全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (2): 138–144, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00138
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收稿日期: 2012-08-27; 接受日期: 2012-11-14
基金项目: 国家自然科学基金(No.30900781, No.31260255)、江西省青年科学家培养计划(No.20112BCB23007)、江西省教育厅科技计
划(No.GJJ12184)、江西省科技支撑计划(No.20122BBF60064)和江西省重大科技专项计划(No.20114ABF03101)
* 通讯作者。E-mail: xdluolf@163.com; xiejiankun@yahoo.com
东乡野生稻基因渐渗系中逆转座子逆转录酶序列的
克隆及表达分析
陈雅玲1, 罗向东1*, 张帆涛1, 戴亮芳1, 胡标林2, 谢建坤1*
1江西师范大学生命科学学院, 南昌 330022; 2江西省农业科学院水稻研究所, 南昌 330200
摘要 以东乡野生稻(Oryza rufipogon)耐冷渐渗系IL5335、 IL5243及其双亲为试材 , 克隆到75条存在高度异质性的
Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列, 经聚类分析将这些逆转录酶序列分为7个家族; 家族6和7含有65条逆转录酶序列, 序
列间的相似性为44.9%–99.3%; 家族1–5仅含10条逆转录酶序列, 其中8条来源于耐冷渐渗系, 它们与亲本的序列相似性为
29.2%–52.8%, 分析发现这些序列曾发生缺失或插入突变。实时荧光定量PCR检测结果显示, IL5335和IL5243中的houba、
osr15及osr17逆转录酶的表达量均远高于受体亲本(表达量增加1.50–5.07倍), 表明渐渗杂交诱发改变了IL5335和IL5243
中逆转录酶序列的结构及其表达活性。该结果为今后水稻表观遗传学研究及外源优异基因利用奠定了基础。
关键词 东乡野生稻, 表达活性, 渐渗系, 逆转座子
陈雅玲, 罗向东, 张帆涛, 戴亮芳, 胡标林, 谢建坤 (2013). 东乡野生稻基因渐渗系中逆转座子逆转录酶序列的克隆及表
达分析. 植物学报 48, 138–144.
远缘渐渗杂交是利用野生有利基因, 创造种间变
异, 选育新品种的一种重要途径(Kishhii et al., 2004;
罗向东等, 2011)。然而, 外源DNA渐渗可能导致受体
植物的表型、基因组结构和基因表达水平发生改变,
包括亲本序列的丢失或新序列的出现 (Qi et al.,
2010)、基因沉默或基因激活 (Shitsukawa et al.,
2007)、DNA甲基化模式改变以及逆转座子拷贝数增
加和激活等(Wang et al., 2011; 颜菱等, 2012)。这将会
在很大程度上阻碍野生有利基因在实际育种中的充
分利用。
逆转座子是植物基因组的重要组成部分, 广泛分
布于植物基因组中(约占基因组DNA50%以上), 其结
构、拷贝数或活性的改变将对植物基因组的结构和功
能产生重大影响, 进而导致植物表型发生明显改变
(Kashkush et al., 2002; Hori et al., 2007)。例如, 逆
转座子的激活和转座改变了葡萄(Vitis vinifera)(Ko-
bayashi et al., 2004)的表皮颜色和西西里红橙
(Citrus sinensis) (Butelli et al., 2012)的果肉颜色。也
有研究表明, 种间杂交渐渗可诱发逆转座子拷贝数增
加和逆转座子激活等, 进而影响外源优异性状的表达
与利用(Liu and Wendel, 2000; Shan et al., 2005)。
因此, 深入研究渐渗系基因组中的逆转座子, 探讨渐
渗杂交对逆转座子遗传和表观遗传的影响, 对有效利
用外源优异基因具有重要的指导意义。
此前, 本研究组构建了东乡野生稻(Oryza rufipo-
gon)/协青早B//协青早B(O. sativa cv. ‘Xieqingzao
B’)的回交重组自交系(backcross inbred lines, BILs)
群体BC1F9(含228个株系), 并利用该群体鉴定筛选获
得了2个强耐冷渐渗系 IL5335和 IL5243(简水溶等,
2011)。通过田间农艺性状观察, 发现BC1F9群体中绝
大多数株系性状稳定, 但强耐冷渐渗系IL5335的自
交后代在株高和谷粒颜色等形态学性状上存在一定
的变异或分离, 这在一定程度上制约了我们有效利用
这些优异基因的渐渗系。为探明高世代水稻(O. sa-
tiva)渐渗杂交后代表型不稳定的可能原因, 我们根据
Ty1-copia类逆转座子逆转录酶 (reverse transcrip-
tase, RT)基因的保守序列设计兼并引物, 采用克隆
测序和荧光定量PCR方法, 研究东乡野生稻耐冷渐
·研究报告·
陈雅玲等: 东乡野生稻基因渐渗系中逆转座子逆转录酶序列的克隆及表达分析 139
渗系及其双亲中Ty1-copia类逆转座子逆转录酶基因
序列的变化特征及其表达活性, 阐明高世代耐冷渐渗
系表型不稳定与其基因组逆转座子变化之间的关系,
以期为有效利用外源优异基因进行作物改良提供参
考。
1 材料与方法
1.1 材料
以东乡野生稻(Oryza rufipogon Griff.)为供体亲本,
与栽培稻协青早B(O. sativa L. cv. ‘Xieqingzao B’)杂
交获得种间杂种F1, F1与协青早B回交获得BC1F1群
体。BC1F1经单粒传、再连续自交8次后获得含228个
株系的BC1F9 BILs群体。简水溶等(2011)对该群体的
耐冷性鉴定表明, IL5243和IL5335具有强耐冷性。经
田间农艺性状观察 , 发现 IL5243和其它绝大多数
BC1F9株系表型稳定, 但IL5335的自交后代在株高和
谷粒颜色等形态学性状上还存在一定的变异或分离。
因而本实验选用耐冷渐渗系IL5335和IL5243及其双
亲为试材, 研究耐冷渐渗系表型变异或分离与逆转座
子逆转录酶序列变化及活性的关系。
1.2 基因组DNA的提取及逆转录酶扩增
采用CTAB法(Murray and Thompson, 1980)提取基
因组DNA。参照Hirochika等(1992)的方法设计逆转座
子逆转录酶基因序列的兼并引物。上游引物: 5′-CAR-
ATGGAYGTNAARAC-3′; 下游引物: 5′-CATRTCR-
TCNACRTA-3′。其中, R=A+G, Y=C+T, N=A+G+T+C。
PCR反应体系及扩增程序参照Wang等(1997)所述方
法进行。
1.3 PCR产物克隆及序列分析
使用Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.
2.0凝胶回收试剂盒 , 对东乡野生稻、协青早B、
IL5335和IL5243的PCR扩增产物进行回收, 操作步
骤按照说明书进行。回收的目的片段连接到pMD19-T
载体 (Takara)上 , 之后用连接产物转化大肠杆菌
(Escherichia coli)DH5α感受态细胞 , 进行蓝白斑筛
选。序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。利
用DNAStar和DNAMAN软件对获得的逆转录酶序列
进行分析。
1.4 总RNA提取及cDNA的合成
参照Trizol试剂(Invitrogen)使用说明书分别提取东乡
野生稻、协青早B、IL5335和IL5243叶片的总RNA。
同时, 参照Frist-Strand Synthesis of cDNA试剂盒
(Promega)说明书合成cDNA。
1.5 实时荧光定量PCR检测
以水稻肌动蛋白Actin基因作为内标检测基因, 采用
实时荧光定量PCR技术检测逆转座子逆转录酶基因
的表达量。Actin及逆转座子逆转录酶扩增的引物序列
见表1。反应体系及扩增程序参照Fast SYBR Green
Master Mix(2×)(ABI)说明书设定, 每个样品测量3次,
每次设3个重复。荧光定量PCR反应在Step-OneTM
and StepOnePlusTM Real-Time PCR Systems (ABI,
USA)上进行。
2 结果与讨论
2.1 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的分离
PCR检测结果表明, 东乡野生稻、协青早B以及2个耐
冷渐渗系材料中的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序
列长度均约为270 bp。该结果与前人报道的一致
(Wang et al., 1997), 表明Ty1-copia类逆转座子在东
乡野生稻及其渐渗系后代中普遍存在。将目的条带进
行回收、纯化及克隆测序, 共得到75条不同的序列。
其中7条来自协青早B, 27条来自东乡野生稻, 18条来
自IL5335, 23条来自IL5243(图1)。这些序列与Gen-
Bank中已知的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列有
非常高的同源性和序列相似性, 说明克隆得到的逆转


表1 实时荧光定量PCR的引物序列
Table 1 Sequences of qRT-PCR primers

Primer
name
Primer sequences
Actin Upstream: 5-GTCTGCGATAATGGAACTG-3
Downstream: 5-TCTGGGTCATCTTCTCACGA-3
houba Upstream: 5-CTGATGGGTTTGTAGTTGAAGG-3
Downstream: 5-ACAAGCACAAAATAACTCCCTC-3
osr15 Upstream: 5-TAGCCAGATTCCAGGTATTGA-3
Downstream: 5-CCACTGTCTGGGTGACTGCT-3
osr17 Upstream: 5-TACATGGCACAACCGAAAGG-3
Downstream: 5-CAGTTGTCCTCTACATTCTCTTG-3
140 植物学报 48(2) 2013
座子逆转录酶序列是可靠的。
2.2 Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的核苷酸序
列分析
为阐明IL5335、IL5243及其双亲中Ty1-copia类逆转
座子间的进化关系, 利用生物信息学软件DNAstar中
的Clustar W方法对克隆到的75条序列进行聚类分析,
构建IL5335、IL5243及其双亲中该类逆转座子逆转录
酶序列的系统进化树。根据进化树分支将75条逆转座
子逆转录酶序列分为7个家族(图1), 代表由同一祖先
进化而来的遗传家系。家族6和7中含有65条逆转录酶
序列, 占克隆序列总数的86.7%, 序列间的相似性为
44.9%–99.3%; 表明耐冷渐渗系中的大部分逆转录
酶序列与亲本具有较高的相似性。家族1–5中仅含有
10条逆转录酶序列, 其中8条来源于耐冷渐渗系, 2条
来自东乡野生稻, 渐渗系后代与亲本的序列相似性为
29.2%–52.8%。进一步分析发现这些序列曾发生过缺
失或插入突变(表2)。由此可以看出, 由同一兼并引物
获得的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列在耐冷渐
渗系中主要存在缺失或插入突变, 且与亲本序列存在
较大的差异。
2.3 耐冷渐渗系中Ty1-copia类逆转座子逆转录
酶基因的转录表达分析
将聚类分析结果中家族1–5的序列在Rice Genome
Annotation Project网站上进行Blast比对发现, 这些
序列与已公布的水稻 houba(AC087192)、 osr15
(AP002747)以及osr17 (AC018727)逆转录酶序列具
有很高的相似性。因而利用houba、osr15和osr17逆
转录酶区设计引物, 以内标基因Actin来调整cDNA的
浓度进行实时荧光定量PCR。通过检测耐冷渐渗系中
这3个Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列转录表达
特性, 发现耐冷渐渗系IL5335中的houba、osr15和
osr17三个逆转座子逆转录酶的表达量分别约为受体
亲本协青早B的4.49、5.88和6.07倍, 分别是供体亲本
东乡野生稻的1.38、1.79和1.11倍(图2); 耐冷渐渗系
IL5243中的houba、osr15和osr17表达量分别约为协
青早B的2.50、2.72和2.66倍, 分别是东乡野生稻的
0.77、0.83和0.49倍(图2)。表明东乡野生稻基因在向
栽培稻渐渗的过程中激活了渐渗系中部分逆转座子;
但在不同的渐渗系中逆转座子的表达活性差别较大
(图2)。
2.4 讨论
前人的研究结果表明, 逆转座子通常以静止状态存在
于植物基因组中, 其结构、拷贝数和活性相对稳定。
然而, 在一些生物或非生物胁迫条件下, 部分逆转座
子的转座潜能可被激活(Grandbastien, 1998), 如组
织培养能够激活水稻基因组中内源copia类逆转座子
Tos17(Chen et al., 2006)。多倍体化及远缘渐渗杂交
也能诱发改变逆转座子的转座活性及拷贝数等(Petit
et al., 2010)。本研究通过分析克隆得到的75条逆转
录酶序列发现, 多条逆转录酶序列与亲本序列的相似
性较小, 存在高度的异质性, 有16条来自渐渗系中的
逆转录酶序列发生了缺失或插入突变。这一方面可能
是逆转座子本身具有高的突变率(Tao et al., 2005;
Sun et al., 2008); 另一方面可能是东乡野生稻DNA
渐渗诱发了受体植物基因组序列的改变(Qi et al.,


表2 渐渗系及其双亲中突变的逆转录酶序列特征
Table 2 The characteristic of mutation reverse transcriptase sequence in introgression lines and their parents


Material Mutation sequence name and its family Mutation type
Oryza sativa cv. ‘Xieqingzao B’ Nothing Nothing
dy24 (Family 7); Deletion
Dongxiang wild rice
dy26, dy28 (Family 2) Insert
zrg1 (Family 5); zrg17 (Family 7); Deletion
IL5335
zrg18 (Family 2) Insert
zrg22, zrg45 (Family 3); zrg33, zrg36, zrg37, zrg40, zrg42 (Family 7);
zrg41 (Family 4); zrg44 ( Family 5);
Deletion
Deletion IL5243
zrg29, zrg32 (Family 1) Insert
陈雅玲等: 东乡野生稻基因渐渗系中逆转座子逆转录酶序列的克隆及表达分析 141

图1 东乡野生稻耐冷渐渗系及其双亲逆转录酶序列的进化树
xb1–xb7: 协青早B中的逆转录酶序列; dy1–dy28: 东乡野生稻中的逆转录酶序列; zrg1–zrg20: IL5335中的逆转录酶序列; zrg22–
zrg45: IL5243中的逆转录酶序列

Figure 1 Phylogenetic tree of reverse transcriptase sequences in cold tolerance introgression lines and their parents
xb1–xb7: RT sequence from Oryza sativa cv. ‘Xieqingzao B’; dy1–dy28: RT sequence from Dongxiang wild rice; zrg1–zrg20: RT
sequence from IL5335; zrg22–zrg45: RT sequence from IL5243
142 植物学报 48(2) 2013


图2 实时荧光定量PCR检测东乡野生稻耐冷渐渗系及其双亲
中Ty1-copia类逆转座子逆转录酶基因(houba(A)、osr15(B)和
osr17(C))的相对表达量
xb: 协青早B; A44:东乡野生稻; IL5335: 渐渗系IL5335; IL-
5243: 渐渗系IL5243

Figure 2 Real-time quantitative PCR analysis of reverse
transcriptase gene (houba(A), osr15(B) and osr17(C)) ex-
pression of Ty1-copia like retrotransposon in cold tolerance
introgression lines and their parents
xb: Oryza sativa cv. ‘Xieqingzao B’; A44: Dongxiang wild rice;
IL5335: Introgression line IL5335; IL5243: Introgression line
IL5243


2010; Wang et al., 2011)。
植物逆转座子的表达活性与其转座潜能密切相
关, 进而对植物基因的表达及表型性状产生重要影响
(Butelli et al., 2012)。本文的荧光定量表达分析结果
显示, 水稻Ty1-copia类逆转座子houba、osr15以及
osr17在耐冷渐渗系IL5335和IL5243中的表达量均明
显高于受体亲本。这与菰(Zizania latifolia)DNA渐渗
杂交能够引起水稻基因组中LTR类逆转座子Tos17、
RIRE2、Copia076 (Liu and Wendel, 2000; Wang et
al., 2010)以及MITE类转座子mPing及其转座伙伴
Pong (Shan et al., 2005)的激活特点相似。前人研究
认为, 这可能是由于远缘渐渗杂交打破了基因组内部
表观遗传抑制控制 (如甲基化状态的改变 )的结果
(Zhao et al., 2007)。至于耐冷渐渗系中逆转座子激活
机制是否与其它作物一致以及逆转座子的拷贝数如
何发生改变均有待进一步深入研究。
本研究还发现, 逆转座子houba、osr15和osr17
在不同的渐渗系中表达活性不同 , 即耐冷渐渗系
IL5335中的逆转座子的表达活性远高于IL5243。而我
们通过田间试验观察发现, 耐冷渐渗系IL5335的自
交后代在株高和谷粒颜色等性状上具一定的变异 ,
IL5243的自交后代则表型一致, 性状基本稳定。因此,
耐冷渐渗系中3个逆转座子的活性与表型稳定性呈负
相关。据此推测渐渗杂交所引起的表型不稳定可能与
逆转座子的激活有一定的相关性, 但耐冷渐渗系中具
体的表型变异与何种逆转座子激活有关尚需进一步
深入研究。
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144 植物学报 48(2) 2013
Cloning and Expression Analysis of Retrotransposon Reverse
Transcriptase in Introgression Lines from Dongxiang Wild Rice
Yaling Chen1, Xiangdong Luo1*, Fantao Zhang1, Liangfang Dai1, Biaolin Hu2, Jiankun Xie1*
1College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 2Rice Research Institute,
Jiangxi Academy of Agricultural Science, Nanchang 330200, China
Abstract We used the cold-tolerance introgression lines IL5335 and IL5243 from Oryza sativa cv. ‘Xieqingzao B’
crossed with Dongxiang wild rice (O. rufipogon) and their parents to examine our cloned 75 highly heterogeneous se-
quences of Ty1-copia retrotransposon reverse transcriptase (RT). Cluster and alignment analyses revealed 7 families for
these RT sequences: 65 RT sequences were in families 6 and 7, with similarity from 44.9% to 99.3%. Families 1–5 con-
tained only 10 RT sequences; 8 came from introgression lines. As compared with their parents, in introgression lines, the
similarity of RT sequences ranged from 29.2% to 52.8%, and some RT sequences showed deletion or insertion mutation.
Real-time quantitative PCR revealed that the expression of houba, osr15 and osr17 RT sequences in IL5335 and IL5243
was 1.50 to 5.07 times higher than in the parents. Thus, the structure and expression of RT sequences in IL5335 and
IL5243 changed during introgressive hybridization. These results provide useful information for further investigation of
epigenetic phenomenon induced by alien gene introgression.
Key words Dongxiang wild rice, expression activity, introgression lines, retrotransposon
Chen YL, Luo XD, Zhang FT, Dai LF, Hu BL, Xie JK (2013). Cloning and expression analysis of retrotransposon reverse
transcriptase in introgression lines from Dongxiang wild rice. Chin Bull Bot 48, 138–144.
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* Authors for correspondence. E-mail: xdluolf@163.com; xiejiankun@yahoo.com
(责任编辑: 孙冬花)