全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (5): 507–518, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00507
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收稿日期: 2013-01-09; 接受日期: 2013-05-10
基金项目: 国家重点基础研究发展规划(No.2012CB114502)和国家自然科学基金(No.31070534)
* 通讯作者。E-mail: sflu@implad.ac.cn
实时荧光定量PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证
苏晓娟1, 2, 樊保国1, 袁丽钗2, 崔秀娜2, 卢善发2*
1山西师范大学生命科学学院, 临汾 041000; 2中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193
摘要 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术具有高灵敏性、高保真性和高特异性, 被广泛应用于基因表达的分析。在数据处
理过程中, 选用稳定表达的基因作为内参基因对准确分析实验结果非常关键。以毛果杨(Populus trichocarpa)的不同组织以
及锌胁迫下的组培苗为材料, 使用荧光定量PCR方法分析了TUA8、TUB6、ubiquitin、GAPDH、actin、18S rRNA和EF1α
7个看家基因的表达情况。通过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个程序的综合分析, 发现actin、ubiquitin、EF1α和
18S rRNA的稳定性较好, 可用作毛果杨基因表达研究的内参基因; 而TUB6在不同组织中稳定性最差; GAPDH在锌胁迫下
的组织中稳定性最差, 因此不适宜作为内参基因。毛果杨NAC基因的表达分析, 进一步验证了上述结果。该研究对采用
qRT-PCR方法分析毛果杨基因表达过程中内参基因的选择具有指导作用, 同时对揭示NAC基因的功能也有一定的意义。
关键词 NAC基因, 毛果杨, 实时定量PCR, 内参基因, 锌胁迫
苏晓娟, 樊保国, 袁丽钗, 崔秀娜, 卢善发 (2013). 实时荧光定量PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证. 植物学报
48, 507–518.
杨树为杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)植物
落叶乔木的统称, 具有生长周期短、适应性强、分布
广、容易改良和容易无性繁殖等特点, 是一种重要的
经济作物。杨树木材可以用来生产家具、火柴梗、锯
材、建筑材、人造板及纤维用品等。近几年来, 随着
世界能源的消耗, 杨树木材作为一种潜在的生物新能
源的来源备受关注。毛果杨(Populus trichocarpa)是
一种重要的杨树。随着其全基因组的解码, 它已成为
继拟南芥 (Arabidopsis thaliana)和水稻 (Oryza sa-
tiva)之后的第3种植物学研究的模式植物。有关毛果
杨基因功能的研究方兴未艾。
最常用的检测基因表达水平的方法有DNA微阵
列(DNA microarray)、Northern印迹(northern blot)、
原位杂交 (in situ hybridization, ISH)和实时定量
PCR(quantitative real-time polymerase chain, qRT-
PCR)等。其中, qRT-PCR是定量分析mRNA表达中最
通用、最快速且最简单的方法, 具有高灵敏性和特异
性, 已被广泛应用于分子医学、生物科学、微生物学
以及诊断学等领域(Bustin, 2002, Bustin et al., 2005;
Nolan et al., 2006)。也正是这些优点使得它对RNA
的质量和完整性以及模板cDNA的质量和数量、引物
的特异性、扩增效率、内参基因的选择等要求严格
(Bustin, 2000; VanGuilder et al., 2008)。选择不合理
的内参基因将会给实验结果带来很大误差。一个理想
的内参基因应该在任何实验环境和条件下均能稳定
表达。内参基因是细胞的基本转录组成分, 参与维持
细胞的基本功能, 且与要分析的目标基因有相似的表
达水平(Thellin et al., 1999; Schmittgen and Zakra-
jsek, 2000; Suzuki et al., 2000; Warrington et al.,
2000; Dheda et al., 2004; Udvardi et al., 2008; 袁伟
等, 2012)。目前, 常用的看家基因有很多, 包括甘油
醛磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate, GAP-
DH)、肌动蛋白(actin)、泛素(ubiquitin, UBQ)、泛素
结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC)、18S
核糖体 RNA(18S rRNA)、 25S核糖体 RNA(25S
rRNA)、转录延伸因子(elongation factor 1 alpha,
EF1α)、微管蛋白(tubulin beta, TUB)和翻译延长因子
(translation elongation factor, TEF)等的编码基因
(Bustin, 2002; Kim et al., 2003)。不过, 许多看家基
因的转录水平会随植物发育阶段和实验条件的不同
·研究报告·
508 植物学报 48(5) 2013
而有所不同 (Thellin et al., 1999; Dheda et al.,
2004)。至今还没有发现一个适合作为所有条件下基
因表达分析的内参基因的看家基因(Thellin et al.,
1999; Schmittgen and Zakrajsek, 2000; Suzuki et
al., 2000; Warrington et al., 2000)。例如, Mehdi
Khanlou和Van Bockstaele(2012)研究发现, 红三叶
(Trifolium pratense)的UBC2和UBQ10是叶中表达最
稳定的2个看家基因, UBC2和YLS8在茎中表达比较
稳定, EIF-4a和UBC2在根中表达稳定, 而GAPDH和
SAND在各个组织中的稳定性均较低。此外, ACT、
ubiquitin、18S rRNA、EF1α、TUB和TUA等已应用
于杨树基因表达的分析中, 但在系统筛选方面尚有欠
缺(Regier and Frey, 2010; Xu et al., 2011; Pettengill
et al., 2012)。为了增加qRT-PCR数据的准确性, 系
统分析这些常用看家基因的稳定性非常重要。
为此, 本研究系统分析了7个看家基因(TUA8、
TUB6、ubiquitin、GAPDH、actin、18S rRNA和EF1α)
在8个毛果杨组织以及锌胁迫下的组培苗根、茎、叶
中的表达。其中, actin、ubiquitin和EF1α曾被用于分
析干旱胁迫条件下杨树基因的表达(Pettengill et al.,
2012)。获得的数据经geNorm (Vandesompele et al.,
2002)、NormFinder (Andersen et al., 2004)和Best-
Keeper (Pfaffl et al., 2004)3个统计学软件评估决定
各看家基因的稳定性。通过用上述看家基因比较分析
毛果杨NAC基因的表达数据, 结合验证软件的评估
结果所得的稳定性, 最终发现actin、ubiquitin、EF1α
和18S rRNA的稳定性较好, 可用作毛果杨基因表达
研究的内参基因。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验所用毛果杨 (Populus trichocarpa Torr. &
Gray)不同组织的材料取自中国医学科学院药用植物
研究所人工气候室一年生毛果杨; 锌胁迫下不同组织
的材料取自温室生长2个月且长势一致的毛果杨组培
苗。
1.2 实验试剂与仪器
1.2.1 试剂
RNA提取试剂采用百泰克公司的裂解液PL。反转录
试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase购自美
国Invitrogen公司。DNA消化酶、DNA Marker及实时
定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。引物由生
工生物工程(上海)有限公司北京分公司合成。

1.2.2 仪器
荧光定量仪器为CFX-96实时荧光定量PCR仪(BIO-
RAD)。
1.3 方法
1.3.1 杨树RNA的提取与纯化
从一年生毛果杨植株上由上向下取第2、3(Le2-3)和
第5(Le5)个叶片、第2–3节间(St2-3)及第4–6节间正分
化的木质部(Xy4-6)和韧皮部(Ph4-6)组织、第12–25
节间正分化的木质部(Xy12-25)和韧皮部(Ph12-25)
组织以及幼根(Rt), 迅速置于液氮中保存。参照RNA
裂解液试剂盒提取使用说明提取总RNA。获得的总
RNA用DNA酶处理, 去除基因组DNA污染。之后, 用
Nanodrop核酸分析仪测定总RNA的浓度和纯度。再
用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。
取生长2个月且长势一致的毛果杨组培苗顶芽
(1–2 cm), 分别在含有0、1、40 µmol·L–1ZnSO4的
WPM培养基中培养20天。收集根、茎、叶, 置于液
氮中保存。RNA提取的具体步骤参照崔秀娜等(2012)
所述方法。

1.3.2 cDNA第1链的合成
cDNA链的合成按照SuperScript III (Invitrogen)试剂
盒说明书要求进行。配制20 µL的反应体系: 总RNA
1.5 µg, 1 µL随机引物(100 µmol·L–1), 1 µL dNTP mix
(10 mmol·L–1), 加DEPC水补足至20 µL。65 °C加热5
分钟后, 迅速放在冰上2分钟, 然后于4 000 × g离心
10秒。加入4 µL 5×First stand Buffer, 1 µL DTT (100
mmol·L–1), 1 µL RRI, 1 µL Super script III, 再于
4 000 × g离心15秒。最后, 50°C反应45分钟。终止反
应采用70°C加热15分钟。稀释40倍后放入–20°C冰箱
中保存备用。

1.3.3 看家基因的选择和引物设计
7个看家基因分别是α微管蛋白、β微管蛋白、泛素、
甘油醛磷酸脱氢酶、肌动蛋白、18S核糖体RNA和转
苏晓娟等: 实时荧光定量 PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证 509
录延伸因子的编码基因, 即TUA8、TUB6、ubiquitin、
GAPDH、actin、18S rRNA和EF1α(表1)。目标基因
NAC的序列在毛果杨基因组数据库(relase2.0, http://
www.phytozome.net/poplar)中查寻。引物通过网站
IDTdna (http://www.idtdna.com/scitools/applications/
primerquest/results.aspx)设计 , 参数设置如下 : 扩
增长度80–200个碱基对, 引物序列长度17–25个碱
基, GC含量45%–55%, Forward引物与Reverse引物
的TM值不能相差太大。

1.3.4 PCR反应条件
采用大连宝生物工程有限公司的SYBRR Premix Ex
TaqTMII实时定量PCR试剂盒进行定量分析。使用
Bio-Radi Cycler IQ实时定量PCR仪和96孔板。每个
孔按照20 µL体系加样: 4 µL模板cDNA, 0.8 µL For-
ward引物 (10 µmol·L–1), 0.8 µL Reverse引物 (10
µmol·L–1), 10 µL SYBRR Premix Ex TaqTM II, 4.4 µL
无菌水。每个样品重复3次。扩增反应程序为: 95°C
预变性30秒; 95°C变性5秒, 60°C退火18秒, 72°C延
伸15秒, 39个循环。采集溶解曲线荧光信号。实验数
据采用相对定量法分析。

1.3.5 引物扩增效率的计算
等量取8个样品的cDNA模板, 混合后依次稀释6个梯
度, 每个梯度稀释5倍, 则浓度分别为1、1/5、1/25、
1/625、1/3125和1/15625倍。每个反应设4个重复。
溶解温度通过PCR仪自带的计算软件CFX Mana-
gerTM Software得到。根据所得CT值绘制标准曲线,
得到斜率k和线性相关系数R2。根据公式E=5–1/K–1,
计算得出扩增效率E。


表1 看家基因和NAC目标基因的名称、登录号、引物序列、引物位置及扩增效率
Table 1 The name, accession number, primer sequence, primer location and amplification efficiency of seven housekeeping
and four NAC genes
Gene name Accession number Primer sequence (5’–3’) PL

TM
(°C)
AL
(bp)
AE
(%)
R2
actin EF418792.1 (F)TCATCGGAATGGAAGCTGCTGGTA
(R)TAGTGGAACCACCACTGAGCACAA
954–978
1 046–1 070
79.5 117 102.98

0.998 1
ubiquitin FJ438462.1 (F)AAGATCCAGGACAAGGAGGGCATT
(R)TCTTGCCAGTGAGGGTCTTCACAA
365–389
518–542
86.0

178 103.92

0.999 2
EF1α GQ253565.1 (F)ATTGACAGGCGGTCTGGTAAGGAA
(R)AAACGACCAAGTGGAGGATACGCT
70–94
182–206
83.5

137 100.57

0.998 2
18S rRNA AY652861.1 (F)TTAACGAGGATCCATTGGAGGGCA
(R)ACCCAACCCAAAGTCCAACTACGA
503–527
596–620
82.5

118 102.16

0.999 3
TUA8 XM_002325386 (F)ATACAGCCTGATGGAACGATGCCT
(R) ATAGCTCTCGGCACATGCTTTCCT
179–183
264–288
81.5

110 99.48

0.999 4
TUB6 XM_002323509 (F) TCTGACCTCACGTGGTTCACAACA
(R)GTCTGCTGCGCACATCATGTTCTT
826–850
898–922
82.8 97 104.22

1
GAPDH FN396887.1 (F)TAGGCTGTTGGAAAGGTTCTGCCA
(R) TGCCTTCTTCTCAAGCCTGACAGT
299–323
391–415
82.5 117 99.88

0.998 3
PNAC041 POPTR_0005s101
00.1
(F)TCAACAAGTGTGAGCCGTGGGATA
(R)TTTCTCATGCCAACAAGAGTGCCC
164–188
329–353
83.5 190 98.59 0.998 0
PNAC042

POPTR_0007s084
20.1/POPTR_0007
s08430.1
(F)TACGTAAGGGAACCCTTGTTGGCA
(R) GTTTGGCCACAACTTCTCTGGTGT
323–347
481–505
82.5 183 103.16

0.998 9
PNAC154 POPTR_0015s021
70.1
(F)AAGCCACAGGGAAAGACAAGGAGA
(R)ACACCCTGCAGATCACCCATTCAT
296–320
469–493
81.5 198 102.32

0.998 7
PNAC155 POPTR_0012s016
10.1
(F)AGCTCGGCTGGAAAGAAGACCTAT
(R)ATGGTGGCAGACCATAAGGGCTAA
502–526
565–589
78.5 88 101.56 0.998 3
PL: 引物在CDS序列上的位置; TM: 溶解温度; AL: 扩增长度; AE: 扩增效率; R2: 确定系数
PL: Primer location in coding sequence; TM: Melting temperature; AL: Amplification length; AE: Amplification efficiency; R2: Co-
efficient of determination

510 植物学报 48(5) 2013
1.3.6 内参基因引物特异性鉴定
将qRT-PCR反应产物进行琼脂糖(2%)凝胶电泳, 分
析扩增长度、电泳条带数及是否有非特异性扩增等。

1.3.7 数据处理与分析
使用geNorm、Normfider和BestKeeper3个软件分析
看家基因在毛果杨8个组织以及锌胁迫下的组培苗
根、茎、叶中的表达稳定性指数。其中geNorm和
Normfider程序需要将CT值转化成Q值后, 方可进行
分析。转化公式为Q=Ect min–ct sample(E为基因的扩增效
率。当扩增效率接近100%时 , E通常默认为2。ct
sample为该基因在各个组织中的CT值, ct min为该基
因在所有组织中最小的CT值)。BestKeeper软件可以
直接对各看家基因的CT值进行分析。
2 结果与讨论
2.1 毛果杨RNA的分离与纯化
用裂解液提取毛果杨8个组织的总RNA, DNA酶消化
处理后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测, 发现电泳条带
清晰, 没有弥散现象, 且28S rRNA带比18S rRNA带
亮, 说明RNA的完整性良好, 没有降解(图1)。再用
Nanodrop检测RNA的浓度和纯度, 结果表明A260/
280和A260/230均在2.0–2.1之间, 说明RNA的纯度
较高, 符合后续实验的要求。用Trizol试剂提取锌胁迫
下的毛果杨组培苗的根、茎、叶总RNA, 经检测完整
性较好。具体操作方法参见崔秀娜等(2012)所述。
2.2 扩增效率和扩增特异性分析
根据已知的看家基因序列, 设计TM值在78.5–86°C
之间的特异性引物。以5倍浓度梯度稀释的cDNA为模
板, 进行qRT-PCR扩增, 根据获得的数据作7个看家
基因的标准曲线。结果显示各看家基因的决定系数R²
≥0.990, 引物的扩增效率在95.0%–105.0%之间,
均符合qRT-PCR对扩增效率的要求(表1)。PCR产物
经2%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果表明所得目的条带
大小与理论值一致, 且没有发现其它条带, 不存在非
特异性扩增(图2)。进一步分析溶解曲线, 发现各看家
基因都只产生单一的溶解峰, 各重复样品间的曲线重
复性好, 未加模板的对照组无对应信号(图3)。上述结
果说明所设计引物的特异性良好, qRT-PCR反应的


图1 毛果杨总RNA的电泳检测图谱
用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测一年生毛果杨植株由上往下的
第2、3(Le2-3)和第5(Le5)个叶片、第2–3节间(St2-3)、第4–6
节间正分化的木质部(Xy4-6)和韧皮部(Ph4-6)组织、第12–25
节间正分化的木质部(Xy12-25)和韧皮部(Ph12-25)组织以及幼
根(Rt)中提取的总RNA。

Figure 1 Agarose gel analysis of total RNA extracted from
various tissues of Populus trichocarpa
Total RNA extracted from various tissues, including the 2nd,
3rd (Le2-3)and 5th (Le5) leaves, stem internodes from the
leaf plastochron index (LPI) 2–3 (St2-3), developing xylem
(Xy4-6) and phloem (Ph4-6) tissues from LPI 4–6, developing
xylem (Xy12-25) and phloem (Ph12-25) tissues from LPI 12–
25 and young roots (Rt), was separated on a 1.2% agarose
gel.

专一性高, 结果准确可靠。
2.3 看家基因CT值分析
CT值与基因的表达量成反比, 即CT值越大, 表达量
越小, 反之亦然。qRT-PCR的结果表明, 7个看家基因
的CT值在10–33之间, 其中18S rRNA的CT值最低,
在10–14之间; TUA8和TUB6的CT值较高, 在25–33
之间; actin、ubiquitin和EF1α的CT值则在21–29之间
(图4), 说明各看家基因的表达量不同, 有的差别较
大。
2.4 看家基因稳定性分析
我们用BestKeeper、geNorm和NormFinder3个软件
对7个看家基因的稳定性进行统计学分析。这3个软件
均基于qRT-PCR后得到的CT值进行分析。其中best-
苏晓娟等: 实时荧光定量 PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证 511


图2 qRT-PCR扩增产物的特异性
用2%琼脂糖凝胶电泳分析7个看家基因和4个NAC基因的
qRT-PCR扩增产物。M: 100 bp DNA ladder marker; 1:
PNAC154; 2: PNAC155; 3: PNAC042; 4: PNAC041; 5: actin;
6: ubiquitin; 7: EF1α; 8: 18S rRNA; 9: GAPDH; 10: TUA8; 11:
TUB6

Figure 2 The specificity of qRT-PCR amplification
qRT-PCR products of seven housekeeping and four NAC
genes were analyzed on a 2% agarose gel. M: 100 bp DNA
ladder marker; 1: PNAC154; 2: PNAC155; 3: PNAC042; 4:
PNAC041; 5: actin; 6: ubiquitin; 7: EF1α; 8: 18S rRNA; 9:
GAPDH; 10: TUA8; 11: TUB6


Keeper程序可以直接对CT值进行分析; 而geNorm
和NormFinder软件则需要将CT值转换成相对表达量
再进行分析。

2.4.1 geNorm分析
geNorm V3.5软件根据平均表达稳定指数M值确定最
稳定的看家基因。M值越大, 基因的稳定性越低, 反
之则越高。以M=1.5为上限, 只有小于1.5的才被认为
相对较为稳定。geNorm分析结果表明, 7个看家基因
的M值均小于1.5, 说明7个看家基因都较为稳定。在7
个看家基因中, actin和ubiquitin的M值最低, 说明它
们的稳定性较好; TUB6的M值最高, 稳定性也是所选
看家基因中最差的; 其余4个看家基因的M值则介于
它们之间。7个看家基因的稳定性从高到低依次为:
actin=ubiquitin>18S rRNA>EF1α>GAPDH>TUA8>
TUB6 (图5)。

2.4.2 BestKeeper分析
BestKeeper程序依据看家基因的CT值用EXCEL软
件计算标准偏差SD。SD值越小, 基因的稳定性越好。
若SD>1, 则认为该基因不稳定。分析结果(表2)显示,
TUA8、TUB6和GAPDH的SD值大于1, 其余都小于
1。按照稳定性从高到低排序依次为EF1α>ubiquitin>
18S rRNA>actin>GAPDH>TUA8>TUB6。

2.4.3 NormFinder分析
NormFinder程序用EXCEL软件计算基因的稳定值
M。M值越低, 则该基因越稳定。经计算获得7个看家
基因的M值。如表3所示, actin的M值最低, 说明它是
所选看家基因中稳定性最好的; TUB6的M值最高, 说
明它的稳定性最差。7个看家基因按照稳定性从高到
低排序依次为 : actin>18S rRNA>ubiquitin>TUA8>
GAPDH>EF1α>TUB6。
2.5 锌胁迫下看家基因的稳定性分析
使用BestKeeper、geNorm和NormFinder 3个软件对
锌胁迫下毛果杨组培苗根、茎、叶中7个看家基因的
稳定性进行统计学分析(表4)。geNorm软件分析结果
显示, EF1α和18S rRNA的M值最低, 说明它们的稳
定性较好; GAPDH的M值最高, 稳定性较差; 7个看家
基因按照稳定性从高到低排序依次为 : EF1α=18S
rRNA>ubiquitin>actin>TUA8>TUB6>GAPDH。Best-
Keeper软件分析结果显示, ubiquitin的SD值最低, 稳
定性较好; GAPDH的SD值大于1, 稳定性最差; 7个
看家基因的稳定性排序为ubiquitin>18S rRNA>actin
>EF1α>TUA8>TUB6> GAPDH。NormFinder软件分
析结果显示, EF1α的M值最低, 说明其稳定性较好;
稳定性排序为EF1α> actin>18S rRNA>TUA8>ubi-
quitin>TUB6>GAPDH。综合3个软件的分析结果表
明, ubiquitin、EF1α、18S rRNA和actin的稳定性较好,
GAPDH的稳定性最差。
2.6 看家基因稳定性验证
为了验证上述结果, 研究不同的看家基因作为qRT-
PCR分析基因表达时的内参基因对实验结果的影响,
我们采用qRT-PCR法分析了4个受微小RNA(miR-
164)调控且功能未知的毛果杨NAC转录因子家族基
因的表达(Lu et al., 2008)。分别以7个看家基因为内
参基因分析4个NAC家族基因的相对表达量, 发现以
actin、ubiquitin、EF1α和18S rRNA为内参基因时在
512 植物学报 48(5) 2013


图3 7个看家基因和4个NAC目标基因的溶解峰

Figure 3 Melting curves produced from qRT-PCR products of seven housekeeping and four NAC target genes

各组织中的表达趋势基本一致; 而以GAPDH、TUA8
和TUB6为内参基因时的表达趋势则与前几个明显不
同。其中PNAC041在第5个叶片(Le5), PNAC042在
第2、3(Le2-3)和第5(Le5)个叶片以及嫩茎(St2-3)中的
表达显著不同, 在其它组织部位的趋势基本一致。
PNAC154和PNAC155在第5(Le5)个叶片中的表达量
苏晓娟等: 实时荧光定量 PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证 513


图4 看家基因的CT值
图中显示7个看家基因18S rRNA、actin、ubiquitin、GAPDH、
TUA8、TUB6和EF1α在1年生毛果杨植株由上向下的第2、
3(Le2-3)和第5(Le5)个叶片、第2–3节间(St2-3)及第4–6节间正
分化的木质部(Xy4-6)和韧皮部(Ph4-6)组织、第12–25节间正分
化的木质部(Xy12-25)和韧皮部(Ph12-25)组织以及幼根(Rt)中
表达的qRT-PCR分析结果

Figure 4 The CT value of housekeeping genes
It shows the results from qRT-PCR analysis of seven
housekeeping genes, including 18S rRNA, actin, ubiquitin,
GAPDH, TUA8, TUB6 and EF1α, in one-year-old Populus
trichocarpa tissues, including the 2nd, 3rd (Le2-3) and 5th
(Le5) leaves, stem internodes from the leaf plastochron index
(LPI) 2–3 (St2-3), developing xylem (Xy4-6) and phloem
(Ph4-6) tissues from LPI 4–6, developing xylem (Xy12-25)
and phloem (Ph12-25) tissues from LPI 12–25 and young
roots (Rt)


不同(图6)。上述结果说明, 在用qRT-PCR分析基因表
达时选择不恰当的内参基因将可能导致错误估计目标
基因的相对表达量, 由此可见内参基因选择的重要性。
此外, 我们发现所分析的PNAC041和PNAC154基因
在根中的表达量很高, 在其它部位基本不表达, 说明
它们特异地调控根的发育。PNAC042在第4–6节间正
分化的木质部(Xy4-6)表达量很高, 在第2、3(Le2-3)和


图5 geNorm程序分析7个看家基因的平均表达稳定性指数M

Figure 5 The average expression stability value (M) of
seven housekeeping genes calculated by geNorm

第5(Le5)个叶片及嫩茎次之, 其它部位较低; PNAC-
155在根中最高, 在第4–6节间(Ph4-6)及第12–25节
间(Ph12-25)正分化韧皮部组织的表达量次之, 其它
部位较低。这些结果与Hu等(2010)的研究结果基本一
致, 将为进一步研究该家族基因的功能奠定基础。
2.7 讨论
近年来, qRT-PCR技术凭借其特异性强、灵敏度高、
重复性好和快速高效等优点被广泛用于基因表达的
研究(Udvardi et al., 2008)。应用qRT-PCR技术分析
基因表达时, 内参基因的选择很重要。如果选用不恰
当的内参基因, 有可能得出错误的结论。因此, 正式
分析目标基因的表达之前, 很有必要对看家基因进行
筛选。本研究系统分析了α微管蛋白(TUA8)、β微管
蛋白(TUB6)、泛素(ubiquitin)、甘油醛磷酸脱氢酶
(GAPDH)、肌动蛋白(actin)、18S核糖体RNA(18S
rRNA)和转录延伸因子(EF1α)7个看家基因在8个毛
果杨组织中以及锌处理的毛果杨组培苗根、茎、叶中
的表达。经geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个
常用于分析看家基因稳定性的软件评估(Vandesom-

514 植物学报 48(5) 2013
表2 用BestKeeper软件分析看家基因的表达稳定性
Table 2 Expression stability of housekeeping genes analyzed by BestKeeper
EF1α ubiquitin 18s rRNA actin GAPDH TUA8 TUB6
Geo mean [CP] 23.558 23.787 893 7 12.139 4 25.690 950 78 26.062 62 29.795 88 27.591 72
Ar mean [CP] 23.580 83 23.807 083 3 12.180 42 25.712 916 67 26.113 33 29.835 42 27.669 58
Min [CP] 21.753 33 22.316 666 7 10.79 24.41 23.113 33 27.343 33 25.736 67
Max [CP] 25.08 25.193 333 3 13.546 67 27.66 28.32 32.263 33 32.723 33
SD [± CP] 0.823 125 0.832 187 5 0.855 313 0.875 312 5 1.294 167 1.357 083 1.633 646
Stability rank 1 2 3 4 5 6 7
CP: CT值; Geo mean: 几何平均值; Ar mean: 算数平均值; SD: 标准差
CP: CT value; Geo mean: Geometric mean; Ar mean: Arithmetic mean; SD: Standard deviation

表3 用NormFinder软件分析看家基因的表达稳定性
Table 3 Expression stability of housekeeping genes ana-
lyzed by NormFinder
Gene name M Stability rank
actin 0.226 753 77 1
18s rRNA 0.409 391 14 2
ubiquitin 0.429 235 82 3
TUA8 0.432 697 45 4
GAPDH 0.485 544 35 5
EF1α 0.501 105 54 6
TUB6 1.131 130 31 7

pele et al., 2002; Andersen et al., 2004; Pfaffl et al.,
2004), 结果表明这些内参基因的排序略有不同, 这
种不一致性可能是由于计算机软件的统计学算法不
同造成的(Hu et al., 2010)。这种现象在柑橘(Citrus
reticulata)以及其它植物看家基因的研究中也曾出现
(Hong et al., 2008; Wan et al., 2010; Huis et al.,
2010; Mafra et al., 2012)。
综合来看, actin、ubiquitin和EF1α的稳定性较
好。actin是细胞骨架的主要成分, 几乎在所有真核细

表4 用geNorm、 BestKeeper和NormFinder统计学软件分析看家基因的表达稳定性
Table 4 Expression stability of housekeeping genes analyzed by geNorm, BestKeeper, and NormFinder
geNorm BestKeeper NormFinder Gene name
M value Stability rank SD[±CP] Stability rank M value Stability rank
ubiquitin 0.445 006 3 0.170 123 1 0.377 571 5
18s rRNA 0.380 386 1 0.325 679 2 0.282 673 3
actin 0.483 390 4 0.366 996 3 0.263 997 2
EF1α 0.380 386 2 0.383 374 4 0.131 832 1
TUA8 0.536 548 5 0.542 798 5 0.367 552 4
TUB6 0.590 513 6 0.696 626 6 0.380 906 6
GAPDH 0.814 547 7 1.188 313 7 0.907 506 7

→
图6 以不同的看家基因为内参基因分析目标基因NAC的表达
分别以actin、ubiquitin、EF1α、18S rRNA、GAPDH、TUA8和TUB6为内参基因分析PNAC041、PNAC042、PNAC154和PNAC155
四个NAC家族基因在1年生毛果杨植株由上向下的第2、3(Le2-3)和第5(Le5)个叶片、第2–3节间(St2-3)及第4–6节间正分化的木质
部(Xy4-6)和韧皮部(Ph4-6)组织、第12–25节间正分化的木质部(Xy12-25)和韧皮部(Ph12-25)组织以及幼根(Rt)中的表达。纵坐标为
NAC基因表达倍数的变化。在Le5中的表达设为1。

Figure 6 The expression of NAC genes analyzed using various housekeeping genes as references
Relative expression of four NAC genes, including PNAC041, PNAC042, PNAC154 and PNAC155, in one-year-old Populus
trichocarpa tissues, including the 2nd, 3rd (Le2-3) and 5th (Le5) leaves, stem internodes from the leaf plastochron index (LPI)
2–3 (St2-3), developing xylem (Xy4-6) and phloem (Ph4-6) tissues from LPI 4–6, developing xylem (Xy12-25) and phloem
(Ph12-25) tissues from LPI 12–25 and young roots (Rt), was analyzed using the qRT-PCR method. Housekeeping genes, in-
cluding actin, ubiquitin, EF1α, 18S rRNA, GAPDH, TUA8 and TUB6, were used as references. Fold changes of NAC gene ex-
pression are shown. The level of each gene in Le5 was arbitrarily set to 1.
苏晓娟等: 实时荧光定量 PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证 515
胞中均有表达 , 是RT-PCR内参基因的最佳选择
(Santella and Chun, 2011)。Ubiquitin是广泛存在于
真核细胞中的热稳定多肽, 进化上高度保守, 在介导
蛋白质降解、转录调节和应激反应中发挥重要作用
(Hochstrasser, 2000)。EF1α是一种重要的多功能蛋
白, 参与许多重要的细胞学过程, 包括信号转导、翻
译控制、凋亡、细胞骨架组成、病毒复制及癌基因转
化等(Zhou et al., 2007)。在干旱胁迫下的杨树组织
中, 这3个基因的表达也很稳定(Pettengill et al.,
2012)。此外, ACT7、EF1α和UBQ在梧桐(Firmiana


516 植物学报 48(5) 2013
simplex)种子不同发育阶段中的表达比较稳定(Han
et al., 2012); β-actin在茶树(Camellia sinensis)不同
器官组织中的表达较稳定(孙美莲等, 2010); actin和
ubiquitin是丹参(Salvia miltiorrhiza)中稳定性最好的2
个看家基因(Yang et al., 2010); ACT11和EF1α在荷
花(Nelumbo nucifera)中表达较为稳定(Luo et al.,
2010); ACT7是油菜(Brassica campestris)胚胎中最
稳定的看家基因(Chen et al., 2010); 在菊苣(Cic-
horium endivia)和番茄(Lycopersicon esculentum)叶
子及根组织中ACT最为稳定(Løvdal and Lillo, 2009;
Maroufi et al., 2010; Xu et al., 2011); 在黑麦草
(Lolium perenne)和葡萄(Vitis vinifera)浆果的不同
发育阶段、黄瓜(Cucumis sativus)和杨树的多个组织
中EF1α最稳定 (Reid et al., 2006; Martin, 2008;
Basa et al., 2009; Boava et al., 2010)。诸多研究进
一步说明actin、ubiquitin和EF1α三个看家基因均适合
作为杨树基因表达研究中的内参基因。另外, 从本研
究结果看, 18S rRNA的CT值最低, 表达丰度很高,
但这并未影响其稳定性。以18S rRNA为内参基因分
析NAC基因的表达, 发现总体表达趋势与使用其它
内参基因的结果一致。Brunner等在对杨树不定根基
因表达的研究中(Xu et al., 2011), 也得出类似的结
论。说明18S rRNA同样适合作为杨树的内参基因。
本研究中GAPDH、TUA8和TUB6的稳定性排在
最后3位。在其它实验中也发现了类似的结果。
GAPDH在桉树(Eucalyptus spp.)和矮牵牛(Petunia
hybrida)中均不稳定(Boava et al., 2010; Mallona et
al., 2010); 在柑橘和黑腹果蝇(Drosophila melano-
gaster)的研究中, 发现TUB6的稳定性最差(Carvalho
et al., 2010; Ponton et al., 2011; Mafra et al.,
2012)。从本研究中NAC的表达结果来看, 以actin、
ubiquitin、EF1α和18S rRNA为内参基因时, 其在各
组织中的表达趋势基本一致; 而以GAPDH、TUA8和
TUB6为内参基因时其表达趋势与前几个明显不同,
说明TUA8、TUB6和GAPDH 3个基因不适合作杨树
的内参基因。另外, PNAC041和PNAC154基因在根
中的表达量很高, 初步预测该基因可能与根的发育有
关。PNAC042在第4–6节间正分化的木质部(Xy4-6)
表达量很高, 在第2、3(Le2-3)和第5(Le5)个叶片及嫩
茎中次之, 说明该基因可能参与调控初生木质部和叶
片的发育。PNAC155在根中的表达量最高, 在第4–6
及第12–25节间正分化的韧皮部(Ph4-6)组织的表达
次之, 说明该基因可能参与调控初生和次生韧皮部的
发育。由于这4个NAC基因是miR164的靶基因, 因此
上述研究结果不仅为了解NAC基因的功能且为进一
步阐明miR164的作用奠定了基础。
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Selection and Validation of Reference Genes for Quantitative
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Xiaojuan Su1, 2, Baoguo Fan1, Lichai Yuan2, Xiuna Cui2, Shanfa Lu2*
1College of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen 041000, China; 2Institute of Medicinal Plant Development, Chi-
nese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
Abstract Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) has been widely used in gene expression analysis because of its sensitivity,
specificity, and reproducibility. Application of suitable reference genes to normalize qRT-PCR data is critical in analyzing
PCR results. We analyzed the expression patterns of 7 housekeeping genes, including TUA8, TUB6, ubiquitin, GAPDH,
actin, 18S rRNA and EF1α, in various tissues of greenhouse-grown Populus trichocarpa and Zn-treated in vitro plantlets.
The stability of housekeeping gene expression was analyzed with use of 3 software packages, including geNorm, Norm-
Finder, and BestKeeper. The genes actin, ubiquitin, EF1α and 18S rRNA were suitable reference genes for efficient
normalization of qRT-PCR data, whereas TUB6 and GAPDH were not suitable for analysis of greenhouse-grown plants
and Zn-treated plantlets, respectively. These findings were confirmed by comparative profiling of 4 P. trichocarpa NAC
genes. This study provides useful information for reference gene selection in qRT-PCR analysis of gene expression in P.
trichocarpa. It is also helpful to elucidate the function of P. trichocarpa NAC genes.
Key words NAC, Populus trichocarpa, qRT-PCR, reference gene, Zn stress
Su XJ, Fan BG, Yuan LC, Cui XN, Lu SF (2013). Selection and validation of reference genes for quantitative RT-PCR
analysis of gene expression in Populus trichocarpa. Chin Bull Bot 48, 507–518.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: sflu@implad.ac.cn
(责任编辑: 孙冬花)