全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (6): 616–622, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00616
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收稿日期: 2013-01-30; 接受日期: 2013-05-30
基金项目: 山西省回国留学人员科研资助项目(No.2011-061)和转基因生物新品种培育重大专项(No.2011ZX08003-001)
* 通讯作者。E-mail: yangswallow163@163.com
基于GFP观察的花粉介导植物转基因方法的细胞学研究
李娜1, 孙毅2, 3, 杨利艳1*
1山西师范大学生命科学学院, 临汾 041004; 2山西省农业科学院生物技术研究中心, 太原 030031
3农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室, 太原 030031
摘要 花粉介导的植物转基因方法不需要组织培养过程, 且操作简便易行。为明确该方法的细胞学基础, 以离体玉米(Zea
mays)郑单958花粉为材料, 在超声波作用下将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒与花粉共处理, 对处理过的花粉进行体
外培养及人工授粉, 并利用荧光显微镜对GFP基因在玉米花粉粒、花粉管及胚中的表达进行示踪观察。结果表明: 处理组
和对照组均有部分花粉粒呈强烈的绿色荧光, 因此通过观察花粉粒荧光来确定GFP基因是否表达不可靠; 处理组花粉管较
对照呈现强烈的绿色荧光; GFP基因在玉米胚中表达可以作为鉴定转化体的证据。该实验首次利用荧光观察为花粉介导植
物转基因方法提供了可视的细胞学证据。
关键词 细胞学观察, 绿色荧光蛋白, 花粉介导转化, 超声波
李娜, 孙毅, 杨利艳 (2013). 基于GFP观察的花粉介导植物转基因方法的细胞学研究. 植物学报 48, 616–622.
植物转基因技术的出现为加速培育植物新品种
提供了有力的工具, 但是目前商业化生产中广泛应用
的转基因作物仅有少数几种, 如玉米(Zea mays)、大
豆(Glycine max)、棉花(Gossypium hirsutum)、油菜
(Brassica campestris)和番茄 (Lycopersicon escu-
lentum)等。缺少高效、实用的转基因方法是阻碍转
基因技术产生更大效益的重要原因。传统的转基因方
法, 如农杆菌介导法和基因枪法都需要建立具有很强
基因依赖性的再生体系, 且或具宿主局限性缺点或需
昂贵的设备, 这些都极大地限制了转基因技术的应
用。因此, 许多研究者致力于探求操作简单且无需繁
冗复杂的再生过程的转基因方法。其中, 借助植物天
然的生殖系统来实现外源基因在植物整体水平上的
转化被公认为是最具潜力的转化方法。花粉由于数量
多、易获得, 且外源基因可以直接以裸露的DNA形式
或农杆菌介导进入, 所以是理想的转化受体(Eapen,
2011)。因此, 如果在授粉前将外源基因导入花粉, 进
行人工授粉, 那么外源基因就可能会借助植物正常授
粉受精过程进行表达; 当受精卵整合有外源基因时,
就可以得到转基因种子。
由于以花粉为外源基因载体进行转化操作简单,
故有很强的实用性。因为花粉的细胞壁较厚, 再加上
花粉粒在萌发时会释放出大量的核酸酶(Booy et al.,
1989), 所以用传统的方法很难将外源基因导入花粉
中, 早期的研究未得到转化体(Matoušek and Tupý,
1983; Sanford et al., 1985; Roeckel et al., 1988)。
Hess和Dressler(1989)在授粉前对花粉进行农杆菌
侵染得到了转化的受精卵, 但该实验结果未能被重复
(Shou et al., 2002)。孙毅等(1999)提出了超声波处理
花粉介导植物基因转化方法。Wang等(2001)首次报
道了用超声波处理花粉成功地获得了转基因玉米。随
后, 用该方法获得的转基因高粱(Sorghum bicolor)
(Wang et al., 2007)和油菜(Wang et al., 2008)等相
继问世。超声波处理花粉介导植物转基因方法成功地
实现了以花粉为载体对外源基因的转化, 并成为我国
具有自主知识产权的转基因技术, 已引起了许多研究
者的兴趣(Eapen, 2011)。目前对该方法的研究多集
中于其应用及优化(Wang et al., 2001, 2007, 2008;
崔贵梅等, 2012), 关于该方法的细胞学基础研究尚
未见报道。GFP(green fluorescent protein)基因是转
基因研究中备受青睐的报告基因, 其表达产物——绿
色荧光蛋白在蓝光激发下能发出绿色荧光, 可直接被
·研究报告·
李娜等: 基于 GFP观察的花粉介导植物转基因方法的细胞学研究 617
观察到且无需破坏植物的组织, 因此利用GFP对外
源基因的表达途径进行示踪具很大的优越性。玉米的
花粉较多, 便于进行花粉介导的转基因研究。本研究
通过超声波处理花粉介导植物基因转化方法对玉米
花粉进行GFP基因的转化, 借助对GFP基因的观察
追踪外源基因整合到植物基因组的过程, 从而明确该
转基因方法的细胞学基础, 以期为深入探讨该转基因
方法的机理、完善并发展该基因转化方法提供基础资
料。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α, 内含质粒
pLM01, 由美国爱荷华州立大学植物转基因中心Kan
Wang教授馈赠。质粒图谱见图1。
植物材料使用玉米(Zea mays L.)郑单958, 种植
于山西省农业科学院小麦研究所。
1.2 方法
1.2.1 菌株的活化与培养
配制LB液体及固体培养基(5 g·L–1酵母粉; 10 g·L–1蛋
白胨粉; 10 g·L–1NaCl; 12 g·L–1琼脂粉), 调pH值至
7.5。高压蒸汽灭菌 , 于超净工作台上加入抗生素
Ampicillin, 使其终浓度为50 mg·L–1。用无菌接种针
从培养皿上挑取大肠杆菌于LB固体培养基, 37°C过
夜培养至长出单菌落, 挑取单菌落接种于LB液体培
养基中, 37°C下每分钟250转振荡培养。

1.2.2 质粒DNA的提取
采用碱裂解法提取质粒DNA(Sambrook and Russell,
2002), 并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 花粉培养液及培养基的制备
根据前人对玉米花粉体外培养液的研究(郝曜山等,
2005; 崔贵梅等, 2012), 我们采用使花粉萌发率高、
花粉管生长势好且存活率较高的溶液作为玉米花粉
体外培养液, 其配比如下: 15%Sucrose、50 mg·L–1
H3BO3、300 mg·L–1CaCl2、200 mg·L–1MgCl2、100
mg·L–1KNO3和35 mg·L–1赤霉素, 同时制备相应的固
体培养基。


图1 pLM01质粒图谱
质粒中含有增强的GFP基因(EGFP), 其启动子和终止子分别
为2×35S CaMV及Tvsp, 增强子为TEV, 质粒的筛选标记为
Ampicillin抗性基因。

Figure 1 Map of pLM01
The EGFP gene with 2×CaMV 35S promoter (35S) and a
tobacco etch virus 5′ untranslated region (TEV) and a soy-
bean vegetative storage protein terminator (Tvsp); Ampicillin
(Apr)—resistant marker gene for bacterial selection.


1.2.4 超声波处理玉米花粉
花粉的采集: 于前一天下午对雄穗套袋并去除旧花
药 , 次日10:00–11:00轻轻敲打雄穗收集玉米花粉 ,
为防止花粉吸水降低活力, 在采集的花粉中加入硅胶
颗粒干燥剂(蓝色颗粒), 置于4°C冰箱中保存备用。
花粉的超声波处理: 取0.2 g花粉悬浮于20 mL花
粉体外培养液中, 使用超声波仪(BILON-650Y, 上海
勃朗)进行第1次超声波处理。随后将溶解于双蒸水中
的质粒DNA加入花粉悬浮液中, 混匀, 进行第2次超
声波处理。为防止超声波处理时由于温度过高而导致
花粉失活, 可将花粉悬浮液置于碎冰上处理。本实验
以加入质粒DNA的花粉为处理组, 未加质粒的花粉
为对照组。通过前期对超声波处理参数的筛选, 我们
采用的参数为: 200 W, 处理时间为5秒, 间隔10秒,
处理6次。

1.2.5 GFP基因表达的观察
采用荧光显微镜(U-LH100HG, OLMPUS)对GFP基
因的表达进行观察。用蓝光激发, 激发波长为495
nm。同一组织或器官图像的采集均在同一曝光时间
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下进行。
GFP基因在花粉粒及花粉管中表达的观察: 用
滴管吸取少量超声波处理后的花粉悬浮液置于载玻
片上, 放入铺有湿润滤纸的培养皿中, 同时取花粉悬
浮液滴于固体培养基上, 在室温25°C下加盖培养。
0.5小时后即可进行观察, 每半小时观察记录1次。
GFP基因在玉米胚中表达的观察: 将超声波处
理过的花粉悬浮液弃上清后, 用软毛刷蘸取沉积于烧
杯底部的花粉涂抹到事先套袋的玉米花丝上进行人
工授粉。授粉后15天取果穗, 用刀片解剖幼嫩籽粒,
挑出幼胚置于载玻片上进行观察。
2 结果与讨论
2.1 不同处理下的花粉粒
对2组玉米花粉粒液体培养后进行观察, 发现在蓝光
激发下, 加有GFP质粒的处理组有部分花粉粒呈强
烈的绿色荧光(图2A); 但无GFP质粒的处理(对照组)
同样有部分花粉粒呈强烈的绿色荧光(图2B)。花粉在
固体培养基上的观察结果与在液体培养基上的相同。
为排除基因污染可能造成的假象, 本实验对采集的玉
米花粉粒未经任何处理直接进行液体培养观察, 结果
仍有部分花粉粒呈现强烈的绿色荧光。因此, 我们认
为不能通过对花粉粒绿色荧光的观察来确定是否为
转化的花粉粒。
2.2 GFP基因在玉米花粉管中的表达
花粉在0.5小时后开始萌发, 在液体培养时可见花粉
管也有自发荧光, 但远比花粉粒弱(图3A)。当花粉培
养在固体培养基上时, 对照组花粉管在蓝光激发下无
明显绿色荧光(图4A′), 在白光下呈透明管状(图4C′,
箭头所示), 而处理组中可见花粉管在蓝光激发下呈
强烈的绿色荧光(图4A)。上述观察结果表明, 处理组
的部分花粉粒经超声波处理后, 携带有GFP基因的
质粒能够进入花粉, 并随着花粉的萌发在花粉管中表
达。但由于花粉粒在蓝光激发下强烈自发荧光的干扰,
我们很难判断GFP基因是否在花粉粒中表达。
2.3 GFP基因在玉米胚中的表达
分别将处理组与对照组玉米幼胚取出, 置于荧光显微
镜下观察, 处理组部分玉米幼胚在蓝光激发下发出强
烈的绿色荧光, 而对照组的荧光明显弱于处理组(图
5A)。对随机取样的2穗进行统计, 处理组2个果穗共
形成32颗籽粒, 其中15个籽粒的胚在蓝光激发下呈
现强烈的绿色荧光, 占所形成籽粒的46.9%, 而对照
组则无一籽粒的胚有强烈的绿色荧光。以上对玉米胚
的观察表明, 外源基因能够随花粉的萌发进入胚囊并
整合到受精卵中, 随着受精卵的发育形成携带外源基



图2 不同处理下玉米花粉粒的观察(拍照时均采用相同的曝光时间)
(A) 蓝光激发下处理组花粉粒; (B) 蓝光激发下对照组花粉粒

Figure 2 The fluorescence images of treated and untreated maize pollen grains (The pictures were taken with the same ex-
posure time)
(A) The image of treated pollen grain under blue light; (B) The image of control pollen grain under blue light
李娜等: 基于 GFP观察的花粉介导植物转基因方法的细胞学研究 619


图3 玉米花粉粒及花粉管的自发荧光(液体培养)
(A)、(B)和(C) 分别为蓝色激发光、叠加光及白光下对照组花粉粒及花粉管

Figure 3 The auto-fluorescence of pollen grains and pollen tubes of maize (cultured in liquid medium)
(A), (B) and (C) Images of pollen grains and pollen tubes under blue light, combination lights and white light, respectively




图4 GFP基因在玉米花粉管中的表达(拍照时相应图像均采用相同的曝光时间)
(A)、(B)和(C) 分别为蓝色激发光、叠加光及白光下处理组花粉管; (A′)、(B′)和(C′) 分别为相应的对照组花粉管。

Figure 4 The expression of GFP gene in pollen tubes of maize (The corresponding pictures were taken with the same exposure
time)
(A), (B) and (C) were the image of pollen tubes from treatment group under blue light, combination lights and white light, re-
spectively; (A′), (B′) and (C′) were the image of pollen tubes from control group under blue light, combination lights and white
light, respectively.

因的转化胚。
2.4 讨论
玉米为一年生禾本科草本植物, 是世界上最主要的粮
食作物之一, 其花粉量大且易于获得, 适于进行花粉
介导的转基因方法操作。通过对玉米花粉的形态观察,
可以看到其花粉粒上存在萌发孔(Suen and Huang,
2007); 超声波的空化作用可促进外源基因对细胞的
620 植物学报 48(6) 2013


图5 GFP基因在玉米胚中的表达
(A)、(B)和(C) 分别为玉米胚在蓝色激发光、叠加光及白光下的图像。每个图片中, 左侧的胚为对照组, 右侧的胚为处理组。

Figure 5 The expression of GFP in maize embryo
(A), (B) and (C) were the embryo images under blue light, the combination lights and white light, respectively. For each picture,
the left embryo was from the control group and the right one from the treatment group.


转化(Chen et al., 2010)。本实验中, 第1次超声波处
理的目的是使花粉粒表面的核酸酶失活, 避免其降解
外源DNA; 第2次加入质粒DNA后再进行超声波处
理, 目的在于使外源基因通过萌发孔进入花粉粒, 从
而借助玉米自然的生殖系统完成外源基因与受体基
因组的整合。
利用花粉作为外源基因的载体进行转化时, 最大
限度地保证花粉的活力是提高花粉转化的前提。由于
本实验是在夏季进行, 空气湿度大, 花粉很容易吸
湿, 在采集的花粉中加入硅胶颗粒干燥剂, 保存于
4°C冰箱中对维持花粉活力有很好的效果。鉴于花丝
发育时期的不同会影响授粉结果(李金才等, 2002),
故在授粉时选择花丝长出苞叶2–3 cm的雌穗。此外,
超声波处理参数也是影响实验结果的重要因素。在超
声波处理后, 我们观察到有很多花粉粒破裂, 花粉存
活率降低意味着能够整合外源基因的花粉基数降低。
因此在使用超声波处理花粉介导转基因方法时, 寻找
能提高外源基因的转化效率并能降低花粉破裂率的
超声波处理参数非常重要。同时, 该基因转化方法也
适用于花粉量大的植物。
在实验中我们发现, 花粉管和胚在蓝色激发光下
均能产生较弱的自发绿色荧光, 这对观察GFP基因
表达会产生干扰。因此, 在进行图像采集时, 对处理
组和对照组同一部位要采用相同的曝光时间。GFP基
因在花粉管中的表达观察借助固体培养基效果较好。
另外, 在今后的研究中也可考虑采用诸如红色荧光蛋
白基因等进行观察。在本实验中我们还发现, 玉米花
粉粒在蓝光激发下比其它组织或器官有较强的自发
荧光(绿色), 在对大量玉米花粉粒进行观察的同时,
我们还对其它植物材料如石榴(Psidium guajava)和
泡桐属(Paulownia)植物的花粉粒进行了处理及观察,
结果发现有类似现象。因此我们认为通过对花粉粒绿
色荧光的观察来判断GFP基因是否在花粉粒中表达
不可靠, 因而对一些利用绿色荧光强弱来筛选转化花
粉粒的报道表示质疑(Ottenschlager et al., 1999)。
花粉管穿过珠孔进入胚囊后破裂, 释放出2个精
子, 一个预定与卵细胞融合形成合子, 另一个定向同
中央细胞融合形成初生胚乳核。因为这个过程时间很
短, 所以我们未能捕捉到。但转化胚的获得标志着精
卵结合过程的完成, 同时也意味着转基因种子的获
得。实际上这一过程中胚乳是否被转化并不重要。我
们认为在利用这一方法进行基因转化时, 转化胚的形
成可能有2条途径: 一是超声波处理使外源基因进入
萌发孔直接整合到精细胞染色体上, 之后随着精卵结
合再整合到受体基因组中; 另一种可能是外源基因在
超声波的作用下进入花粉粒, 但并不与精细胞结合,
李娜等: 基于 GFP观察的花粉介导植物转基因方法的细胞学研究 621
而是随着花粉管萌发和生长进入胚囊, 之后在精细胞
与卵细胞结合的过程中一起整合到受体基因组中。这
两种方式都有可能, 原因在于被子植物的精子缺少细
胞壁, 是只有质膜包被的裸细胞; 在植物受精过程
中 , 精子进入时 , 卵细胞尚未形成细胞壁 (Johri,
1984; Zhu et al.,1993), 类似原生质体的精细胞和卵
细胞, 故为外源基因的进入提供了可能。
本研究中, 我们通过对GFP基因表达的示踪观
察(从花粉萌发到胚的形成)首次为花粉介导的植物转
基因方法提供了直接可视的细胞学证据, 弥补了花粉
介导植物转基因方法研究的一个空白, 这将有助于简
单易行的花粉介导的植物转基因新方法的推广和进
一步完善, 从而推动我国乃至世界植物分子育种的进
程, 加快培育更多的优良植物新品种。
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622 植物学报 48(6) 2013
Cytological Study of Pollen-mediated Plant Transformation
Method Based on GFP Observation
Na Li1, Yi Sun 2, 3, Liyan Yang1*
1School of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China; 2Biotechnology Research Centre, Shanxi
Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China; 3Key Laboratory of Crop Gene Resources and
Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031, China
Abstract Pollen-mediated gene transformation does not require tissue culture and is easy to apply. In the present study,
we investigate the cytological basis for the transformation approach. Fresh pollen was taken from maize plants (Zea mays
cv ‘Zhengdan 958’) and treated under ultrasonication mixed with plasmid DNA harboring green fluorescence protein
(GFP) gene. Treated pollen was artificially pollinated onto silks of maize ears. The expression of GFP gene in pollen
grains, pollen tubes and embryo were observed under a fluorescence microscope. Pollen grains had a strong green
autoflorescent background and so were not suitable for observing the expression of exotic GFP gene. Treated pollen
tubes produced strong green florescence as compared with the control. The expression of GFP gene in embryo could be
used to confirm the expression of exotic genes. Our study provides cytological evidence for pollen-mediated transforma-
tion.
Key words cytological observation, GFP, pollen-mediated transformation, ultrasonication
Li N, Sun Y, Yang LY (2013). Cytological study of pollen-mediated plant transformation method based on GFP observa-
tion. Chin Bull Bot 48, 616–622.
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* Author for correspondence. E-mail: yangswallow163@163.com
(责任编辑: 孙冬花)