全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (1): 1–10, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00001
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收稿日期: 2011-09-01; 接受日期: 2011-10-15
基金项目: 国家重点基础研究发展计划(No.2009CB119104)和国家自然科学基金(No.30830010)
* 通讯作者。E-mail: qingyin.zeng@ibcas.ac.cn
高山松及其亲本种油松和云南松DHAR基因的功能分化
考洪娜1, 2, 兰婷1, 王晓茹1, 曾庆银1*
1中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要 高山松(Pinus densata)是油松(P. tabulaeformis)与云南松(P. yunnanensis)自然杂交产生的同倍性杂种, 分布于青
藏高原东南缘, 占据了油松和云南松两个亲本种都不能正常生长的高海拔地带。为了揭示高山松、油松和云南松脱氢抗坏
血酸还原酶(DHAR)基因的组成和功能分化, 分别从高山松、油松和云南松中克隆到2类DHAR基因(DHAR1与DHAR2)。组
织表达模式分析表明, 这6个基因在根、韧皮部、叶和芽中均有表达; 通过系统发育分析发现, 高山松在物种形成过程中保
留了油松的DHAR1拷贝以及云南松的DHAR2拷贝; 酶学性质分析则表明, 高山松与油松DHAR1蛋白对底物具有相似的催
化活性、催化效率、最适pH和热力学稳定性, 但其催化活性比云南松DHAR1蛋白高约300倍。高山松DHAR2蛋白对底物
的催化活性和热力学稳定性均高于油松DHAR2蛋白。高山松DHAR基因在生化功能上显示出优于或类似亲本DHAR, 这种
优势功能的选择与杂种独特的生态适应性可能有重要的相关性。
关键词 适应性, DHAR, 功能分化, 自然杂种, 蛋白质功能
考洪娜, 兰婷, 王晓茹, 曾庆银 (2012). 高山松及其亲本种油松和云南松DHAR基因的功能分化. 植物学报 47, 1–10.
高山松(Pinus densata)是油松(P. tabulaeformis)
与云南松(P. yunnanensis)自然杂交产生的二倍体杂
种, 是植物同倍体杂交物种形成的案例(Wang et al.,
2001)。高山松是中国重要的高山森林树种, 广泛分
布于西藏东南部、四川西部和云南西北部海拔2 700–
4 200 m的高山地带; 云南松分布于云南大部和贵
州、广西西北部及四川西部海拔600–3 100 m地带;
油松分布于吉林南部、辽宁、河北、河南、山东、山
西、内蒙古、陕西、甘肃、青海、四川等省区海拔100–
2 000 m地带(毛建丰等 , 2007; Mao and Wang,
2011)。3个种分别处于不同生境, 在分布区边缘形成
少量重叠。目前推测高山松的起源和成种过程与青藏
高原的隆起相关。青藏高原隆起时, 剧烈的地理和气
候变化为杂种基因型提供了生存和扩展空间, 最终,
高山松占据了其2个亲本种在气象历史上都不能正常
生长的高海拔地带, 形成大面积稳定的纯林(Wang
et al., 2001)。高山松作为油松和云南松的二倍体杂交
种, 杂交成种过程中没有涉及染色体倍性的变化, 能
在青藏高原上良好地生长、生殖, 反映了其独特的适
应性(Mao et al., 2009; Wang et al., 2011)。高山松的
这些特性使其成为研究同倍性杂交物种形成的独特
体系。
还原型抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)是植物体
内重要的还原剂, 可清除由光合作用、呼吸作用等氧
化反应产生的超氧自由基、过氧化氢和羟自由基等活
性氧自由基(Chen and Gallie, 2006)。AsA在活性氧
清除的过程中被氧化形成单脱氢抗坏血酸, 单脱氢抗
坏血酸被进一步自氧化形成双脱氢抗坏血酸(dehy-
droascorbic acid, DHA), DHA在脱氢抗坏血酸还原
酶(dehydroascorbate reductase, DHAR, EC1.8.5.1)
的催化作用下与谷胱甘肽(glutathione, GSH)偶联,
再循环形成AsA(Smirnoff et al., 2001)。因此, DHAR
对维持植物细胞中还原性抗坏血酸的水平具有重要
意义。DHAR广泛存在于植物的叶绿体、线粒体和细
胞质中, 不仅参与植物细胞中AsA的再生, 而且广泛
地参与植物的抗逆反应。比如, 在马铃薯(Solanum
tuberosum)中过量表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)
DHAR基因可使转基因植株对臭氧和干旱胁迫的抗
性增强(Eltayeb et al., 2006); 而在拟南芥中过量表
达水稻(Oryza sativa)DHAR基因可提高转基因拟南
·研究论文·
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芥对盐胁迫的抗性(Ushimaru et al., 2006)。这些研究
说明, 植物细胞中维持较高水平的DHAR活性增强了
植物对逆境胁迫的耐受性。本研究从与植物适应性密
切相关的脱氢抗坏血酸还原酶基因入手, 综合系统发
育、基因表达模式、蛋白质结构与功能分析, 探索高
山松DHAR基因的亲本来源构成及适应机理, 进而为
该同倍性杂交物种的适应性进化成种提供分子佐证。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验以高山松(Pinus densata Mast.)、云南松(Pinus
yunnanensis Franch.)和油松 (Pinus tabulaeformis
Carr.)的种子为材料。高山松采集于西藏林芝(94.4°E、
29.2°N), 云南松采集于云南昆明(102.6°E、24.9°N),
油松采集于中国科学院植物研究所北京植物园内
(116.2°E、39.9°N)。
1.2 方法
1.2.1 DHAR基因的序列鉴定与命名
根据杨树(Populus trichocarpa)、拟南芥(Arabidopsis
thaliana)和水稻(Oryza sativa)的全长DHAR蛋白序
列, 利用TBLASTN程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/)扫描GenBank中火炬松(Pinus taeda) EST
数据库, 获得与DHAR基因具有较高相似性的2组序
列。将获得的序列经NCBI保守结构域数据库CDD判
读, 确定序列编码的蛋白具有DHAR典型结构域特
征。我们将这2组序列分别命名为PtaDHAR1 (Gen-
Bank® Accession No. CO165970) 和 PtaDHAR2
(GenBank® Accession No. DN614482)。

1.2.2 高山松、油松和云南松DHAR基因的克隆
取高山松、油松和云南松幼苗组织各0.1 g, 按照
Aurum Total RNA Kit (BIO-RAD)提供的说明书提
取总RNA。并以总RNA为模板, 通过RNA PCR Kit
(AMV) Ver.3.0反转录试剂盒(TaKaRa), 将总RNA反
转录合成cDNA。以火炬松PtaDHAR1和PtaDHAR2
序列为模板, 设计2对引物: PtaDHAR1-CL1/2 (Pta-
DHAR1-CL1, 5’-AGAGGAGGAAGATTGGCAGTA-
3’; PtaDHAR1-CL2, 5’-ATGCTTTGTGAGGCCATT-
TAT-3’)和PtaDHAR2-CL1/2(PtaDHAR2-CL1, 5’-GG
GGAAGTTCTATTCATTCATCA-3’; PtaDHAR2-CL2,
5’-AAGAGTGGTCTAGGGATATAAATTG-3’), 引物
由Invitrogen公司合成。以油松、云南松和高山松cDNA
为模板, 利用2对引物进行PCR扩增。PCR产物经1%
琼脂糖凝胶电泳检测, 目的条带割胶回收纯化, 纯化
产物连接到pGEM-T载体(Promega)中。将构建好的重
组质粒转化大肠杆菌JM109感受态 , 在X-gal/IPTG
Amp平板上挑取多个阳性克隆进行双向测序。

1.2.3 系统发育关系分析
将克隆获得的高山松、油松和云南松DHAR基因编码
的蛋白序列与其它植物DHAR蛋白序列通过Clustal X
1.83进行氨基酸序列比对, 然后经BioEdit手动校对。
利用MEGA v.4.0软件的neighbour-joining(NJ)模型
构建系统进化树, bootstrap值为1 000。

1.2.4 高山松、油松和云南松DHAR基因的组织表达
分布
为了研究DHAR基因在高山松、油松和云南松不同组
织中的表达模式, 我们以自然生长状态下的树苗为研
究对象, 分别提取油松、云南松和高山松的根、茎、
叶3个组织的总RNA, 然后反转录合成cDNA。根据油
松、云南松和高山松DHAR基因的序列分别设计特异
性引物进行RT-PCR扩增, 然后对PCR产物测序。

1.2.5 高山松、油松和云南松DHAR蛋白的表达与纯化
通过定向克隆技术将高山松、油松和云南松DHAR基
因的编码序列亚克隆到带有6×His标签的PET30a表
达载体中, 转化大肠杆菌BL21感受态细胞。将经测序
验证正确的重组表达菌于含50 μg·mL–1卡那霉素的
LB培养基中培养过夜, 以1:100稀释后扩大培养至
A600为0.6, 加入IPTG至终浓度0.1 mmol·L–1, 37°C诱
导过夜。诱导表达后的菌液于4°C、6 500 × g离心10
分钟后收获菌体, 用缓冲液A(20 mmol·L–1咪唑、0.5
mmol·L–1NaCl、20 mmol·L–1Na3PO4, pH 7.5)重悬,
冰上超声破碎裂解。然后4°C、10 000 × g离心10分
钟, 分别取少量原菌液、超声破碎离心后的上清液和
沉淀, 经SDS-PAGE检测是否具有目的蛋白, SDS-
PAGE检测采用10%的分离胶和5%的浓缩胶。蛋白质
纯化用Ni亲和柱(Amersham Pharmacia Biotech)。首
先用缓冲液A平衡Ni亲和柱, 将超声破碎后离心获得
考洪娜等: 高山松及其亲本种油松和云南松 DHAR基因的功能分化 3
的上清液上样, 然后以缓冲液A平衡, 最后用缓冲液
B(0.5 mmol·L–1咪唑、0.5 mmol·L–1NaCl、20 mmol·L–1
Na3PO4, pH 7.5)洗脱目的蛋白, 收集目的蛋白洗脱峰
进行下一步酶学活性分析。

1.2.6 高山松、油松和云南松DHAR蛋白的酶学性质
测定
植物DHAR基因是植物谷胱甘肽转移酶(glutathione
transferase, GST)超家族的一个亚家族。本实验以
GSH(glutathione)为第一底物, 5种GST蛋白常见底
物作为第二底物, 对融合蛋白进行测定。第二底物分
别包括CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)、DCNB
(1,2-dichloro-4-nitrobenzene)、NBD-Cl(7-chloro-4-
nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole)、 NBC(4-nitrobenzyl
chloride)和DHA(dehydroascorbic acid)。CDNB、
DCNB和NBC的活性测定采用Habig等(1974)的方法;
NBD-Cl的活性测定采用Ricci等(1994)的方法; DHA
(dehydroascorbate)的催化活性测定采用Edwards和
Dixon(2005)的方法。酶促动力学分析以GSH和DHA
为底物 , 固定GSH的浓度 , 利用不同浓度梯度对
DHA底物进行蛋白活性测定。酶热力学稳定性分析
中, 将酶在设定温度下孵育15分钟, 在孵育结束后检
测酶对DHA底物的催化活性。pH依赖的酶活性测定
方法是在25°C下, 测定酶在不同pH缓冲液中的催化
活性。所有反应至少设3次独立重复实验。

1.2.7 DHAR蛋白的结构模拟
选取氯离子通道蛋白(PDB: 1k0o和2yv7)的X衍射晶
体结构为模板, 以Align 2D程序(Insight II的Homo-
logy模块)进行序列比对, 运用Insight II的Modeler模
块构建蛋白质三维结构, 由此产生10个结构。每个结
构再产生10个不同的环区结构, 优化水平为高等。以
Profiles-3D对各个结构进行评价, 选取最优的蛋白
结构。
2 结果与分析
2.1 油松、云南松和高山松DHAR基因的序列分析
在高山松、油松和云南松中分别克隆到2组DHAR基
因, 第1组基因分别被命名为PdDHAR1、PtDHAR1
和PyDHAR1, 这3个基因的cDNA序列均含有648 bp
的开放阅读框(包括终止密码子), 编码215个氨基酸
残基的蛋白质, 预测分子量分别为24.4 kDa、24.35
kDa和24.35 kDa。第2组基因分别被命名为Pd-
DHAR2、PtDHAR2和PyDHAR2, 这3个基因的cDNA
序列均含有681 bp的开放阅读框(包括终止密码子),
编码蛋白包含226个氨基酸残基, 预测分子量分别为
26.03 kDa、25.96 kDa和26.03 kDa。虽然PdDHAR2
和PyDHAR2的cDNA序列有差异, 但是其编码的蛋
白序列完全相同。
通过对高山松、油松和云南松DHAR基因的蛋白
质序列进行序列同源性分析发现(图1), 第1组3个
DHAR蛋白(PdDHAR1、PtDHAR1和PyDHAR1)的序
列相似性分别为98.1%、98.6%和99.5%; 第2组3个
DHAR蛋白(PdDHAR2、PtDHAR2和PyDHAR2)的序
列相似性分别为99.1%、99.1%和100%; 但是第1组
和第2组DHAR蛋白的序列相似性范围是44.2%–
45.1%, 2组DHAR蛋白的序列有显著差异 (t test
P<0.000 1)。
2.2 系统发育分析
选取5个代表不同进化历史的陆地植物物种的DHAR
基因为研究对象, 包括苔藓植物小立碗藓(Physco-
mitrella patens)、蕨类植物江南卷柏 (Selaginella
moellendorffii)、裸子植物白云杉(Picea glauca)、单
子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥, 在基因组和EST
数据库中搜索其DHAR同源序列。由于DHAR基因是
GST超基因家族成员, 将植物GST超基因家族的其
它类型, 包括Tau、Phi和Lambda GST序列也加入到
系统发育分析中。系统发育树显示, 所有DHAR聚成
一大枝, 支持率为100%(图2), 表明本研究克隆的6
个基因为DHAR基因。3个高山松、油松和云南松
DHAR1聚成一枝, 而3个DHAR2聚成另一枝, 表明3
个高山松、油松和云南松DHAR1基因是直系同源基
因, 另外3个DHAR2基因也是直系同源基因。
我们发现所有DHAR基因聚成两小枝, D1和D2
(图2), 每一小枝中均有小立碗藓、江南卷柏、白云杉、
油松、云南松和高山松, 表明在陆地植物形成的早期,
DHAR基因发生了1次古老的基因重复事件。在D1枝
中包含苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物的
DHAR基因, 而D2这一枝中仅仅包含苔藓植物、蕨类
植物和裸子植物的DHAR基因, 说明D2枝中的拷贝
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图1 高山松、油松和云南松DHAR蛋白的序列比对
黑色阴影部分表示2类DHAR蛋白均保守的序列, 黄色阴影部分表示DHAR1蛋白保守的序列, 蓝色阴影部分表示DHAR2蛋白保守
的序列。

Figure 1 Sequence alignment of DHAR proteins from Pinus densata, P. tabulaeformis and P. yunnanensis
Conserved residues in all DHARs are marked in black. Residues marked in yellow and blue indicate conserved residues in
DHAR1 and DHAR2 proteins, respectively.


在被子植物中可能丢失。而重复事件产生的2个重复
基因拷贝在油松、云南松和高山松中都被保留了
下来。
以Tau类GST为外类群, 对高山松、油松和云南
松6个DHAR构建系统树(图3)。对于DHAR1基因, 高
山松PdDHAR1和油松PtDHAR1聚在一起, 其序列最
相近, 与云南松PyDHAR1关系稍远; 而对于DHAR2
基因, 高山松PdDHAR2则与云南松PyDHAR2关系
最近。系统进化关系显示, 在高山松物种形成过程中,
对于DHAR1基因 , 高山松选择保留了油松的拷贝 ;
而对于DHAR2基因 , 高山松选择保留了云南松的
拷贝。
2.3 高山松、油松和云南松DHAR基因的组织表达
分布
我们通过RT-PCR分析高山松、油松和云南松DHAR
基因在正常生长条件下不同组织(根、茎、叶)中的表
达分布。RT-PCR扩增后对PCR产物进行测序, 结果
显示6个DHAR基因在所有组织中均表达(图4)。这表
明6个DHAR基因是组成型表达基因, 可能在松树的
考洪娜等: 高山松及其亲本种油松和云南松 DHAR基因的功能分化 5


图2 植物DHAR与其它类型GST蛋白的系统发育分析

Figure 2 Phylogenetic relationship between plant DHAR and other classes of plant GSTs






图3 高山松、油松和云南松DHAR的系统发育分析

Figure 3 Phylogenetic tree showing relationships between
the DHARs from Pinus densata, P. tabulaeformis and P.
yunnanensis

生长发育中发挥着重要作用。
2.4 高山松、油松和云南松DHAR蛋白表达、纯化
及酶活性分析
由于PdDHAR2和PyDHAR2基因编码相同的蛋白序
列 , 所以在本研究中构建了5个DHAR蛋白(PdDH-
AR1、PtDHAR1、PyDHAR1、PdDHAR2和PtDHAR2)
的表达质粒。将构建的表达质粒分别转化到大肠杆菌
BL21感受态细胞中, 经IPTG诱导后发现5个DHAR
蛋白都能在大肠杆菌中高效表达。通过镍柱亲和层析
纯化后, 获得纯化的重组蛋白(图5), SDS-PAGE结果
显示纯化的蛋白分子量与预测的蛋白大小一致。
DHAR是植物GST基因家族的成员, 由于植物
GST对多种底物如CDNB、NDB-Cl、DHA等具有广
泛的活性(Basantani and Srivastava, 2007), 所以在
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图4 高山松、油松和云南松DHAR基因的组织表达模式分析
第1–3泳道分别代表根、茎、叶3个组织部位。

Figure 4 Expression of the DHAR genes in various tissues
of Pinus densata, P. tabulaeformis and P. yunnanensis
Lanes 1–3: Root, stem and needle.


本研究中我们分别测定了5个高山松、油松和云南松
DHAR蛋白对DHA、NBD-CI、CDNB、NBC和DCNB
五种底物的活性。结果发现5个蛋白只对DHA具有催
化活性, 说明这5个蛋白均具有脱氢抗坏血酸还原酶
活性。其中PdDHAR1、PtDHAR1和PyDHAR1的酶
学活性分别为1.492 µmol·min–1per mg、1.498 µmol·
min–1per mg和0.005 µmol·min–1per mg; PdDHAR2
和PtDHAR2的酶学活性则分别为0.388 µmol·min–1
per mg和0.285 µmol·min–1per mg。
2.5 DHAR蛋白的酶动力学研究
由于高山松、油松和云南松DHAR蛋白只对DHA底物
具有催化活性, 所以我们测定了DHAR蛋白对该底物
的酶动力学参数。由于PyDHAR1的活性太低, 本研
究只测定 PdDHAR1、 PtDHAR1、 PdDHAR2和
PtDHAR2这4个蛋白的动力学参数(表1)。动力学分析
显示, PdDHAR1和PtDHAR1两个蛋白的KmDHA值分
别为0.434 mmol和0.963 mmol, 说明PdDHAR1对底
物DHA的亲和力是PtDHAR1的2倍。但是2个蛋白对
DHA的催化效率 (kcat/Km)相似。对于PdDHAR2和
PtDHAR2蛋白, PtDHAR2对底物DHA的亲和力和催
化效率均高于PdDHAR2。


图5 高山松、油松和云南松DHAR蛋白在大肠杆菌BL21中的
表达与纯化
泳道1为分子量标准; 泳道2为大肠杆菌全菌蛋白; 泳道3、5、7、
9和11分别是诱导表达PdDHAR1、PdDHAR2、PyDHAR1、
PtDHAR1和PtDHAR2的全菌蛋白; 泳道4、6、8、10和12分别
是纯化后的PdDHAR1、PdDHAR2、PyDHAR1、PtDHAR1和
PtDHAR2蛋白。

Figure 5 Overexpression and purification of DHAR proteins
from Pinus densata, P. tabulaeformis and P. yunnanensis
Lane 1: Molecular mass markers; Lane 2: Total cellular ex-
tract from E. coli BL21; Lanes 3, 5, 7, 9 and 11: Total cellular
extracts from induced bacteria containing PdDHAR1,
PdDHAR2, PyDHAR1, PtDHAR1 and PtDHAR2, respec-
tively; Lanes 4, 6, 8, 10 and 12: The purified PdDHAR1,
PdDHAR2, PyDHAR1, PtDHAR1 and PtDHAR2, respec-
tively.


表1 DHAR蛋白对底物DHA的酶动力学分析
Table 1 Steady state kinetic constants of the Pinus DHAR
proteins towards substrate DHA
Proteins Km
(mmol)
Vmax
(μmol·min–1·
mg–1)
kcat
(S–1)
kcat/Km
(mmol–1·
S–1)
PdDHAR1 0.434±0.017 2.054±0.027 5.737 13.218
PtDHAR1 0.963±0.050 5.223±0.191 14.35 14.898
PdDHAR2 1.123±0.019 0.880±0.012 0.491 0.438
PtDHAR2 0.349±0.008 0.567±0.004 0.825 2.363

2.6 热力学稳定性分析
由于PyDHAR1对DHA的活性太低, 本研究只测定
PdDHAR1、PtDHAR1、PdDHAR2和PtDHAR2这4
个蛋白的热力学稳定性(图6A)。结果显示, PdDHAR2
蛋白的热力学稳定性与其它3个蛋白相比有较大差
异。PdDHAR2在50°C时还保持着最高活性的87%,
但当温度高于50°C时, 蛋白活性急剧下降, 55°C时只
剩下8%的活性, 表明PdDHAR2蛋白在50°C以下都
是稳定的, 是一个热稳定性较高的酶。而PdDHAR1、
考洪娜等: 高山松及其亲本种油松和云南松 DHAR基因的功能分化 7

图6 PdDHAR1、PtDHAR1、PdDHAR2和PtDHAR2蛋白的热力学稳定性(A)和最适pH(B)

Figure 6 Thermal stability (A) and pH profiles (B) of PdDHAR1, PtDHAR1, PdDHAR2 and PtDHAR2 proteins


PtDHAR1和PtDHAR2在50°C时分别只保有其最高活
性的27%、27%和31%, 且活性随着温度的升高一直
下降, 显示这3个蛋白具有相似的、相对于PdDHAR2
较低的热稳定性。
2.7 pH依赖的酶活性分析
在25°C下, 测定了4个重组蛋白在不同pH下的酶活力
(图6B)。结果显示PdDHAR1、PtDHAR1、PdDHAR2
和PtDHAR2对DHA的最适pH分别为7.5、7.5、8.0和
8.5, 说明这4个酶都在偏碱性的环境中发挥作用。其
中PdDHAR2和PtDHAR2在pH7.5–9.5之间保持着
80%以上的最高活性, 而PdDHAR1和PtDHAR1保持
最高活性的80%时 , pH值范围是7–8, 表明PdDH-
AR1和PtDHAR1的最适pH范围比PdDHAR2和Pt-
DHAR2窄。PdDHAR2和PtDHAR2的最适pH范围较
宽, 在pH9.5的环境下还能保持最高活性的80%以上,
表明这2个蛋白能在强碱性环境中发挥作用。
2.8 蛋白质结构模拟
图7展示模拟的高山松、油松和云南松5个DHAR蛋白
的三维结构。所有DHAR蛋白均具有典型的谷胱甘肽
转移酶(GST)结构, 包括2个结构域: 由α螺旋和β折
叠组成的硫氧还原蛋白结构域(N末端结构域)以及由
多个α螺旋组成的C末端结构域, 2个结构域由10个左
右氨基酸残基组成的linker相连接。DHAR蛋白的N末


图7 高山松、油松和云南松DHAR蛋白的三维结构比较

Figure 7 Structure modelling of DHAR proteins from Pinus
densata, P. tabulaeformis and P. yunnanensis


端结构域氨基酸大约组成了蛋白全长的1/3, 包括1个
βαβαββα结构域 , C末端结构域则占整个蛋白质的
2/3。对5个DHAR蛋白的结构重叠比较发现, 在α螺旋
和β折叠区域结构比较保守, 而loop区域和linker区域
的蛋白质构象有比较大的变异。
3 讨论
脱氢抗坏血酸还原酶是抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的
重要限速酶, 对维持植物细胞AsA水平有重要意义,
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而且广泛地参与植物的抗逆反应。在我们先前的研究
中, 发现DHAR基因在蕨类植物江南卷柏、裸子植物
白皮松和双子叶植物杨树中均为组成型表达基因
(Lan et al., 2009; Yang et al., 2009; 成子硕等 ,
2011)。对小麦(Triticum aestivum)的2个DHAR基因
(TaDHAR1和TaDHAR2)的研究发现, DHAR基因在
小麦各器官中均表达(余春梅等, 2009)。在本研究中,
利用RT-PCR并结合PCR产物测序, 我们发现高山
松、油松和云南松6个DHAR基因在各组织中均表达
(图4)。这一系列研究结果预示着在蕨类植物、裸子植
物、单子叶植物和双子叶植物中DHAR基因可能均是
组成型表达基因, 在植物的生长发育中可能发挥着重
要作用。
系统发育分析发现, 植物DHAR基因分为DHA-
R1和DHAR2两种类型(Clade D1和Clade D2, 图2)。
在小立碗藓中存在2种类型的DHAR基因, 说明在陆
地植物形成的早期, DHAR基因发生了1次古老的基
因重复事件。第1种类型的DHAR基因在苔藓植物、
蕨类植物、裸子植物和被子植物中都存在, 说明这类
DHAR基因在整个陆地植物中是保守的, 功能也可能
是保守的。对于第2种类型的DHAR基因, 我们搜索了
GenBank数据库中的所有核酸、EST以及基因组数
据, 仅仅发现其在苔藓植物、蕨类植物和裸子植物中
存在, 说明第2种类型的DHAR基因在被子植物中可
能丢失。非常有意思的是, 我们发现第1类DHAR蛋白
对DHA的酶活性往往高于第2类DHAR蛋白。比如, 我
们先前的研究发现江南卷柏SmDHAR1对DHA的活
性是SmDHAR2的116倍(成子硕等, 2011); 而在本研
究中, 高山松PdDHAR1对DHA的活性是PdDHAR2
的3.8倍。2类DHAR酶学活性的显著差异表示2类
DHAR基因可能存在功能上的分化。
蛋白序列比对发现, 云南松PyDHAR1与高山松
PdDHAR1和油松PtDHAR1有很高的序列相似性, 分
别为98.1%和98.6%, 但是PdDHAR1和PtDHAR1对
DHA的酶活性比PyDHAR1高近300倍。比较模拟的
三维结构发现这3个蛋白的结构高度保守, 但是分析
与底物结合的活性口袋区域, 发现有1个位点的氨基
酸发生变异, 即第113位氨基酸位点, 在PyDHAR1中
是Glu, 而PdDHAR1和PtDHAR1中则是Lys(图8)。
Glu和Lys是生化性质完全相反的2类氨基酸, Glu侧链
有一个羧基, 是带负电荷的酸性氨基酸, 而Lys侧链
有一氨基, 是带正电荷的碱性氨基酸。在活性位点区
域生化性质完全不同的氨基酸替换可能对催化活性
有重要影响。
对高山松同倍性杂交物种形成的生态遗传学研
究发现, 高山松与其亲本种油松和云南松在形态变异
模式和对生态因子的适应性上表现为混合型, 即一部
分性状高出亲本种, 而另一部分性状呈现出居中、较
低或者与亲本种类似的适应性(毛建丰等, 2007; Mao
et al., 2009; Mao and Wang, 2011)。本研究发现高
山松PdDHAR1基因继承了油松拷贝的酶学性质, 对
底物DHA的活性远高于云南松PyDHAR1。高山松
PdDHAR2基因类似云南松, PdDHAR2对DHA的催
化活性略高于油松PtDHAR2, 而在热力学稳定性上,
PdDHAR2显著区别于其它几个DHAR蛋白, 是一个
热稳定性较高的酶, 可能有利于适应温差变化大的环
境。高山松DHAR基因在生化功能上显示出优于或类
似亲本拷贝, 并且形成了优势组合, 这种优势功能的



图8 PdDHAR1、PtDHAR1和PyDHAR1的三维结构比较

Figure 8 Structural comparison of PdDHAR1, PtDHAR1 and PyDHAR1 proteins
考洪娜等: 高山松及其亲本种油松和云南松 DHAR基因的功能分化 9
选择与高山松对环境的适应性进化之间可能存在一
定联系。
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10 植物学报 47(1) 2012
Functional Divergence of Dehydroascorbate Reductase Genes in
Pinus densata, P. tabulaeformis and P. yunnanensis
Hongna Kao1, 2, Ting Lan1, Xiaoru Wang1, Qingyin Zeng1*
1State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing
100093, China; 2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract Plant dehydroascorbate reductase (DHAR) is a physiologically important reducing enzyme in the ascorbate-
glutathione recycling reaction. In this study, we cloned 6 DHAR genes from a hybrid pine species complex of Pinus den-
sata, P. yunnanensis and P. tabulaeformis. P. densata originated by natural hybridization of P. yunnanensis and P.
tabulaeformis. The 6 DHAR genes were divided into 2 types: DHAR1 and DHAR2. Phylogenetic analyses indicated that
the 3 DHAR1 and 3 DHAR2 genes from the 3 Pinus species were 2 orthologous groups. DHAR1 and DHAR2 genes
originated from an ancestral duplication event that occurred in the most recent common ancestor of the early land plants.
P. densata contains a copy of DHAR1 similar to that of P. tabulaeformis and a copy of DHAR2 similar to that of P. yun-
nanensis. RT-PCR revealed that the 6 DHAR were constitutive expression genes in the 3 Pinus species. The recombinant
Pinus DHAR proteins were overexpressed in E. coli and purified by Ni-affinity chromatography. P. densata and P. tabu-
laeformis DHAR1 proteins showed similar enzymatic activities, catalytic efficiency, thermal stabilities and optimal pH pro-
files towards substrate DHA but about 300-fold higher enzymatic activities than P. yunnanensis DHAR1 protein. The en-
zymatic activity and thermal stability of P. densata DHAR2 protein were higher than those of P. tabulaeformis DHAR2
protein. Joint analyses of sequence structure, phylogenetic relationships, expression patterns, enzymatic properties and
protein 3-D structure revealed selective DHAR gene composition in the hybrid genome of P. densata. Such a combination
of divergent copies of DHAR gene in P. densata may have adaptive implications for its colonization of novel habitats on
the Tibetan Plateau.
Key words adaptation, DHAR, functional divergence, hybrid, protein function
Kao HN, Lan T, Wang XR, Zeng QY (2012). Functional divergence of dehydroascorbate reductase genes in Pinus
densata, P. tabulaeformis and P. yunnanensis. Chin Bull Bot 47, 1–10.
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* Author for correspondence. E-mail: qingyin.zeng@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 刘慧君)