.90毅E 2012.11 11
JXWY 江西婺源 29.26毅N, 117.85毅E 2013.05 12
ZJLX 浙江兰溪 29.12毅N, 119.47毅E 2011.1 17
HNCS 湖南长沙 28.18毅N, 113.08毅E 2012.11 12
FJWYS 福建武夷山 27.65毅N, 117.96毅E 2013.06 11
GXGL 广西桂林 25.29毅N, 110.35毅E 2013.06 12
YNMH 云南勐海 21.99毅N, 100.42毅E 2011.1 18
摇 摇 PCR反应体系总体积为 25 滋L,含 2.0 滋L 的基
因组 DNA 作为模板,2. 5 滋L 10 伊PCR Buffer (Mg2+
plus), 2 滋L dNTP,16 滋L ddH2O,1 滋L CO I鄄F,1 滋L
CO I鄄R,0.5 滋L Taq DNA 聚合酶。 PCR 扩增程序:
94益预变性 3 min,94益变性 30 s,52益退火 30 s,
72益延伸 2 min,35 个循环,最后 72益延伸 10 min。
PCR产物经电泳检测确认成功扩增后,委托上海桑
尼生物科技有限公司测序。
1.4摇 数据整理与分析
测序结果通过 Chromas 软件读取,用 DNAMAN7.0
对序列进行编辑,去除两端的侧翼序列。 用 Clustal
X 1.8软件进行多序列同源比对,并辅以人工校对,
生成用于 MEGA5.1 软件分析的数据格式[13]。 将整
理后的序列在 NCBI 网站上进行 BLAST 比对,确定
目标序列。 使用 MEGA5.1 软件分析碱基组成、变异
位点及碱基转换颠换比;基于 Kimura鄄 2鄄Parameter 模
型计算种群间的遗传距离;以琉璃叶蝉 Homalodisca
vitripennis CO I 基因全长序列作为外群,采用 NJ 邻
接法构建单倍型系统发育树,系统发育树各分支的
置信度(bootstrap)均进行 1000 次重复检验[14]。 采
用 NETWORK4.6.1.2软件绘制单倍型间的进化网络
图[15]。 利用 DnaSP5.0软件分析 13个种群内的单倍
型多样性 Hd、核苷酸多样性 Pi、核苷酸平均差异数
k,种群间核苷酸平均差异数 Kxy、核苷酸歧义度
Dxy、遗传分化系数 Gst 与固定系数 Fst 等分子遗传
学系数,同时生成滑动窗口,分析突变位点在全长序
列中的分布,并进行 Tajima忆s D 中性检验[16鄄17]。 应
用 Arlequin 3软件进行 AMOVA分子变异分析,判断
遗传分化的主要来源是种群内或种群间[18]。 通过
GenALEx 6.41软件检验种群间的遗传距离与地理距
离的自然对数矩阵之间的相关性[19]。
2摇 结果与分析
2.1摇 茶园假眼小绿叶蝉线粒体 CO I 基因全长序列
及滑动窗口分析
通过整理去除测序结果两端侧翼序列,得到茶
园假眼小绿叶蝉线粒体 CO I基因全长序列,为 1534
bp。 该基因没有完整的终止密码子,最后一个碱基
为 T。 从已报道的研究中可知,许多半翅目昆虫,如
琉璃叶蝉 Homalodisca vitripennis(GenBank 登录号:
NC _ 006899. 1 )、 青 蛾 蜡 蝉 Geisha distinctissima
(GenBank登录号:NC_012617.1) [20鄄21]以及红头凤沫
蝉 Paphnutius ruficeps(GenBank 登录号:NC_021100.
1) [22],其线粒体 CO I基因以不完全终止密码子(T)
作为停止信号,与本研究所得结果一致。 在 13 个种
群 176个个体中共发现突变位点 113 个,约占全长
的 7.37%,其中有 7 个位点的突变引起了氨基酸的
改变(359,798,967,1175,1316,1330,1422)。 单一
1886摇 23期 摇 摇 摇 周宁宁摇 等:基于 CO I基因全长序列的假眼小绿叶蝉地理种群遗传分化研究 摇
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多态位点 40个,简约信息位点 73 个,未发现碱基缺
失或插入现象。 由表 2可知,在所有核苷酸替换中,
转换的发生频率占 87.61%,而颠换仅占 12.39%。 其
中腺嘌呤(A)与鸟嘌呤(G)之间的转换占总转换数
的 30.8%,胞嘧啶(C)与胸腺嘧啶(T)之间的转换占
56.81%,值得注意的是, T 转换为 C 的比例高达
43郾 68%。 总体转换 /颠换偏倚率 R 值为 7.01。 据研
究发现,通常亲缘关系较近的分类阶元之间核苷酸
替换主要为转换,而在亲缘关系较远的分类阶元之
间,核苷酸替换率则以颠换为主[23鄄24]。 本研究发现
茶园假眼小绿叶蝉种内线粒体 CO I 基因核苷酸突
变位点的变异类型以转换为主,验证了上述规律。
表 2摇 假眼小绿叶蝉 CO I基因碱基替换情况
Table 2摇 The basepair substitution of CO I gene in the Empoasca vitis (G觟the)
碱基 Basic group 腺嘌呤 AAdenine A
胸腺嘧啶 T
Thymine T
胞嘧啶 C
Cytosine C
鸟嘌呤 G
Guanine G
腺嘌呤 A Adenine A 2.74 0.82 11.4
胸腺嘧啶 T Thymine T 1.66 13.13 0.98
胞嘧啶 C Cytosine C 1.66 43.68 0.98
鸟嘌呤 G Guanine G 19.4 2.74 0.82
摇 摇 通过软件 DnaSP5.0 滑动窗口分析 CO I 全长序
列,结果见图 1。 从图中可以看到,序列间的突变位
点在绝大部分区段内均有分布。 其中,在 400 bp 左
右、700 bp 到 800 bp 之间,1200 bp 和 1300 bp 左右
有较多的突变位点;前 200 bp,900 bp 左右,1100 bp
左右的突变位点较少。 由此可见,与使用基因的部
分序列进行遗传分化分析相比,使用序列的全长能
够包含更丰富的信息。
图 1摇 序列间突变位点的滑动窗口分析
Fig.1摇 Sliding window analysis of variable sites among all
sequences摇
窗口长度为 75 bp,相邻窗口相互覆盖 1 / 3窗口长度
2.2摇 茶园假眼小绿叶蝉 CO I 基因单倍型系统进化
分析
从已获得的 176 条 CO I 基因全长序列中定义
了 105 种单倍型:Hap1—Hap105。 其中 Hap5 为共
享单倍型,在所有种群中出现 24 次,占所有种群的
13.64%。 其余频率较高的单倍型有:Hap16 出现 13
次(7.39%),Hap3 和 Hap26 出现 9 次(5.11%)。 在
105种单倍型中,有 84 种单倍型是由单个种群所特
有的独享单倍型。 由单倍型系统发育树(图 2,图中
仅显示大于 30%的置信度值 bootstrap)可以看出,在
几个大分支中置信度较低,说明这些单倍型之间的
差异较小,不能形成可靠的分支。 而各种群的单倍
型分散在不同的分布群中,未形成明显的系统地理
结构。 图 3是茶园假眼小绿叶蝉 mtDNA CO I 基因
105 种单倍型间的进化网络图,表现了各地理种群单
倍型的分布情况,以及单倍型之间的演化关系。 每
种颜色代表一个种群的单倍型组成。 没有单倍型存
在的那些节点是单倍型进化过程中的中间节点。 单
倍型 Hap71在进化网络的较为中心位置,而其他几
种出现频率较高的单倍型则处于边缘。 由图 3 中可
以看到,各地理种群的单倍型散布于整个网络图中,
每个种群由多种较为原始的单倍型演化产生的单倍
型共同组成。 说明种群间存在基因交流,分化程度
较小。
2.3摇 茶园假眼小绿叶蝉不同地理种群的遗传多样
性、种群间的基因流及遗传分化分析
各种群 CO I基因单倍型、核苷酸多样性分析及
Tajima忆s D中性检验结果如表 2 所示。 由表可知,13
个种群的总体单倍型多样性指数 Hd 为 0.9720,种群
间核苷酸多样性指数 Pi 为 0.00607。 种群内核苷酸
多样 性 在 0. 00413—0. 00651 范 围 内, 平 均 为
0郾 00546 。其中单倍型多样性最高的种群是福建武
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图 2摇 利用邻接法构建的假眼小绿叶蝉不同地理种群 CO I单倍型间的系统发育树
Fig.2摇 Neighbor joining phylogenetic tree of haplotypes of different geographic populations of Empoasca vitis (G觟the) based on CO I
gene sequence
夷山(FJWYS),而云南勐海(YNMH)最低。 核苷酸
多样性最高和最低的种群分别为湖南长沙(HNCS)
和安徽敬亭山(AHJTS)。
对各个地理种群的茶园假眼小绿叶蝉 CO I 基
因全长序列基于 Tajima忆s D值进行中性检验(表 3),
检测结果均不显著,全部种群均为 P>0.10,说明茶园
假眼小绿叶蝉种群的进化过程遵循中性进化模型,
各地理种群在进化过程中没有出现群体扩张,群体
大小保持相对稳定。
表 3摇 假眼小绿叶蝉 CO I基因单倍型、核苷酸多样性分析及 Tajima忆s D中性检验
Table 3摇 CO I haplotype diversity, nucleotide diversity and Tajima忆s D neutrality test in different geographic populations of Empoasca vitis
(G觟the)
种群代码
Population
code
单倍型
Haplotype
单倍型多样性
Haplotype d
iversity
(Hd)
核苷酸多样性
Nucleotide
diversity
(Pi)
核苷酸平均
差异数
Average number
of Nucleotide
difference (k)
Tajima忆s D
中性检验显著性
Statistical
significance
ZJLX Hap1—13 0.926 0.00541 8.294 1.30855 P > 0.10
YNMH Hap14—22 0.804 0.00437 6.699 0.3107 P > 0.10
SDQD Hap16,23—28 0.879 0.00497 7.62121 -1.15821 P > 0.10
SCLS Hap5,29—38 0.933 0.00614 9.419 -1.15821 P > 0.10
JXWY Hap5,39—47 0.955 0.00595 9.121 -1.1604 P > 0.10
JSSZ Hap5,7,48—56 0.985 0.0065 9.985 -1.03223 P > 0.10
HNXJHS Hap5,16,52,57—62 0.939 0.00597 9.152 -1.05377 P > 0.10
3886摇 23期 摇 摇 摇 周宁宁摇 等:基于 CO I基因全长序列的假眼小绿叶蝉地理种群遗传分化研究 摇
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续表
种群代码
Population
code
单倍型
Haplotype
单倍型多样性
Haplotype d
iversity
(Hd)
核苷酸多样性
Nucleotide
diversity
(Pi)
核苷酸平均
差异数
Average number
of Nucleotide
difference (k)
Tajima忆s D
中性检验显著性
Statistical
significance
HNCS Hap26,34,48—49,63—68 0.97 0.00651 9.985 -1.3644 P > 0.10
HBYS Hap5,16,69—78 0.962 0.00422 6.476 -0.92055 P > 0.10
GXGL Hap5,8,12,16,26,79—83 0.97 0.00582 8.924 -0.93822 P > 0.10
CQYC Hap5,26,43,84—90 0.945 0.00535 8.2 0.65308 P > 0.10
FJWYS Hap5,52,56,91—96 1 0.00556 8.533 -0.80342 P > 0.10
AHJTS Hap5,26,28,71,89,97—105 0.967 0.00413 6.333 -1.37285 P > 0.10
总群体 Total Hap1—105 0.972 0.00607 9.311 -1.65533 0.10 > P > 0.05
图 3摇 105 种 mtDNA CO I基因 单倍型的进化网络关系
Fig.3摇 Median鄄joining network of 105 mtDNA CO I gene haplotypes
H1—H105表示单倍型,圆的面积表示单倍型在样品中出现的频率,彩色扇形面积代表各种群在同一单倍型中所占的比例
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摇 摇 应用 DnaSP5.0 软件计算反映茶园假眼小绿叶
蝉种群间基因差异程度的遗传学参数。 各种群间核
苷酸差异数 Kxy 在 6.47778—13.37500 之间,均值为
8.98383;核苷酸歧义度 Dxy 在 0.00422—0.00872 之
间,均值为 0.00586(表 4)。 各地理种群总遗传分化
系数 Gst为 0.03652,总固定系数 Fst为 0.10876,总基
因流 Nm 为 4. 097,固定系数 Fst 在 - 0. 04168—
0郾 43061之间。 其中云南勐海(YNMH)种群与其他
种群的遗传分化程度最大(表 5)。 说明种群间分化
程度低,基因交流频繁。
通过 AMOVA 分子变异分析结果可以看出,不
同地理种群之间的变异方差组分为 0.59490(占方差
比率的 12. 66%),而种群内的方差组分为 4. 10510
(占方差比率的 87.33%)且差异显著(P<0.05) (表
6)。 说明这 13 个茶园假眼小绿叶蝉地理种群的遗
传分化主要来自于种群内部,种群间的差异较小。
从表 7可知,各个地理种群之间的遗传距离在
0.0042—0.0088之间。 应用 Mantel 相关性检验计算
两个矩阵之间的相关系数 r 为-0.0697(P = 0.5373>
0.05,1000次随机抽样),表明这两个矩阵之间没有
显著的相关性,即不同种群之间的遗传分化程度与
地理隔离没有显著关系。
3摇 讨论
同行专家们也发表了少量关于茶园叶蝉类种群
分化和基因流的研究报道。 在印度茶小绿叶蝉
Empoasca flavescens F. 是茶树上的优势种,印度孟加
拉邦的茶小绿叶蝉因茶园管理模式的不同引起了种
群的遗传分化[26]。 在普通茶园中主要依靠喷施化
学农药进行防治,而有机茶园主要依靠茶树品种的
抗虫性与施用微生物农药防治,在这两种管理模式
下,茶小绿叶蝉面临不同的选择压力,造成了不同管
理模式的种群间差异大于相同管理模式下的种群间
差异。 在我国也有关于茶园假眼小绿叶蝉种群分化
的初步研究,采用 RAPD分子标记技术,探讨了我国
7个省份的茶园假眼小绿叶蝉的遗传差异及其亲缘
关系[4]。
基于前人的相关成果,本研究采用线粒体 CO I
基因全长序列,对我国主要产茶省份的茶园假眼小
绿叶蝉不同地理种群的遗传多样性、遗传分化程度、
基因流水平及分子变异进行了解析,建立了单倍型
系统发育树和进化网络图。 依据几十年来的茶园叶
蝉类发生和为害观察、标本收集及鉴定,茶园中约有
10余种叶蝉,但优势种是假眼小绿叶蝉,其个体数占
茶园叶蝉个体数的 99.99%以上[27],这个百分率很稳
定,不随时间、地点的变化而改变,本研究的供试虫
态都是成虫,供试标本采集时间从 2011 年 10 月至
2013年 10月,采到的标本立即浸入无水乙醇中,数
小时之后就保存于-20益备用,可尽量消除采集时间
因素对于试验结果的影响。 在 13 个种群 176 个个
体中共发现突变位点 113 个,核苷酸替换以转换为
主。 突变位点在整个区段内均有分布,但不同位置
的进化速率有所不同。 共产生 105 种单倍型,具有
较高的单倍型多态性。 其中单倍型 Hap5 为共享单
倍型,这种单倍型可认为是能够适应环境变化并在
种群中稳定存在的优势单倍型,该单倍型很有可能
就是祖先单倍型[28鄄29];在所有的单倍型中,有 84 种
是独享单倍型,是由单个种群所特有的。 各地理种
群内具有较为丰富的单倍型多样性,表明茶园假眼
小绿叶蝉对于不同环境具有较强的生存能力,这与
假眼小绿叶蝉广泛存在于各种茶园环境中的情况一
致。 从单倍型系统发育树来看,单倍型的分布与其
所在的地理单元之间不存在明显的对应关系。
Tajima忆s D检验是基于种内多态性的一种中性检验
方法,可反映出物种种群变化动态的历史。 统计值
为正值时说明序列进化方式为平衡选择,且有一些
单倍型分化;负值时为负向选择,种群的扩张存在瓶
颈效应。 本实验中总群体和各个地理种群的检测结
果均不显著,说明茶园假眼小绿叶蝉种群的进化过
程遵循中性进化模型,过去没有出现群体扩张和持
续性增长,群体大小保持相对稳定[17]。 固定系数 Fst
是一种种群间遗传距离的测度参数[30],从本实验的
Fst值上看不同地理种群之间存在一定程度的遗传
分化。 基因流即群体间基因交流,是种群遗传结构
均质化的主要因素之一,具有高水平基因流的种群
间往往比具有有限基因流的种群间的遗传分化程度
小[31]。 本实验中总基因流 Nm为 4.097>4,当 Nm>4
时,种群间的基因交流比较充分,均质化作用足以抵
制遗传漂变的作用,一定程度上抵消种群间的遗传
分化[32]。 通过 AMOVA 分子变异分析可以看出,假
眼小绿叶蝉的遗传分化主要来自于种群内部,种群
间的差异较小。 通过 Mnatel检验可知,不同种群之
5886摇 23期 摇 摇 摇 周宁宁摇 等:基于 CO I基因全长序列的假眼小绿叶蝉地理种群遗传分化研究 摇
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间的遗传分化程度与地理距离没有显著关系。
综上所述,认为假眼小绿叶蝉种群的进化过程
遵循中性进化模型,群体大小保持相对稳定,这与茶
园中假眼小绿叶蝉每年保持高发生量的情况相吻
合,因为许多茶区每年假眼小绿叶蝉发生时间、发生
量和施药次数基本不变,每年都是 10 多次。 假眼小
绿叶蝉种群间存在一定程度的遗传分化,这是因为
我国幅员广大,不同茶园所在的自然地理条件存在
较大差异,不同地理种群之间的假眼小绿叶蝉可能
存在着生物学和生态学特征的差异而有一定遗传分
化。 而较为充分的基因交流带来的均质化作用,在
一定程度上抵消了种群间的遗传分化。 种群间假眼
小绿叶蝉充分的基因交流主要源于假眼小绿叶蝉自
然迁移和人为传播两方面的原因。 假眼小绿叶蝉成
虫本身具有一定的飞行扩散能力,能适应各种地理
环境,这种近距离的扩散行为一直在进行中,能够引
起不同种群间一定程度的基因交流。 相比于茶园假
眼小绿叶蝉的自然迁移,人为助迁的作用十分突出。
在许多茶人们的印象中,20世纪 50年代省际茶区之
间假眼小绿叶蝉的体色等特征是有差异的,可能意
味着大尺度的自然地理景观条件下该叶蝉种群存在
生态型的差异。 然而,20 世纪 90 年代以后,省内茶
区之间、省际之间茶树鲜叶的异地加工十分活跃,帮
助了茶园假眼小绿叶蝉的大规模迁移,比如,近些年
来从早春至深秋,黔、川、渝、皖南、豫南茶区鲜叶源
源不断地调往浙、苏茶区加工以获得高价出售,这些
鲜叶夹带了大量的假眼小绿叶蝉成虫、若虫和卵,它
们随着茶树鲜叶在 1—3 日内迁移几百—几千 km;
闽南、闽北茶区茶苗不断调往浙、苏南、皖南、鲁南和
豫南等茶区,浙西茶区的安吉白茶茶苗持续调往周
边各省茶区。 到达新区的假眼小绿叶蝉很快适应了
当地茶园环境,经过几百代的世代更替,使得假眼小
绿叶蝉不同地理种群生态型的差异逐渐消失。 这也
解释了为何假眼小绿叶蝉的遗传分化主要来自于种
群内部、种群间的差异较小、以及种群之间的遗传分
化程度与地理距离没有显著关系。
需要一提的是:来自西南边陲的云南勐海种群
(YNMH)在所有种群中单倍型多样性 Hd 最小,与其
他种群的遗传分化程度最大,与其他种群之间的遗
传距离也最大,而除云南以外其他种群之间的差异
比较一致。 这说明了云南的茶园假眼小绿叶蝉相比
较于其他种群来说处于一个相对封闭的环境中,与
其他种群基因交流较小。 这是因为云南的茶树多为
乔木型、半乔木型,茶园地理环境、气候和植被、以及
茶叶内含物等显著区别于其他假眼小绿叶蝉种群所
在茶区的相应因素。 而且采集 YNMH种群的云南的
茶园处于原始森林,交通不便、人迹罕至,该假眼小
绿叶蝉种群较为独立,与其他种群的交流较少。
本研究首次扩增得到茶园假眼小绿叶蝉 CO I
基因的全长序列,并将其应用到种群间的遗传分化
研究中。 与使用 CO I 基因的部分序列进行遗传分
化分析相比,使用序列的全长包含了更丰富的信息,
获得了充分的变异位点及较为全面的遗传学数据。
在下一步的研究中,还需要配合其他分子标记,比如
线粒体的控制区以及核基因上的分子标记,增加试
验采样点及样本数量,进一步加深对中国茶园假眼
小绿叶蝉种群间关系及遗传机制的研究。
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