全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (6): 591~597 591
收稿 2013-03-22　　修定 2013-04-24
资助 国家“863”计划(2013AA102703和2011AA100201)、国家
自然科学基金(31170631)和“十二五”国家科技支撑项目
(2012BAD01B0302)。
* 为共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: xinminan@163.com; Tel: 010-62336248)。
毛果杨PtrAP1-2基因启动子的克隆及其瞬时表达分析
陈仲*, 王佳*, 安新民**
北京林业大学林木育种国家工程实验室, 林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 国家林业局树木花卉育种与生物工程重点
开放实验室, 北京100083
摘要: 为了研究杨树AP1同源基因的表达规律, 利用PCR技术从毛果杨基因组DNA中克隆出PtrAP1-2基因上游一段2 103 bp
序列。联合使用PLACE和PlantCARE在线软件分析序列, 结果表明该序列含有TATA-box和CAAT-box启动子基本元件, 另
外含有MRE、GT1-motif、AE-box、TCT-motif和Box 4多种光响应元件, 因此, PtrAP1-2可能与植物开花过程紧密相关。在
序列分析的基础上, 构建了PtrAP1-2基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体, 命名为PtrAP1-2pro::GUS。利用农杆
菌介导的瞬时表达法转化烟草, 结果表明PtrAP1-2启动子可以驱动GUS基因在烟草萼片和花瓣中特异表达, 在根、茎、
叶、雄蕊和心皮等其他组织部位里没有GUS表达活性, 这表明PtrAP1-2pro为花器官特异表达启动子。
关键词: 毛果杨; AP1; 启动子; GUS; 瞬时表达
Cloning and Transient Expression Analysis of PtrAP1-2 Promoter from Popu-
lus trichocarpa Torr. & Gray
CHEN Zhong*, WANG Jia*, AN Xin-Min**
National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental
Plants, Ministry of Education, Tree and Ornamental Plant Breeding and Biotechnology Laboratory of State Forestry Administra-
tion, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
Abstract: In order to study the expression and regulation of AP1 homologous gene in poplar, a 2 103 bp 5
flanking sequence of PtrAP1-2 gene was isolated by PCR from genomic DNA of Populus trichocarpa. Promot-
er sequence analyzed by PLACE and PlantCARE showed that the sequence contains TATA-box, CAAT-box and
many light-responsive elements, such as MRE, GT1-motif, AE-box, TCT-motif and Box 4. It was supposed that
PtrAP1-2 was closely related to flower development. Based on sequence analysis, the PtrAP1-2 promoter was
fused to the GUS reporter gene to characterize its expression pattern in tobacco. The results of Agrobacterium-
mediated transient expression showed that the promoter could direct transgene expression in sepals and petals
of tobacco, and no detection of GUS was found in roots, stems, leaves, stamens and carpels. It indicated that the
PtrAP1-2 promoter was a floral organ specific promoter.
Key words: Populus trichocarpa Torr. & Gray; AP1; promoter; GUS; transient expression
目前, 在植物基因工程中使用的大多数为组
成型启动子, 使外源目的基因在植物各组织部位
高水平表达, 但是, 在此过程中存在一些问题, 例
如不能有效地调控外源目的基因的表达, 过度消
耗细胞内的物质和能量(Gittins等2000); 大量异源
蛋白或代谢产物在植物体内积累, 打破了植物体
代谢平衡, 不利于其正常生长(Robinson 1996); 引
起基因沉默或共抑制现象(Kumpatla等1998; Mette
等2000); 此外还存在转基因植物安全性隐忧。因
此, 科学家们不断寻找更为有效的组织或器官特
异性启动子来代替组成型启动子, 以期更精确地
调控外源基因的表达。
组织或器官特异性启动子调控下的基因转录
过程一般只发生在某些特定的组织或者器官中。
组织或器官特异性表达启动子可以更加经济有效
的调控外源基因的表达, 特异地在特定需要的部
位发挥作用, 不仅可以提高外源基因的表达丰度,
而且将生物能耗降到最低, 以期不影响植株的正
植物生理学报592
常生长。另外, 深入研究组织或器官特异性启动
子有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础
理论, 而且具有广泛地应用价值。对组织或器官
特异性表达启动子进行深入地研究已成为当前植
物基因工程领域的热点。
在模式植物拟南芥的研究中, APETALA1 (AP1)
是开花关键基因, 它具有双重功能(Mandel等1992;
Parcy等1998; Wagner等1999)。一方面, 它是花分生
组织特征基因, 在花原基发育早期阶段发挥重要
作用, 受LEAFY (LFY)基因的直接调控, 它与植物
从营养生长向生殖生长过渡以及花的发端等生理
过程紧密相关, 是花序分生组织向花分生组织转
换的最重要标志。另一方面, AP1也是花器官形态
特征基因, 它属于植物花发育ABC模型中的A类基
因, 是萼片和花瓣等花器官正常发育的控制因子。
目前与植物开花相关的组织或器官特异性表
达启动子的研究主要集中在拟南芥(Arabidopsis
thaliana) (Nitz等2001)、烟草(Nicotiana tabacum)
(Borisjuk等1999)等草本模式植物或者马铃薯(So-
lanum tuberosum) (Trindade等2003)、玉米(Zea
mays) (Taniguchi等2000)、水稻(Oryza sativa) (Vas-
concelos等2003)、番茄(Solanum lycopersicum)
(Sandhu等2000)和油菜(Brassica napus) (Zhang等
2002)等农作物上, 而对于多年生木本植物, 尤其对
于杨树开花相关的组织或器官特异性表达启动子
的研究鲜有报道。
本文从毛果杨中克隆PtrAP1-2pro序列, 并对
其调控元件进行分析, 构建PtrAP1-2pro::GUS植物
表达载体, 采用瞬时表达的方法对该启动子的表
达特性进行研究。
材料与方法
1 实验材料
用于提取植物基因组DNA的毛果杨(Populus
trichocarpa Torr. & Gray)无性系和遗传转化受体植
物野生型烟草W38 (Nicotiana tabacum cv. W38)均
取自北京林业大学林木育种国家工程实验室。大
肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、根癌农杆菌
菌株(Agrobacterium tumefaciens) GV3101由本实验
室保存。pProtest质粒载体由美国俄勒冈州立大学
Steven H. Strauss教授馈赠。克隆载体pMD19-T购
自TaKaRa公司。
2 主要试剂
植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒以及普通质粒小提试剂盒购自北
京天根公司。LA Taq酶、核酸分子量标准(DNA
marker ladder)、T4-DNA连接酶、限制性内切酶
SacI和KpnI等购自TaKaRa公司。GUS (β-葡萄糖
苷酶, β-glucuronidase)组织化学染色底物5-溴-4-
氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)购自Sigma公
司。
3 毛果杨PtrAP1-2基因启动子的克隆及序列分析
按照北京天根公司植物基因组DNA提取试剂
盒的操作流程, 以毛果杨无性系叶片为材料提取
基因组DNA, 用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
根据毛果杨AP1-2基因(Phytozome v9.1 Potri.010-
G154100) 5侧翼序列设计引物, 上游引物5 AG-
AGCTCTGCAACACTATTAATCAATTTATC 3, 下
游引物5 AGGTACCCTCTCTCTCTCTCTC-
TAAATG 3, 在上下游引物的5端分别加入SacI和
KpnI酶切位点。20 µL PCR反应体系包括: 2 µL
(100 ng)毛果杨基因组DNA、2 μL 10×LA PCR缓
冲液、1.6 μL (2.5 mmol·L-1) dNTP、0.4 μL 10
pm·μL-1上游引物、0.4 μL 10 pm·μL-1下游引物、
0.2 μL LA Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)、13.4 μL
ddH2O。PCR反应循环条件为94 ℃预变性3 min;
94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 68 ℃延伸2.5 min,
共进行35个循环; 最后68 ℃延伸10 min。
PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后, 切
下目的条带, 使用凝胶回收试剂盒回收、纯化目
的片段。将纯化产物与pMD19-T载体连接, 再转
化DH5α感受态细胞, 接种到含氨苄(100 mg·L-1)的
LB平板上37 ℃培养14~16 h, 挑取单菌落进行PCR,
并对重组质粒进行限制性内切酶(SacI和KpnI)酶切
鉴定, 获得阳性克隆, 命名为PtrAP1-2pro-T。阳性
克隆委托上海生工生物工程技术服务有限公司进
行测序。
使用TSSP-TCM在线软件(http://mendel.cs.
rhul.ac.uk/mendel.php?topic=fgen) (Shahmuradov等
2005)对测序结果进行分析, 预测转录起始位点; 联
合运用PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)
(Higo等1998, 1999)及PlantCARE (http://bioinfor-
陈仲等: 毛果杨PtrAP1-2基因启动子的克隆及其瞬时表达分析 593
matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) (Rom-
bauts等1999; Lescot等2002)在线软件对其转录调
控元件进行分析。
4 植物表达载体构建
将pProtest质粒进行SacI和KpnI双酶切, 同时
将PtrAP1-2pro-T重组质粒进行SacI和KpnI双酶切,
回收纯化目的片段, 通过T4-DNA连接酶连接, 并
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α, 新的
重组质粒经氨苄霉素(ampicillin, 100 mg·L-1)和
PCR筛选后 , 进行双酶切验证 , 获得PtrAP1-
2p::GUS植物表达载体。
5 农杆菌介导的瞬时表达
通过液氮冻融法将PtrAP1-2p::GUS表达载体
转化到根癌农杆菌GV3101中。将烟草的根、茎、
叶及花分别剪下, 形成切口, 浸泡于OD600≈0.6的农
杆菌菌液中, 真空抽滤20 min。用无菌滤纸吸除材
料表面多余的菌液, 平铺于MS固体培养基上, 28
℃暗培养2 d。将共培养后的材料用含头孢霉素
(cefotaxime, 250 mg·L-1)的溶液洗涤数次待用。按
照Jefferson等(1987)的方法, 对材料进行GUS组织
化学染色分析, 将材料浸泡于GUS活性检测液, 37
℃过夜, 然后用70%乙醇脱色, 观察并拍照, 其中
GUS活性检测液包含0.1 mol·L-1 K4Fe(CN)6、0.1
mol·L-1 K3Fe(CN)6、50 mmol·L
-1磷酸钠缓冲液(pH
7.0)、10 mmol·L-1 Na2EDTA、0.001% (V/V) Triton
X-100、0.5 mg·mL-1 X-Gluc和20%甲醇。
实验结果
1 毛果杨PtrAP1-2基因启动子的克隆
以毛果杨基因组DNA为模板, 通过PCR扩增
得到大小约为2.1 kb的片段(图1-A), 与预期基本一
致, 将此片段回收, 与pMD19-T载体连接, 经菌落
PCR和双酶切(SacI和KpnI) (图1-B)验证后, 证明该
启动子片段已克隆到pMD19-T载体上。阳性克隆
测序结果表明, 该序列长度为2 103 bp。
2 毛果杨PtrAP1-2基因启动子的序列分析
使用TSSP-TCM在线软件(Shahmuradov等
2005)对PtrAP1-2基因启动子序列进行分析, 预测
其转录起始位点为G, 位于起始密码子上游662 bp
处。联合使用PLACE (Higo等1998, 1999)和Plant-
CARE (Rombauts等1999; Lescot等2002)在线软件
分析序列, 预测其含有的主要启动子基本转录元
件。结果(图2)显示 , TATA-box位于–50 bp处 ,
CAAT-box分别位于–160、–206、–235 bp处, ARE
位于–187 bp处, ELI-box3位于–414 bp处, MRE位
于–493 bp处, Skn-1_motif位于–509 bp处, GT1-mo-
tif位于–536 bp处, AE-box位于–568 bp处, 3-AF3
binding site位于–704 bp处, ATCT-motif位于–826
bp处, GCN4_motif位于–767和–916 bp处, TC-rich
repeats位于–1 364和–1 380 bp处, Box 4位于–519、
–580、–945、–1 168和–1 432 bp处。
3 PtrAP1-2pro::GUS植物表达载体的构建及工程
菌制备
为研究PtrAP1-2启动子的功能, 将pProtest质
粒与引入酶切位点的PtrAP1-2pro-T重组质粒分别
进行SacI和KpnI双酶切, 使用T4-DNA连接酶连接,
新的重组质粒经菌落PCR和双酶切验证(图3-A),
获得植物表达载体PtrAP1-2pro::GUS。CaMV35-
Spro::GUS植物表达载体作为阳性对照(图3-B), 采
用液氮冻融法, 将表达载体PtrAP1-2pro::GUS转入
根癌农杆菌GV3101感受态细胞中, 经菌落PCR鉴
定, 获得阳性克隆, 完成工程菌制备。
4 PtrAP1-2启动子在烟草中的瞬时表达
以烟草的根、茎、叶和花为受体材料, 采用
农杆菌介导的瞬时表达法对启动子表达特性进行
分析。结果(图4)表明PtrAP1-2启动子驱动的GUS
图1 毛果杨PtrAP1-2基因启动子克隆及酶切鉴定
Fig.1 Cloning of PtrAP1-2 promoter and its digestion
identification of recombinant plasmid
A: PtrAP1-2启动子PCR扩增; B: 重组质粒双酶切鉴定。M: 1
kb DNA ladder; 1: PCR产物; 2: 重组质粒的SacI和KpnI双酶切
产物。
植物生理学报594
图2 毛果杨PtrAP1-2基因启动子序列分析
Fig.2 Sequence analysis of PtrAP1-2 gene promoter from P. trichocarpa
TATA-box为启动子核心元件, 保证转录精确开始; CAAT-box可以控制转录的效率和频率; ARE为厌氧诱导反应过程中必不可少的顺
式作用元件; ELI-box3为激发子响应元件; MRE为光响应过程中MYB结合位点; Skn-1_motif和GCN4_motif为胚乳表达所需的相关顺式作
用元件; GT1-motif和AE-box为光响应元件; 3-AF3 binding site为保守的DNA模块阵列的一部分; ATCT-motif和Box 4为光响应过程中保守
DNA模块的一部分; TC-rich repeats为抗病和逆境胁迫响应作用元件。
陈仲等: 毛果杨PtrAP1-2基因启动子的克隆及其瞬时表达分析 595
图3 毛果杨PtrAP1-2pro::GUS植物表达载体构建
Fig.3 Construction of PtrAP1-2pro::GUS expression vector
A: PtrAP1-2pro::GUS植物表达载体PCR鉴定及双酶切鉴定; M: 1 kb DNA ladder; 1: PCR产物; 2: 植物表达载体SacI和KpnI双酶切产
物。B: PtrAP1-2pro::GUS植物表达载体结构示意图。
图4 烟草各组织器官的GUS组织化学染色
Fig.4 Histochemical GUS staining of the transiently transformed tissues from N. tobaccum
Pe: 花瓣; Se: 萼片。
基因仅在烟草萼片和花瓣中特异表达 , 在根、
茎、叶、雄蕊和心皮等其他组织部位里没有GUS
表达活性; 阴性对照(未转化材料)无GUS表达活
性; 阳性对照(CaMV35Spro::GUS)在根、茎、叶、
萼片、花瓣、雄蕊和心皮等各个组织部位均有
GUS表达活性。
植物生理学报596
讨　　论
杨树在我国城乡绿化、防护林建设、工业生
产等领域发挥着极其重要的作用, 但其较长的童
期在很大程度上限制了育种工作及相关研究的进
展。因此, 促进杨树早花, 提前生殖发育期, 缩短
育种周期, 一直是育种学家研究的重点(Bohlenius
等2006; Hsu等2006; Zhang等2010); 而且杨树飞絮
散粉又给城乡环境造成极大的污染。所以, 开展
对杨树开花关键基因及其启动子的的研究就显得
格外重要。另外, 杨树是多年生木本植物分子生
物学研究的模式树种, 分离并鉴定杨树开花关键
基因及其启动子, 对于阐明多年生木本植物开花
调控的分子机制具有重要的理论意义。近年来,
随着毛果杨全基因组序列测序的完成(Tuskan等
2006)及phytozome (Goodstein等2012)等数据库的
不断更新, 在杨树中已克隆出LFY (Rottmann等2000;
An等2011)、FT (Bohlenius等2006; Hsu等2006,
2011; Zhang等2010)和CO (Hsu等2012)等多个开花
关键基因, 并对它们的功能和特性进行了较深入
的研究, 杨树开花调控网络正在逐渐清晰。
植物开花是非常复杂和精细调控的过程, 近
些年对开花途径及关键基因的不断研究, 逐渐形
成了一个以AP1为中心的开花调控网络(Liu等
2007; Adrian等2009; Yant等2009; Irish 2010)。在
成花过程中, AP1具有双重功能, 它既是花分生组
织特征基因, 又是花器官特征基因。植物体外开
花信号整合于FT, 激活LFY和AP1的表达, LFY和
AP1又相互促进, 共同抑制TFL1的表达。AP1的高
表达抑制SVP、AGL24和SOC1的表达, 从而激活
SEP3, SEP3与LFY相互作用激活B、C类基因促进
花器官发育。A类基因AP1激活B类基因AP3和PI
的表达而决定花瓣和雄蕊, 反之, AP3与PI积累负
调控AP1; AP1通过与LUG和SEU的作用使C类基
因AG控制雄蕊, 雌蕊的形态; AG负调控A类基因
AP1的表达使其控制萼片, 花瓣的发育(Adrian等
2009; Liu等2009; Irish 2010; Wellmer和Riechmann
2010)。为研究杨树中AP1同源基因的表达特性,
从毛果杨基因组DNA中克隆PtrAP1-2基因的启动
子 , 并对其序列和功能进行了分析。研究发现
PtrAP1-2基因启动子的转录起始位点为G, 位于起
始密码子上游672 bp处, TATA-box位于–50 bp处,
最近的一个CAAT-box分别位于–160 bp。在启动
子区域中发现厌氧诱导反应过程中必不可少的顺
式作用元件ARE; 激发子响应元件ELI-box3; 胚乳
表达所需的相关顺式作用元件Skn-1_motif和
GCN4_motif; 抗病和逆境胁迫响应作用元件TC-
rich repeats; 另外还发现了MRE、GT1-motif、AE-
box、TCT-motif和Box 4等多种光响应元件, 这表
明PtrAP1-2与植物开花过程紧密相关。此外, 该启
动子下游还包含了一个5 UTR区, 有研究表明植物
基因5 UTR区对基因的表达调控起着重要作用
(Chung等2006; Kim等2006; Samadder等2008;
Karthikeyan等2009)。
为探究PtrAP1-2启动子的功能 , 本研究将
PtrAP1-2启动子与GUS报告基因融合, 转入烟草
根、茎、叶及花等组织部位中, 结果表明PtrAP1-2
启动子可以驱动GUS基因在烟草萼片和花瓣中特
异表达, 在根、茎、叶、雄蕊和心皮等其他组织
部位里没有G U S表达活性。进一步深入研究
PtrAP1-2启动子的功能和特性, 需要将构建的表达
载体转化到烟草及毛白杨中, 获得稳定表达的转
基因植株, 进行一系列GUS组织化学染色和GUS
活性检测分析, 相关实验目前正在进行中。
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