全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107-116, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004)
* 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac .cn
.技术方法.
果实蛋白质组学研究的实验方法
王清 1, 2 , 产祝龙 1 , 秦国政 1 , 田世平1*
1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039
摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比
其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱
桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲
液2溶解蛋白质，并用固相pH梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果
实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结
果影响不大。
关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取
王清 , 产祝龙 , 秦国政 , 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107-116.
果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理
对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研
究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗
氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian
et al. , 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非
生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质
组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要
的手段。
蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、
胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白
质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研
究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物
生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et
al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多
次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化
(Granier, 1988; Meyer et al. , 1988)。而从果实组织
中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量
相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、
多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等( C l e m e n t s ,
1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技
术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。
本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建
立了一整套适用于多种果实, 如甜樱桃( P r u n u s
av i vu m )、桃(P r unu s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s
domest ica)、芒果(Mangifera indica)和冬枣(Ziz iphus
jujuba)的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、
蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色
方法等。
1 材料与方法
1.1 实验材料
桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验
果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng’) 采于中国
科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica
Borkh ‘Fuji’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果
(Mangifera indica L. ‘Zil l’)和冬枣(Ziz iphus jujuba
Mill. ‘Dongzao’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
108 植物学报 44(1) 2009
州市。果实采摘后直接运回实验室, 剔除伤果和病果,
挑选出大小均一的果实, 用 1% 的次氯酸钠溶液消毒,
清洗后晾干。
1.2 蛋白质提取
以下所有步骤均在 4°C 条件下进行。
TCA法(TCA)参照 Sarry 等(2004)的方法并稍加改
进。用取样器从 10 个果实中分别取 4 g果肉, 用液氮
在研钵中将其研磨成粉。然后加入4倍体积冰冷的10%
TCA(含0.07% b-巯基乙醇), 匀浆液于-20°C下过夜培
养, 纱布过滤。滤液以 20 000×g离心 30分钟, 收集沉
淀。沉淀用冷丙酮冲洗 3次, 并在 4°C下干燥, 之后溶
于裂解缓冲液中(表 1), 保存于-80°C备用。
匀浆法(Homo)参照 Chan等(2007)的方法。称取 4
g果肉, 用液氮在研钵中研磨成粉。加入 4 mL的匀浆
缓冲液(匀浆液中含有 20 mmol.L-1 Tris -HCl (pH 7.5),
250 mmol.L-1 sucrose, 10 mmol.L-1 EGTA, 1 mmol.
L-1 PMSF, 1 mmol.L-1 DTT, 以及 1% Triton X-100)继
续研磨。匀浆液以 20 000×g离心 30 分钟。将上清液
转移到新的离心管中, 加入终浓度为 10%的 TCA溶液,
4°C下放置 2小时。20 000×g离心 40分钟, 收集沉淀。
用冷丙酮冲洗 3次, 4°C下干燥后溶于250 mL裂解缓冲
液中(表 1), 保存于-80°C 备用。
酚提取法(Phe)根据Saravanan和Rose(2004)的方
法并加以改进。称取 4 g果肉, 用液氮在研钵中研磨成
粉。然后加入 4 mL 的匀浆缓冲液(匀浆液中含有 20
mmol.L-1 Tris -HCl (pH 7.5), 1.05 mol.L-1 sucrose, 10
mmol.L-1 EGTA, 1 mmol.L-1 PMSF, 1 mmol.L-1 DTT
以及 1% Triton X-100)继续研磨。匀浆液以 20 000×g
离心 30分钟。上清液中加入等体积的 pH为7.8的Tris-
饱和酚, 充分摇荡, 混匀, 10 000×g, 4°C下离心 30分
钟, 上层为酚相, 中间白色物质为杂质, 下层为水相。回
收酚相, 加入5倍体积含0.1 mol.L-1 乙酸铵的预冷甲醇,
充分混匀, -20°C下过夜培养, 沉淀蛋白。沉淀分别用
预冷的含 0.1 mol.L-1 乙酸铵的甲醇和丙酮冲洗 2次,
4°C下干燥后溶于 250 mL裂解缓冲液中(表 1), -80°C
保存备用。
1.3 蛋白质的溶解和上样
向蛋白干粉中加入 225 mL裂解缓冲液1或2(表1), 振荡
30分钟, 溶解后用超声波破碎仪处理。23 755×g离心
30分钟, 取上清。采用 Bradford(1976)的方法进行定
量, 每个处理上样为 600 mg蛋白。
1.4 双向电泳
载体两性电解质梯度双向电泳(CA-IEF): 第一向等电聚
焦在长 13 cm、直径 3 cm 的玻璃管中进行(Komatsu
et al. , 1999)。用 Parafi lm 封口膜封好干净的玻璃管
(Daiichi pure Chemicals, Tokyo, Japan)底部, 在13 cm
处做好标记, 垂直放置于置胶器上。用注射器吸取胶液
(10% (v/v) NP-40, 30% (w/v) acry lamide, 9.5 mol.L-1
urea, 10% ammonium persulfate, 1% (v/v) ampholine
(pH 5-8), 1%(v/v) ampholine (pH 3.5-10)), 灌胶。待
胶条聚合后, 除去 Parafilm 膜。然后加入 600 mg蛋白
样品, 并于其上覆盖 30 mL的 50% 裂解缓冲液。最后
加入上槽电极缓冲液(20 mmol.L-1 NaOH)及下槽电极缓
冲液(20 mmol.L-1 H3PO4), 依照 200 V × 30分钟, 400
V × 16小时, 800 V × 1小时的程序进行等电聚焦。聚
焦完毕后, 从凝胶管中取出胶条, 放入平衡缓冲液 I (62.5
mmol.L-1 Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% (w/v) SDS, 10% (v/v)
表 1 裂解缓冲液的配方
Table 1 Lysis buff er rec ipes f or selected steps in 2D elec-
trophores is
Recipes Chemicals Concentrations
1 Urea 8 mol.L-1
NP-40 2% (v/v)
CA (pH 3.5-10) 1% (v/v)
CA (pH 5-8) 1% (v/v)
2-mercaptoethanol 5% (v/v)
PV P 5% (w /v)
2 Urea 7 mol.L-1
Thiourea 2 mol.L-1
CHA PS 4% (w /v)
DTT 1% (w /v)
CA (pH 3.5-10) 1% (v/v)
CA (pH 5-8) 1% (v/v)
NP-40 0.2% (v/v)
109王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法
glycerol, 5% (v/v) 2-mercaptoethanol)中, 振荡平衡 2
次, 每次 15分钟, 然后转移胶条至分离胶浓度为 15%,
浓缩胶浓度为 5% 的 SDS-PAGE胶上端进行第二向垂
直电泳。
固相 pH梯度双向电泳(IPG-IEF): 等电聚焦用预制
的 13 cm 固相(pH 4-7)梯度胶条(GE Healthcare)进
行。分别取蛋白质样品 600 mg 及水化液(7 m ol .L-1
urea, 2 mol.L-1 thiourea, 2% (w/v) CHAPS, 0.5% IPG
buffer 4-7, 0.002% (w/v) bromophenol blue) 混合后过
夜以水化上样, 上样总体积为 250 mL。然后进行等电
聚焦电泳, 升压程序依次为 500 V 快速升压 1 小时,
1 000 V线性升压 1 小时, 8 000 V 线性升压 2.3小时,
8 000 V快速升压 2小时。等电聚焦结束后将第一向胶
条分别置于含 1%DTT和 2.5% 碘乙酰胺的平衡液 II (6
mol.L-1 urea, 75 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.8, 29.3% (v/
v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 0.002% (w/v) bromophe-
nol blue)中各平衡20分钟, 然后再转移至分离胶浓度为
15%, 浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE胶上端进行第二向
垂直电泳。除特别注明外, 等电聚焦均使用 1PG胶条。
1.5 凝胶染色方法
本文所用的凝胶染色方法见表 2, 包括: (1)考马斯亮蓝
R-250(CBB R-250) (Shen et al., 2003); (2)胶体考马斯
亮蓝染色(Blue silver)(Candiano et al., 2004); (3)银染
(Silver staining)(Blum et al., 1987)。
1.6 图像采集及分析
凝胶脱色后立即用 ImageScanner (GE Healthcare)扫
描仪扫描。凝胶图像采用 Im age Maste r 2D E li te
software (GE Healthcare)软件进行分析。蛋白点的检
定参数设置如下: saliency, 2.0; smooth, 5; minimum
area, 50。
2 结果与讨论
2.1 匀浆法和酚抽提法与TCA法的比较
要获得高质量且重复性好的2D凝胶图像, 蛋白质的提取
表 2 双向电泳凝胶染色方法
Table 2 Gel staining protocols for fruit 2D-PA GE
Steps Concentration Time
CBB R-250
Fix 1 h
Ethanol 50% (v/v)
Acetic ac id 10% (v/v)
Stain > 2 h
CBB R-250 0.1% (w /v)
Ethanol 24% (v/v)
Acetic ac id 8% (v/v)
Destain Until desired intensity
Ethanol 30% (v/v)
Acetic ac id 8% (v/v)
Blue s ilver
Fix 1 h
Ethanol 50% (v/v)
Acetic ac id 10% (v/v)
Wash 15 min, four times
Distilled w ater
Stain Overnight
CBB G-250 0.12% (w /v)
Ammonium 10% (w /v)
sulfate
Phosphoric ac id 10% (v/v)
Methanol 20% (v/v)
Destain Until desired intensity
Distilled w ater
Silver s taining
Fix 2 h
Ethanol 50% (v/v)
Acetic ac id 10% (v/v)
Rinse
Ethanol 30% (v/v) 20 min, tw ice
Then deionized 20 min
H2O
Sensitization 1 min
Sodium thiosulfate 0.20% (w /v)
Rinse 2 min
Deionized H2O 20 s, three times
Then deionized H2O 1 min
Silver 30 min at 4°C
Silver nitrate 0.20% (w /v)
(Chilled)
Formaldehyde 0.02%
Rinse 2 min
Deionized H2O 20 s, three times
Then deionized H2O 1 min
Development Until desired intensity
Sodium carbonate 3% (w /v)
35% formaldehyde 0.05% (v/v)
Rinse 20 s
Deionized H2O
Stop 5 min
Acetic ac id 5% (v/v)
110 植物学报 44(1) 2009
至关重要。在蛋白质提取过程中, 应尽量使细胞破碎,
释放出蛋白质, 并尽可能多地使蛋白质溶解于裂解缓冲
液中。提取过程中应尽量减少蛋白质的降解和丢失, 尤
其是低丰度的蛋白质。对于蛋白质含量低、糖类和酚
类干扰大且成分复杂的果实来说, 提取高质量的蛋白质
尤为困难。本研究应用 TCA 法、匀浆法和酚抽提法提
取果实蛋白质并进行 2-DE, 获得的凝胶图谱显示, 匀浆
法和酚抽提法均可以获得质量较高的双向电泳图谱(图
1)。图像分析结果表明, 用匀浆法和酚抽提法提取的蛋
白质图谱中的蛋白质点明显多于用 TCA 法获得的图谱
(表 3)。对于甜樱桃, 用酚抽提法提取蛋白质所获得的
图谱质量好、背景干净且纵横纹较少(图1C), 而TCA法
和匀浆法则效果较差(图 1A, B; 表 3)。对于桃、苹果
和芒果, 利用匀浆法提取蛋白质均得到了质量较好的电
泳图谱(图1E, H, J), 用酚抽提法提取桃的蛋白质也获得
了较好的结果(图 1F), 且匀浆法和酚抽提法得到的蛋白
质的点数也基本一致(表 3)。因此对于桃来说, 这 2种
提取蛋白质的方法差异不显著, 都能得到较为满意的结
果。而采用 TCA 法得到的图谱则质量不高(图 1D, G,
I)。用 TCA 法提取果实蛋白质得到的电泳图谱中蛋白
图 1 不同果实材料分别采用
TCA 法、匀浆法和酚抽提法提
取蛋白质后获得的双向电泳图谱
(第一向等电聚焦采用CA-IEF)
(A)-(C) 甜樱桃; (D)-(F) 桃;
(G), (H) 苹果; (I), (J) 芒果
Figur e 1 Typical examples
of 2-DE pattern of f ruits using
TCA , Homo, and Phe protein
extraction protocols described
in the paper
(A)-(C) Prunus avivum; (D)-
(F) Prunus pers i ca; (G) , (H)
Mal us do mes ti ca; ( I) , (J)
Mangi fera i ndi ca
111王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法
质点数较少, 在甜樱桃上表现得尤为突出(表 3)。
此外, 我们对Phe法的提取缓冲液配方进行了改进,
增加了缓冲液中蔗糖的浓度, 由原先的250 mmol.L-1 变
为 1.05 mol.L-1。改进后的配方使得酚相由原先在下层
变为上层, 因而回收酚相更加简便。
除了考虑增加蛋白质的溶解度之外, 排除组织中其
它干扰蛋白质溶解的物质, 尤其是核酸的影响也至关重
要。在水果样品中, 糖类、酚类、单宁及其它物质的
影响也相当明显。在蛋白质变性之前可利用超声破碎和
核酸内切酶去除核酸等干扰物质。此外, 添加一些蛋白
酶抑制剂可防止蛋白质的降解, 保持蛋白质的完整性。
2.2 固相pH梯度的应用提高双向电泳图谱质量
无论是应用 IPG胶条还是CA胶条进行等电聚焦都需要
溶解较好的蛋白质(Garfin, 2000)。本研究将酚抽提法
提取的蛋白质分别用CA-IEF和 IPG-IEF进行等电聚焦,
结果表明, CA-IEF等电聚焦得到的图谱有一些横纹和纵
纹(图 2A, C, E)。而 IPG-IEF等电聚焦获得的图谱则蛋
白质点多(表 3)、聚焦充分且蛋白分离效果好(图 2)。甜
樱桃、桃和冬枣果实蛋白质样品应用 IPG- IEF 获得的
图谱质量都很好。
对于蛋白质组学研究来说, 将复杂的蛋白质样品进
行高质量的分离是先决条件, 同时也是科研人员面临的
一个挑战(Görg et al., 2004); 稳定的、线性的且重复
性好的 pH梯度同样至关重要。载体两性电解质梯度双
向电泳技术(CA - IEF )是分离蛋白质的一种有效方法。
但两性电解质在电泳过程中由于凝胶 pH梯度在电场作
用下随时间的延长而改变, 会使 pH 梯度向阴极漂移
(Görg et al ., 2004)。另外, CA-IEF 由自己制作灌注,
重复性较差。IPG胶条则是在凝胶灌制时, 将酸性和碱
性的缓冲基团按梯度共价结合进入聚丙烯酰胺凝胶, 形
成固相 pH梯度(Righetti , 1983)。IPG-IEF相对CA-IEF
方法具有重复性好、操作简便且稳定的特点, 可以更好
地分离酸性端或碱性端的蛋白质。对于这 2种方法, 也
有不同的评价观点, Klose(1999)和Lopez(1999)则认为
CA-IEF有很多优点。本研究结果显示, CA-IEF和 IPG-
IEF 2种等电聚焦方法均获得了较好的图谱, 并且分离的
蛋白质点均在 500个以上(表 3)。
2.3 裂解缓冲液2提高蛋白质的溶解性
为了获得质量较高的2DE图谱, 蛋白质样品必须进行变
性、解聚和增溶等处理, 破坏分子间的相互作用, 使蛋
白质复合物解聚、变性为单体形式(Molloy , 2000)。一
般情况下, 溶解缓冲液包含离液剂(如硫脲和尿素)、非
离子去污剂或兼性离子去污剂(如 Tr i t on X-1 00 或
CH A P S )、还原剂、两性电解质以及蛋白酶抑制剂
(Görg et al. , 2004)。在本研究中我们发现用裂解缓冲
液 2溶解蛋白质可以获得较高质量的双向电泳图谱(图
3B, D)。而用裂解缓冲液 1溶解樱桃和桃果实蛋白质样
品, 得到的凝胶图谱蛋白点则很少(图 3A, C)。
为了提高2DE中蛋白质的分离效果, 一些新的试剂
被应用到 2-DE中(Molloy, 2000)。Sulfobetaines可促
进蛋白质溶解, 其效果优于 NP -40和 Tr it on X-100
(Mo l loy , 2000; Sant oni et al . , 2000)。TB P
(tributy lphosphine) 可以作为DTT的替代试剂, 而TCEP
(tris (2-carboxyethyl) phosphine)也可应用于 DIGE 的
标记中(Herbert et al. , 1998)。
表 3 采用不同蛋白质提取方法提取的蛋白质在 2DE凝胶图谱上
的统计分析
Table 3 Numbers of f ruit samples protein spot using 3 protein
extraction protocols (TCA, Homo, and Phe methods as described
in the paper)
Fruit CA -IEFa IPG-IEFa
TCAb Homob Pheb Pheb
Prunus avivum 279 443 591 617
Prunus persi ca 499 685 692 682
Malus domesti ca 586 720 NDc NDc
Mangi fera i ndi ca 447 546 NDc NDc
Zi ziphus j ujuba NDc NDc 582 655
CA -IEF a表示等电聚焦在毛细玻璃管中进行, IPG-IEFa表示等电聚
焦采用 IPG胶条(pH 4-7)。TCA b、Homob和Pheb表示蛋白质的
提取方法。ND c : 没有检测
CA -IEF a w as carr ied out w ith glass capillary tube gel and IPG-
IEF a w as run w ith 13 cm IPG s trips (pH 4-7) as descr ibed in
the paper. TCA b, Homo b , and Phe b w ere protein ex traction
protocols desc ribed in the paper . ND c: Not determined
112 植物学报 44(1) 2009
图 2 甜樱桃、
桃和冬枣果实材
料采用不同的等
电聚焦(CA-IEF和
IPG-IEF)系统获得
的双向电泳图谱
(果实蛋白质提取
方法采用酚提取
法, 凝胶染色应用
的是CBB R-250
染色法。)
(A) , (B) 甜樱桃;
(C), (D) 桃; (E) ,
(F) 冬枣
Figur e 2 Tw o-
DE patterns of
f ruits us ing CA -
IEF and IPG-IEF
f or the f ir s t di-
mens ion (Prot-
eins w ere ex -
tracted f rom frui-
ts by Phe proto-
col descr ibed in
the paper . The
gels w ere stain-
ed w ith CBB R-
250.)
(A) , (B) Prunus
avivum; (C), (D)
Prunus persi ca;
(E), (F) Zi ziphus
jujuba
2.4 染色方法比较
目前, 双向电泳的染色方法较多, 分辨率也不同。考马
斯亮蓝R-250染色法最为普遍, 也最简单。Meyer和
Lamberts (1965)首次采用了这种方法, 检测灵敏度为
10-100 ng。银染技术也是一种很常用的染色技术, 它
的检测灵敏度比考马斯亮蓝高 100倍(Switzer et al. ,
1979; Rabilloud et al. , 1990), 但是与质谱的兼容性较
低。胶体考马斯亮蓝染色法最早由 Neuhoff等(1988)报
道。后来, Candiano等(2004)报道了改进的胶体考染
法, 其优点是背景低, 灵敏度高, 可达 1 ng左右。
在本实验中(图4C), 银染法效果最好, 得到的蛋白点
清晰且与背景的反差大, 容易识别。这一点与 Rabi l l-
oud等(1990)、Switzer等(1979)和 Shevchenko等
(1996a)的研究结果相一致。 而其它两种染色方法差别
不大(图 4A, B)。对于染色方法的选择, 需要考虑的因
素主要包括: 较高的灵敏度(即较低的检测极限), 较高的
线性动态范围(定量精确), 重复性好, 高的质谱兼容性
(Görg et al. , 2004)。由于不同的染色方法中染料所结
合的蛋白质不同, 因此没有一种染色方法可以适合所有
的蛋白质染色。考虑到后续的蛋白质质谱鉴定, CBB
染色是较为合适的染色方法。但也有报道称银染可以
与质谱鉴定兼容, 质谱结果理想(Shevchenko et al. ,
113王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法
1996b; Rabilloud et al., 1998)。
3 结论
以上实验结果表明, 采用匀浆法和酚抽提法提取蛋白质
并用改进的裂解缓冲液 2进行溶解, 能够成功地分离甜
樱桃、桃、苹果、芒果和冬枣果实的蛋白质。匀浆
法和酚抽提法提取蛋白质得到的图谱质量差异不显著。
固相pH梯度双向电泳(IPG-IEF)与载体两性电解质梯度
图 3 桃和甜樱桃果实蛋
白质分别采用不同的裂解
缓冲液溶解蛋白质获得的
双向电泳图谱(第一向等电
聚焦采用CA- IEF, 凝胶染
色采用的是CBB R-250染
色法。)
(A), (B) 桃; (C), (D) 甜樱
桃
Figur e 3 Typical ex -
amples of 2-DE of Prunus
pers i ca and P. avi vum
fruit samples us ing diff er-
ent ly sis buf f er recipes
de sc r ibe d in Ta ble 1
(Tw o- DE pat ter ns of
fruits used CA- IEF for the
firs t dimension. The gels
w ere stained w ith CBB R-
250.)
(A), (B) Prunus pers ica;
(C), (D) Prunus avivum
图 4 采用不同染色方法显色后的双向电泳图谱(第一向等电聚
焦采用CA -IEF)
(A) 考马斯亮蓝R-250(CBB R-250) ; (B) 胶体考马斯亮蓝染色; (C)
银染
Figur e 4 Typical examples of 2-DE of Prunus pers ica fruit
samples us ing dif ferent staining protocols described in Table 2
(Tw o-DE patterns of f ruits used CA- IEF for the f ir st dimension)
(A) CBB R-250 s taining protocol; (B) Blue s ilver staining
protocol; (C) Silver staining protocol
®
114 植物学报 44(1) 2009
双向电泳技术(CA-IEF)相比可以得到更好的结果, 其拖
尾少, 横纹纵纹也较少。本实验中的 3种染色方法都适
合果实蛋白质的染色。将上述方法综合在一起就形成
了一整套适用于多种果实的蛋白质组学研究方法。本
实验探索的方法对其它含有较多杂质的植物材料的蛋白
质组学研究也有一定的参考价值。
致谢 感谢中国科学院植物研究所沈世华研究员在
蛋白质组学实验方法上给予的建议。
参考文献
Antelmann H, Bernhar dt J, Schmid R, Mach H, Völke r U,
Heck er PM (1997). First steps from a tw o-dimensional pro-
tein index tow ards a response-regulation map for Baci ll us
subti lis. Elec trophoresis 18, 1451-1463.
Blum H, Beier H, Gros s HJ (1987). Improved silver staining of
plant proteins , RNA and DNA in polyacrylamide gels. Elec tro-
phoresis 8, 93-99.
Br adfor d M M (1976). A rapid and sensitive method f or the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the prin-
ciple of protein-dye binding. Anal Bi ochem 72, 248-254.
Candiano G, Brus chi M, M usante L, Santucci L , Ghigge ri
GM, Car nem olla B, Or ecchia P, Zar di L, Righet ti PG
(2004) . Blue s ilver: a very sensit ive colloidal Coomassie G-
250 s taining for proteome analys is . Electrophores is 25,
1327-1333.
Chan ZL, Tian SP (2006). Induction of H2O2-metabolizing en-
zymes and total protein synthesis by antagonistic yeast and
salicy lic acid in harvested sw eet cherry fruit. Postharvest
Biol Technol 39, 314-320.
Chan ZL, Qin GZ, Xu XB, Li BQ, T ian SP (2007). Proteome ap-
proach to characterize proteins induced by antagonist yeast
and salicy lic acid in peach fruit. J Proteome Res 6, 1677-
1688.
Chang W, Huang L, Shen M , Webster C, Burlingame AL,
Roberts JKM (2000). Patterns of protein synthesis and toler-
ance of anoxia in root tips of maize seedlings acclimated to a
low -oxygen environment, and identif ication of proteins by mass
spec trometry. Plant Physiol 122, 295-318.
Clem ents RL (1970) . The Biochemis try of Fruit and Their
Products. London and New York: Academic Press. pp. 159-
177.
Dom inguez-Puigjaner E, Vendrell M, Lude vid MD (1992).
Differential protein accumulation in banana fruit during ripening.
Plant Physiol 98, 157-162.
Garfin DE (2000). Separation Science and Technology. San Diego:
Academic Press. pp. 263-298.
Granier F (1988). Extrac tion of plant proteins for tw o-dimen-
sional electrophoresis. Elec trophoresis 9, 712-718.
Görg A, Weiss W, Dunn MJ (2004) . Cur rent tw o-dimensional
electrophores is technology f or proteomics. Proteomics 4,
3665-3685.
Herbert BR, Molloy MP, Gooley AA, Walsh BJ, Bryson WG,
Williams KL (1998). Improved protein solubility in tw o-dimen-
sional elec trophoresis using tributy l phosphine as reduc ing
agent. Elec trophoresis 19, 845-851.
Klose J (1999). Large-gel 2-D electrophoresis. Methods Mol Biol
112, 147-172.
Komats u S, Muham mad A, Rak wal R (1999). Separation and
characterization of proteins f rom green and etiolated shoots
of rice: tow ards a r ice proteome. El ectrophoresi s 20, 630-
636.
Lopez MF (1999). Advantages of carrier ampholyte IEF. Meth-
ods Mol Biol 112, 109-110.
Me yer TS, Lam ber ts BL (1965). Use of Coomassie Brilliant
Blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of
parotid saliva proteins on ac ry lamide-gel s tr ips. Bi ochi m
Biophys Acta 107, 144-145.
Me yer Y, Gras se t J, Chas tier Y, Cleye t-M ar el C (1988).
Preparation by tw o-dimens ional electrophoresis of proteins
for antibody produc tion: antibodies against proteins w hose
synthes is is reduced by aux in in tobacco mesophy ll
protoplasts. Elec trophoresis 9, 704-712.
Molloy MP (2000). Tw o-dimensional electrophores is of mem-
brane proteins using immobilized pH gradients. Anal Biochem
115王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法
280, 1-10.
Neuhoff V, Ar old N, Taube D, Ehr hardt W (1988). Improved
staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric
focusing gels w ith clear background at nanogram sensitivity
using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophore-
sis 9, 255-262.
Qin GZ, Tian SP, Chan ZL, Li BQ (2007). Crucial role of antioxi-
dant proteins and hydrolytic enzymes in pathogenicity of Peni-
cil lium expansum: analysis based on proteomic approach.
Mol Cell Proteomics 6, 425-438.
Rabilloud T, Kie f fe r S, Pr ocaccio V , Louw agie M ,
Cour ches ne PL, Patter son SD, M ar tinez P, Garin J,
Lunardi J (1998) . Tw o-dimensional electrophoresis of hu-
man placental mitochondria and protein identif ication by mass
spectrometry: tow ard a human mitochondrial proteome. Elec-
trophoresis 19, 1006-1014.
Rabilloud T, Vuillard L, Gilly C, Lawrence JJ (1990). Silver-
staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview .
Cell Mol Biol 40, 57-75.
Righet ti PG (1983). Isoelectr ic Focusing: Theory , Methodology
and Applications. Amsterdam: Elsevier Scientif ic Publishing
Company.
Santoni V, Molloy M, Rabilloud T (2000). Membrane proteins
and proteomics: un amour imposs ible? El ectrophoresi s 21,
1054-1070.
Saravanan RS, Rose JKC (2004). A critical evaluation of sample
extraction techniques for enhanced proteomic analysis of re-
calcitrant plant tissues. Proteomics 4, 2522-2532.
Sarr y JE, Sommerer N, Sauvage FX, Bergoin A, Rossignol
M, Albagnac G, Romie u C (2004). Grape berry biochemis-
try revisited upon proteomic analysis of the mesocarp.
Proteomics 4, 201-215.
She n SH, Jing YX, Kuang TY (2003). Proteomics approach to
identify w ound-response related proteins from rice leaf sheath.
Proteomics 3, 527-535.
Shevche nko A, Jensen ON, Podtelejn ikov AV, Sagliocco F,
Wilm M, Vor m O (1996a). Linking genome and proteome by
mass spectrometry: large-scale identif ication of yeas t pro-
teins from tw o dimens ional gels. Proc Natl Acad Sc i USA 93,
14440-14445.
Shevchenko A, Wilm M , V orm O, Mann M (1996b). Mass
spectrometric sequencing of proteins from silver-stained poly-
acrylamide gels. Anal Chem 68, 850-858.
Sw itzer RC, Mer ril CR, Shifrin S (1979). A highly sens itive
silver stain for detecting proteins and peptides in polyacryla-
mide gels. Anal Bi ochem 98, 231-237.
Tian SP, Yao HJ, Deng X, Xu XB, Qin GZ, Chan ZL (2007) .
Characterization and expression of b-1, 3-glucanase genes
in jujube fruit induced by the biocontrol microbial agent Crypto-
coccus laurentii. Phytopathol ogy 97, 260-268.
116 植物学报 44(1) 2009
Comparison of 2-DE Techniques for Improved Proteomic
Analysis of Fruit Tissues
Qing Wang 1, 2, Zhulong Chan1, Guozheng Qin1, Shiping Tian1*
1Ke y L abo rato ry of Pho tosynth esi s a nd Enviro nmen tal Mo lecula r Ph ysi olo gy, In stitute of Bo tan y, Chin ese Acade my of Scie nce s,
Be iji ng 1 000 93, Chi na; 2Gradu ate Sch ool of Chi nese Acad emy of Sci ences, Bei jin g 1 000 39, Chi na
Abstr act Fruit tissues are considered recalcitrant plant tissue for proteomic analysis . In this study, several 2-D electrophores is
(2-DE) protocols w ere evaluated to establish a ref erence map for the fruit proteome. Three protein ex trac tion procedures for 2-DE
and different elec trophoresis systems of isoelectr ic f ocus ing (IEF), as w ell as staining protocols , w ere compared w ith several fruit
protein samples. We achieved satis factory 2-DE patterns w ith w ell-resolved polypeptide spots throughout the gel by homogeniza-
tion (Homo) and phenol (Phe) protein extrac tion protocols in combination w ith a lysis buff er of 7 mol.L-1 urea, 2 mol.L-1 thiourea,
4% (v /v) CHA PS, 1% (w /v) DTT, 0.2% (v/v) Nonidet P40, and 2% (v/v ) carr ier ampholytes. A s w ell, immobilized pH gradient ( IPG)-
IEF produced high-quality 2-DE gels that w ere free of smear ing and s treaking, and all s taining protocols w ere suitable for protein
visualization. These results suggest that the Homo and Phe protocols are highly effec tive w ith fruit t issues and that the combination
IPG-IEF provides satisf ac tory 2-DE-based proteomic analys is of fruit tissues, w hich is very useful for deep inves tigation of
biochemical changes in harvested fruit by a proteomic approach.
Ke y w ords f ruit , g el sta inin g, iso ele ctri c focu sin g, l ysi s b uffer, pro tei n e xtra cti on
Wa ng Q, Chan ZL, Qin GZ, Tia n SP (200 9). Co mpariso n o f 2-DE tech niq ues for im proved pro teom ic ana lysi s o f fruit ti ssue s. Chin Bull
Bo t 44 , 10 7-11 6.
* Author for correspondence. E-mail: tsp@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 孙冬花)