全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊员员冤院员怨怨猿 耀 圆园园园允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄员圆鄄员远摇 接受日期院圆园员源鄄园远鄄圆愿
基金项目院菏泽学院科研基金科技计划项目渊曾赠员园泽憎园员冤袁菏泽市科技发展计划项目渊圆园员圆晕园园圆冤
作者简介院许谦袁女袁副教授袁主要从事食药用菌开发应用尧微生物遗传育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院曾择苑员园猿园员岳 员远猿援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤员员鄄员怨怨猿鄄园愿
桑黄菌原生质体的高效分离探究
许摇 谦
渊菏泽学院生命科学系袁山东 菏泽摇 圆苑源园园园冤
摘摇 要院以桑黄菌丝体为材料袁研究不同酶解条件对桑黄菌原生质体产量的影响袁以期优化出高效分离桑
黄原生质体的理想条件遥 采用四因素三水平正交试验方法袁结果表明在使用 员郾 缘豫溶壁酶的酶液尧菌龄
为 员园 凿的菌丝体尧园郾 远 皂燥造窑蕴 原员甘露醇为酶解渗透压稳定剂时袁酶解时间为 猿 澡尧酶解温度为 猿园 益尧酶解
转速为 员园园 则窑皂蚤灶 原员的处理条件下袁 桑黄菌原生质体分离产量最高袁为 源远圆缘 万个窑皂蕴 原员遥 通过正交试验
筛选出了分离桑黄原生质体的最佳处理方式袁对于高效分离桑黄原生质体具有指导意义袁为选育桑黄各
种生物活性物质的高产菌株及相关遗传研究奠定基础遥
关键词院桑黄曰原生质体曰分离曰正交试验
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 员员援 员怨怨猿
摇 摇 桑黄菌渊孕澡藻造造蚤灶怎泽 蚤早灶蚤葬则蚤怎泽冤属于担子菌亚门袁层
菌纲袁多孔菌目袁多层孔菌科袁针层孔菌属咱员暂 遥 寄生于
杨尧桦尧栎尧柳尧松等树木之上袁桑黄子实体为多年生袁木
质袁侧生无柄袁初期象一块黄土袁经过一段时间的生长袁
样子像树桩上伸出的舌头咱圆暂 遥 研究表明袁桑黄含有多
糖尧三萜酸尧脂肪酸类尧芳香酸等成分咱猿暂 袁中医用以治
疗血崩尧血淋尧带下尧脾虚泄泻等咱源 原 缘暂 遥 近年来发现桑
黄菌具有抗菌尧抗癌尧抗氧化等药用价值袁 因而引起各
国学者的关注咱远暂 遥 韩国科学家 运蚤皂 等咱苑暂发现桑黄中
的蛋白多糖通过 责则燥贼藻蚤灶 噪蚤灶葬泽藻 悦渊蛋白激酶 悦冤和 孕栽运
渊蛋白酪氨酸激酶冤的活性来激活机体的 月 淋巴细胞遥
日本科学家 陨噪藻噪葬憎葬等咱愿暂发现桑黄具有很强的肿瘤抑
制率遥 张敏等咱怨暂就桑黄多糖的抗肿瘤作用进行研究袁
结果表明桑黄多糖对 匀圆圆 肝癌的抗性作用较为明显遥
阅燥灶早等咱员园暂研究发现桑黄胞外多糖具有抑制肿瘤和保
护肝脏的作用遥 韩国的 杂葬灶早皂燥燥 等咱员员暂就桑黄提取液
对流感病毒的抗性进行研究袁发现桑黄水提物可以有
效对抗流感 粤 和 月 病毒袁包括 匀员晕员袁匀猿晕圆 和 匀怨晕圆
等亚型病毒遥
桑黄菌生长周期长袁需 猿 耀源 年袁生理状态特殊且复
杂咱员圆暂 袁所以市场上野生的成熟子实体价格昂贵尧供不应
求遥 由于桑黄的人工栽培和液体发酵过程中存在菌株
性状不稳定尧不易控制产量和质量等问题袁因此选育性
状稳定尧优质高产的桑黄菌株成为一项重要的工作咱员猿暂 遥
目前常用的育种方式有杂交育种尧诱变育种尧推理
育种遥 原生质体能够更好的实现这些育种方式袁因其
去掉了壁的障碍而对外界刺激的敏感度显著提高袁所
以是诱变的良好材料袁还可用于原生质体融合尧基因转
移等研究遥 在原生质体融合方面袁美国的 月葬则则藻贼贼等咱员源暂
在 员怨愿怨 年曾做过外生菌根真菌的原生质体的形成的
研究遥 酝蚤灶怎贼澡 等咱员缘暂进行了内酰胺生产菌原生质体融
合研究并实现了种内袁种间和属间的重组遥 在澡葬灶
等咱员远暂研究发现黄孢原毛平革菌和白地霉之间原生质
体融合产生的融合子对玉米秸秆发酵时具备了黄孢原
毛平革菌分解木质素和白地霉生产单细胞蛋白的能
力遥 杂蚤灶早澡等咱员苑暂进行双孢蘑菇和大肥菇菌种间的原生
质体融合研究并实现了种间融合遥 苏集华等咱员愿暂通过
孕耘郧诱导小麦和山羊草属间原生质体融合试验袁建立
高效的异源融合体形成技术体系袁为小麦抗病育种提
供中间材料遥
在原生质体分离的研究方面袁王波等咱员怨暂曾做过金
针菇菌株单核原生质体交配型与菌丝生长分析的研
究遥 悦澡葬凿藻早葬灶蚤 等咱圆园暂做了石膏样小孢子菌原生质体再
生尧优化和生存能力的测定遥 再葬灶 等咱圆员暂做了食用菌大
球盖菇原生质体的制备与表征的研究袁认为对于再生
菌落的生长而言袁甘露醇作为稳定剂比用无机盐如硫
猿怨怨员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
酸镁做稳定剂更好遥 孕则蚤赠葬灶噪葬 等咱圆圆圆暂做了绿僵菌高效
的原生质体释放的影响因素的优化袁优化后原生质体
最大产量为 苑郾 猿 伊 员园愿个窑皂蕴 原员遥 宰葬灶早 等咱圆猿暂研究了原
生质体诱变对基因组改组的影响遥 赵小强等咱圆源暂利用
草地早熟禾橄榄球 圆 号形成的胚性愈伤组织分离原生
质体袁原生质体的产量达到 猿郾 圆猿 伊 员园远个窑早 原员遥李玉珠
等咱圆源暂通过用百脉根里奥无菌苗子叶及由下胚轴和子
叶形成的胚性愈伤组织为供体材料袁进行原生质体游
离袁发现最佳酶解时间分别为 远澡 和 员圆澡袁 原生质体产
量分别达 源郾 员猿 伊 员园远个窑早 原员和 猿郾 愿 伊 员园远 个窑早 原员遥 说明
不同植物原生质体分离所需酶解时间不尽相同袁应根
据试验材料进行摸索袁才能获得较高的原生质体产量袁
为原生质体的高效融合提供良好的材料遥 对桑黄菌原
生质体的分离方面袁祝子坪等咱远暂曾做过桑黄原生质体
的分离袁仅分析了单因素对原生质体产量的影响遥 本
研究的目的是通过正交试验对桑黄菌原生质体高效分
离条件进行研究袁选择出获得较高桑黄菌原生质体产
量的处理条件袁 为以后进行该菌的菌种选育和遗传研
究奠定基础遥
员摇 材料和方法
员援 员摇 材料
员援 员援 员摇 菌种摇 桑黄菌由菏泽学院生命科学系实验室
提供袁保存于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 渊 孕燥贼葬贼燥
阅藻曾贼则燥泽藻 粤早葬则袁孕阅粤培养基冤上遥
员援 员援 圆摇 培养基摇 活化培养基渊即 孕阅粤培养基冤渊员蕴冤院
马铃薯 圆园园 早去皮袁煮沸 圆园 皂蚤灶 后 源 层纱布过滤取其
汁液袁葡萄糖 圆园 早袁琼脂 员愿 早袁加水定容至 员 园园园 皂蕴袁
责匀值为 远袁员圆员 益 灭菌 圆园 皂蚤灶遥
液体基础培养基渊员 蕴冤院玉米粉 圆缘 早袁麸皮 猿缘 早袁煮
沸 圆园 皂蚤灶后 源 层纱布过滤取其汁液袁硫酸镁 员郾 缘 早袁磷
酸二氢钾 员 早袁加水定容至 员 园园园 皂蕴袁孕匀值为 远袁员圆员 益
灭菌 圆园 皂蚤灶遥
再生活化培养基渊员蕴冤院马铃薯 圆园园 早 去皮尧煮沸
圆园皂蚤灶后 源 层纱布过滤取其汁液袁葡萄糖 圆园 早袁琼脂 员愿
早袁甘露醇 员园怨郾 猿 早袁加水定容至 员 园园园 皂蕴袁责匀 值为 远袁
员圆员 益 灭菌 圆园 皂蚤灶遥
员援 圆摇 试验器材与药品
员援 圆援 员摇 试验器材摇 主要试验器材详见表 员遥
摇 摇 另外袁还有一些试验器材院培养皿袁 滤纸袁酒精灯袁
牙签袁打孔器袁镊子袁量筒袁
烧杯袁移液器袁耘孕管袁电磁炉袁锥形瓶袁园郾 圆圆 滋皂 微
孔滤膜袁针管袁漏斗遥
表 员摇 试验器材
栽葬遭造藻 员摇 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 藻择怎蚤责皂藻灶贼泽
器材
耘择怎蚤责皂藻灶贼泽
型号
酝燥凿藻造
生产厂家
酝葬灶怎枣葬糟贼怎则藻则泽
电热鼓风干燥箱 园员怨猿圆 北京市永光医疗仪器厂
高压蒸汽灭菌器 酝蕴杂鄄猿苑愿园 日本三洋电器株式会社
标准型双人净化工作台 杂宰鄄悦允鄄员悦 苏净集团苏州安泰空气
技术有限公司
全温振荡器 匀在匝鄄再 哈尔滨市东联电子技术
开发有限公司
药品保存箱 匀再悦鄄猿远园 上海肯强仪器有限公司
电子天平 云粤员园园源 瑞士梅特勒 原托利多仪器有限公司
恒温培养箱 孕再载鄄圆缘园月鄄在 上海博讯实业有限公司
全温摇瓶柜 匀再郧鄄粤 江苏太仓市实验设备厂
全温摇床 阅匀在鄄阅粤 江苏太仓市实验设备厂
离心机 栽阅蕴鄄缘鄄粤 上海安婷科学仪器厂
隔水式恒温培养箱 郧晕孕鄄怨圆苑园 上海精宏实验设备有限公司
电子分析天平 云粤员远园源 上海天平仪器厂
电冰箱 月悦阅鄄圆愿圆灾月孕 海信渊北京冤电器有限公司
员援 圆援 圆摇 试验药品摇 主要试验药品详见表 圆遥
表 圆摇 试验药品
栽葬遭造藻 圆摇 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 糟澡藻皂蚤糟葬造泽
药品名称
阅则怎早 灶葬皂藻泽
纯度
孕怎则蚤贼赠
生产厂家
酝葬灶怎枣葬糟贼怎则藻则泽
葡萄糖 粤砸 汕头市西陇化工厂有限公司
磷酸二氢钾 粤砸 西陇化工股份有限公司
硫酸镁 粤砸 天津市河东区红岩试剂厂
乙醇渊怨缘豫 冤 粤砸 安徽安特生物化学有限公司
琼脂粉 月砸 北京奥博兴生物技术有限责任公司
甘露醇 粤砸 天津市科密欧化学试剂有限公司
溶壁酶 跃 圆 园园园滋窑皂早 原员 上海蓝季科技发展有限公司
员援 猿摇 方法
员援 猿援 员摇 菌种活化摇 在标准型双人净化工作台袁将桑
黄菌用无菌打孔器渊直径 员 糟皂冤打取菌饼袁取 员 菌饼接
种于 孕阅粤培养基中央袁圆愿 益 培养 员缘 凿遥 桑黄的生长
情况见图 员遥
员援 猿援 圆摇 接种至液体基础培养基 摇 在标准型双人净
化工作台袁将桑黄菌用无菌打孔器渊直径 员 糟皂冤打取菌
饼袁取 圆 菌饼接种于锥形瓶中的液体基础培养基上袁
圆愿 益袁员远园 则窑皂蚤灶 原员恒温震荡培养 员园 凿渊图 圆冤遥
员援 猿援 猿摇 桑黄菌原生质体的获得摇 渊员冤酶液配制摇 称
取所需酶量袁溶解于 园郾 远 皂燥造窑蕴 原员渗透压稳定剂中袁经
源怨怨员
摇 员员 期 桑黄菌原生质体的高效分离探究
注院粤院第 缘 天曰 月院第 员园 天曰 悦院第 员缘 天遥
晕燥贼藻院 粤院 栽澡藻 缘贼澡 凿葬赠曰 月院 栽澡藻 员园贼澡 凿葬赠曰 悦院 栽澡藻 员缘贼澡 凿葬赠援
图 员摇 桑黄在固体培养基中的生长情况
云蚤早援 员摇 孕澡藻造造蚤灶怎泽 蚤早灶蚤葬则蚤怎泽爷 早则燥憎贼澡 蚤灶 泽燥造蚤凿 皂藻凿蚤怎皂
注院粤院第 员园 天渊近图冤曰月院第 员园 天渊远图冤遥
晕燥贼藻院 粤院 悦造燥泽藻 枣蚤早怎则藻 燥枣 贼澡藻 员园贼澡 凿葬赠曰 月院 阅蚤泽贼葬灶贼 枣蚤早怎则藻 燥枣 贼澡藻 员园贼澡 凿葬赠援
图 圆摇 桑黄在液体培养基里的生长情况
云蚤早援 圆摇 孕澡藻造造蚤灶怎泽 蚤早灶蚤葬则蚤怎泽爷 早则燥憎贼澡 蚤灶 造蚤择怎蚤凿 皂藻凿蚤怎皂
园郾 圆圆 滋皂微孔滤膜过滤除菌后备用遥
渊圆冤原生质体分离摇 将已培养好的菌丝用无菌水
洗涤干净后用灭菌滤纸吸去表面水分袁按每 猿园园 皂早 湿
菌丝加 造 皂蕴酶液量加入酶液袁在试验温度下以一定转
速水浴振荡酶解袁一段时间后取出袁酶液用无菌滤纸过
滤尧猿 愿园园 则窑皂蚤灶 原员离心袁制得原生质体菌悬液遥
渊猿冤血球计数板计算原生质体数目摇 在净化工作
台上袁取洁净的血球计数板一块袁在计数区上盖上一块
盖玻片遥 将原生质体悬液摇匀袁用滴管吸取少许袁从计
数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一
小滴袁让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区袁勿使
气泡产生袁并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液遥
静置片刻袁使细胞沉降到计数板上袁不再随液体漂移遥
将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳袁先在低
倍镜下找到计数区后袁再转换高倍镜观察并计数遥
渊源冤原生质体的产量 摇 在 圆缘 伊 员远 的血球计数板
上袁在显微镜下袁分别在左上袁左下袁右上袁右下袁中间的
五个中方格袁计数原生质体数目遥
原生质体产量的计算如下式计算院
原生质体的产量 辕 皂蕴 越 渊葬 辕 缘冤 伊 圆缘 伊 员园源 伊 遭
式中院葬院缘 个中方格中原生质体总数曰遭院原生质体
悬液稀释倍数遥
员援 猿援 源 摇 单因素试验 摇 分别考察酶解温度袁酶解时
间袁酶解转速对原生质体产量的影响袁以此为基础确定
正交试验的 猿 个水平值遥
员援 猿援 缘摇 正交试验 摇 以酶解时间袁酶解温度袁酶解转
速作为影响因素分别选取 猿 个水平进行正交试验袁以
桑黄原生质体产量作为指标袁确定原生质体分离的最
适条件遥 在确定单因素最佳条件的基础上袁确定正交
试验因素水平 蕴怨渊猿源冤渊表 猿冤遥员援 猿援 远摇 验证试验摇 在正交试验结果的基础上袁做相
应的验证试验遥 用正交试验所获得的原生质体产量最
高的配方 缘渊粤圆月圆悦猿冤与理论最优配方渊粤圆月圆悦员冤做验
证试验遥
缘怨怨员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
表 猿摇 试验因素水平
栽葬遭造藻 猿摇 栽澡藻 造藻增藻造泽 燥枣 贼澡藻 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 枣葬糟贼燥则泽
水平
蕴藻增藻造泽
因素 云葬糟贼燥则泽
粤酶解时间
耘灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽
贼蚤皂藻 辕 澡
月酶解温度
耘灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽
贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 辕 益
悦酶解转速
砸燥贼葬贼蚤燥灶葬造 泽责藻藻凿 燥枣
藻灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽 辕 渊 则窑皂蚤灶 原 员 冤
员 圆郾 缘 圆怨 员园园
圆 猿郾 园 猿园 员缘园
猿 猿郾 缘 猿员 圆园园
注院在本试验中袁因素 阅为空白袁没有具体水平设计遥
晕燥贼藻院 陨灶 贼澡蚤泽 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼袁 阅 憎葬泽 遭造葬灶噪袁 贼澡藻则藻 憎葬泽 灶燥 泽责藻糟蚤枣蚤糟 造藻增藻造 凿蚤泽蚤早灶藻凿
枣燥则 蚤贼援
员援 猿援 苑摇 数据分析摇 应用 酝蚤糟则燥泽燥枣贼 韵枣枣蚤糟藻 耘曾糟藻造 圆园园猿
和 杂孕杂杂 员远郾 园 软件对试验数据进行分析遥
圆摇 结果与分析
圆援 员摇 单因素试验
圆援 员援 员摇 酶解时间对桑黄菌原生质体分离的影响 摇
采取不同时间 圆郾 园尧圆郾 缘尧猿郾 园尧猿郾 缘尧源郾 园 澡袁比较不同酶解
时间对原生质体分离的影响袁在 员郾 缘豫溶壁酶的酶液尧
菌龄为 员园 凿尧甘露醇为酶解渗透压稳定剂尧酶解温度为
猿园 益袁结果表明袁时间在从 圆 澡 增至 猿 澡 的过程中袁原
生质体数目逐渐增多袁但 猿 澡 小时以后原生质体数目
开始减少袁可能是随着时间的延长袁酶与细胞的作用延
长袁使原生质体数目增多袁但时间继续增加袁虽细胞壁
仍有酶解袁但已经生成的原生质体会因为酶溶解了细
胞膜袁使原生质体数目减少遥 由图 猿 可见袁当酶解时间
为 猿郾 园 澡时原生质体产量最高袁因此选择 圆郾 缘尧猿郾 园尧猿郾 缘
澡进行正交试验遥
图 猿摇 酶解时间对桑黄原生质体产量的影响
云蚤早援 猿摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 藻灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽 贼蚤皂藻 燥灶 贼澡藻
泽藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 孕澡藻造造蚤灶怎泽 蚤早灶蚤葬则蚤怎泽 责则燥贼燥责造葬泽贼
圆援 员援 圆摇 酶解温度对桑黄菌原生质体分离的影响 摇
为了了解不同温度对桑黄菌原生质体分离的影响袁分
别采取不同温度 圆愿尧圆怨尧猿园尧猿员尧猿圆 益袁在 员郾 缘豫溶壁酶
的酶液尧菌龄为 员园 凿尧园郾 远 皂燥造窑蕴 甘露醇为酶解渗透压
稳定剂尧酶解时间为 猿郾 园 澡 条件下进行实验遥 结果表
明袁随着温度的升高袁员皂蕴 菌悬液中袁原生质体数目也
随之增多袁猿园 益时数目最多袁猿员 益以后原生质体数目
开始减少袁说明在本试验中溶壁酶的最适温度为 猿园
益袁猿园 益以后酶活性开始降低遥 由图 源 可见袁当温度
为 猿园 益时原生质体产量最高袁因此选择 圆怨尧猿园尧猿员 益
进行正交试验遥
图 源摇 酶解温度对桑黄菌原生质体分离的影响
云蚤早援 源摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 藻灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 燥灶 贼澡藻
泽藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 孕澡藻造造蚤灶怎泽 蚤早灶蚤葬则蚤怎泽 责则燥贼燥责造葬泽贼
图 缘摇 酶解转速对桑黄原生质体分离的影响
云蚤早援 缘摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 则燥贼葬贼蚤燥灶葬造 泽责藻藻凿 燥枣 藻灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽
燥灶 贼澡藻 泽藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 孕澡藻造造蚤灶怎泽 蚤早灶蚤葬则蚤怎泽 责则燥贼燥责造葬泽贼
圆援 员援 猿摇 酶解转速对桑黄菌原生质体分离的影响 摇
在恒温水浴摇床振荡箱里的酶解过程中袁适当的振荡
能够使细胞与溶壁酶充分接触袁有助于酶解袁但转速太
快又会使原生质体破裂袁因此本试验采用不同转速
远怨怨员
摇 员员 期 桑黄菌原生质体的高效分离探究
缘园尧员园园尧员缘园尧圆园园尧圆缘园 则窑皂蚤灶 原员袁在 员郾 缘豫溶壁酶的酶
液尧菌龄为 员园 凿尧甘露醇为酶解渗透压稳定剂尧酶解温
度为 猿园 益袁酶解时间为 猿郾 园 澡 的前提下袁探讨最适酶
解转速袁由图 圆尧图 猿 可见袁在 员缘园 则窑皂蚤灶 原员的时候袁原生
质体产率最高袁因为转速太低袁细胞不能和酶充分的接
触袁会使酶解时间延长袁转速太高袁会使原生质体因机
械力破坏遥 使原生质体产量降低遥 因此选择酶解转速
员园园尧员缘园尧圆园园 则窑皂蚤灶 原员为正交试验的 猿 个水平遥
表 源摇 正交试验结果分析
栽葬遭造藻 源摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 燥则贼澡燥早燥灶葬造 贼藻泽贼
处理
栽则藻葬贼皂藻灶贼泽
因素 云葬糟贼燥则泽
粤酶解时间
粤 耘灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽
贼蚤皂藻 辕 澡
月酶解温度
月 耘灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽
贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 辕 益
悦酶解转速
悦 砸燥贼葬贼蚤燥灶葬造 泽责藻藻凿 燥枣
藻灶扎赠皂燥造赠泽蚤泽 辕 渊 则鄄皂蚤灶 原 员 冤
阅空白
阅 月造葬灶噪
原生质体数目
孕则燥贼燥责造葬泽贼 灶怎皂遭藻则泽 辕
渊员园 贼澡燥怎泽葬灶凿泽窑皂蕴 原员 冤
员 员 员 员 员 源员缘园
圆 员 圆 圆 圆 猿怨愿愿
猿 员 猿 猿 猿 猿远愿缘
源 圆 员 圆 猿 猿怨缘园
缘 圆 圆 猿 员 源源员圆
远 圆 猿 员 圆 猿怨猿苑
苑 猿 员 猿 圆 猿猿缘园
愿 猿 圆 员 猿 猿愿怨缘
怨 猿 猿 圆 员 圆怨远苑
运员 员员愿圆猿郾 园园 员员源缘园郾 园园 员员怨愿圆郾 园园 员员缘圆怨郾 园园
运圆 员圆圆怨怨郾 园园 员圆圆怨缘郾 园园 员园怨园缘郾 园园 员员圆苑缘郾 园园
运猿 员园圆员圆郾 园园 员园缘愿怨郾 园园 员员源源苑郾 园园 员员缘猿园郾 园园
噪员 猿怨源员郾 园园 猿愿员远郾 远苑 猿怨怨源郾 园园 猿愿源猿郾 园园
噪圆 源园怨怨郾 远苑 源园怨愿郾 猿猿 猿远猿缘郾 园园 猿苑缘愿郾 猿猿
噪猿 猿源园源郾 园园 猿缘圆怨郾 远苑 猿愿员缘郾 远苑 猿愿源猿郾 猿猿
极差 远怨缘郾 远苑 缘远愿郾 远苑 员苑愿郾 猿猿 愿源郾 远苑
因素主次顺序 粤 月 悦
优水平 粤圆 月圆 悦员
优组合 粤圆 月圆悦员
圆援 圆摇 正交试验
圆援 圆援 员摇 正交试验结果摇 试验结果见表 源遥
摇 摇 由表 源 可知袁处理 缘 的原生质体产量最大袁其次为
员尧圆袁处理 怨 最差袁各因素对原生质体产量的影响显著
性依次为 粤渊酶解时间冤 跃 月渊酶解温度冤 跃 悦渊酶解转
速冤袁最优处理为 粤圆 月圆 悦员袁即酶解时间为 猿 澡尧酶解温
度为 猿园 益尧酶解转速为 员园园 则窑皂蚤灶 原员遥
圆援 圆援 圆摇 因素方差分析结果摇 由表 缘 可知袁正交试验
的 猿 个因素中袁粤渊酶解时间冤和 月渊酶解温度冤对原生
质体产量的影响都是显著的咱圆远暂 袁影响显著性依次为 粤
渊酶解时间冤 跃 月渊酶解温度冤袁其中 粤渊酶解时间冤对原
生质体产量的影响最大遥
圆郾 猿摇 验证试验结果
利用正交试验所获得的原生质体产量最高的处理
缘与理论最优配方做验证试验渊表 远尧表 苑冤遥 由表 远 可
知袁用这 圆 种处理进行原生质体制备所获得的原生质
体产量有差异袁最优处理的值大曰从表 苑 可知袁这 圆 种
处理对原生质体产量的影响呈极显著差异袁故为了获
得较高的原生质体产量袁就要选择最优处理 粤圆 月圆 悦员
渊酶解时间为 猿 澡袁酶解温度为 猿园 益袁酶解转速为 员园园 则
窑皂蚤灶 原员冤进行分离遥
猿摇 讨论
随着人们对桑黄药用成分研究的深入袁市场对桑
黄的需求骤升袁但由于桑黄生理活性的限制袁桑黄各种
药用成分的产量较低袁使得人们迫切需要利用现代的
育种策略选育出含有各种药用成分的高产菌遥 目前
苑怨怨员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
摇 摇 摇 摇 表 缘摇 不同因素对原生质体产量影响的方差分析
栽葬遭造藻 缘摇 灾葬则蚤葬灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 枣葬糟贼燥则 燥灶 责则燥贼燥责造葬泽贼 赠蚤藻造凿
差异源
杂燥怎则糟藻泽 燥枣 增葬则蚤葬贼蚤燥灶
平方和
杂杂
自由度
凿枣
均方和
酝杂
云值
云
显著性水平
杂蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻 造藻增藻造
粤 圆远缘愿猿圆郾 园苑 圆 员猿圆怨员远郾 园源 缘缘郾 源员 鄢
月 员远员远怨缘郾 远猿 圆 愿园愿源苑郾 愿员 猿猿郾 苑园 鄢
悦 远源源源员郾 源员 圆 猿圆圆圆园郾 苑园 员猿郾 源猿
阅渊藻冤 源苑怨苑郾 愿缘 圆 圆猿怨愿郾 怨猿
云员 原 园郾 园缘 渊圆袁圆冤 越 员怨
摇 摇 注院鄢 表示在 园郾 园缘 水平差异显著遥
摇 晕燥贼藻院 鄢 皂藻葬灶泽 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 葬贼 园郾 园缘 造藻增藻造援
表 远摇 验证试验结果
栽葬遭造藻 远摇 砸藻泽怎造贼泽 燥枣 增藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 贼藻泽贼
处理
栽则藻葬贼皂藻灶贼泽
原生质体数目
孕则燥贼燥责造葬泽贼 灶怎皂遭藻则泽 辕 渊员园 贼澡燥怎泽葬灶凿泽窑皂蕴 原员 冤
员 圆 猿
平均
粤增藻则葬早藻
正交处理 缘 源源圆缘郾 园 源圆猿苑郾 缘 源源远圆郾 缘 源猿苑缘郾 园
最优处理 源远愿苑郾 缘 源缘猿苑郾 缘 源远缘园郾 园 源远圆缘郾 园
表 苑摇 处理 缘 和最优处理对原生质体
产量的影响方差分析
栽葬遭造藻 苑摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 增葬则蚤葬灶糟藻 燥枣 贼则藻葬贼皂藻灶贼 缘 葬灶凿 贼澡藻
遭藻泽贼 贼则藻葬贼皂藻灶贼爷泽 蚤灶枣造怎藻灶糟藻 燥灶 责则燥贼燥责造葬泽贼 赠蚤藻造凿
差异源
杂燥怎则糟藻泽 燥枣
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显著性水平
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常用的育种策略有推理育种尧杂交育种尧诱变育种等遥
传统的杂交育种由于受亲和力的影响袁具有一定的局
限性曰杂交育种利用原生质体融合袁有利于不同种属间
微生物的杂交袁通过原生质体融合可提高各种药用成
分的产量袁因此被广泛应用于微生物遗传育种研究遥
食药用菌原生质体融合方面袁有研究曾将热灭活的凤
尾菇原生质体与金针菇原生质体融合袁选出双亲细胞
质和细胞核都融合的无锁状联合菌株袁经融合核分裂
技术处理后袁融合核分裂成为具有锁状联合的双核菌
株咱圆苑暂 遥 而原生质体的分离是实现原生质体融合的第
一步袁关于原生质体的高效分离袁曾有研究者就不同的
材料或同一材料的不同部位进行原生质体的分离研
究咱员怨 原 圆缘暂 遥 结果显示袁不同材料或同一材料不同部位分
离原生质体的最高产量都有所不同袁因此综合研究各
种影响因素对原生质体产量的影响袁最终获得桑黄原
生质体的高产袁是一个亟待解决的问题遥
本试验通过正交试验选择出分离桑黄原生质体的
最佳处理方式袁原生质体的产量渊产量级数为 员园苑 冤明
显高于祝子坪试验中原生质体的产量渊产量级数为
员园远冤 咱远暂 遥 具体分析原因可能有三点袁一是本试验中单
纯使用了浓度为 员郾 缘豫溶壁酶袁因为溶壁酶本身就是
一种复合酶袁单独使用就能够破坏桑黄细胞壁袁获得较
高的原生质体产量袁而祝子坪等咱远暂试验中使用了溶壁
酶和崩溃酶的混合酶系袁且混合酶系酶浓度达到
圆郾 缘豫 袁过高的酶浓度可能会破坏新形成的原生质体而
使原生质体的产量降低曰二是本试验对酶解液用无菌
滤纸进行过滤袁祝子坪试验中是用 郧猿 砂芯漏斗过滤袁
二者对原生质体的滤过性能可能有所差异曰三是本试
验过滤酶解液后用 猿 愿园园 则窑皂蚤灶 原员进行离心渊本试验最
初曾用猿 园园园 则窑皂蚤灶 原员进行离心袁没有获得理想的原生
质体沉淀袁于是用 猿 圆园园尧猿 源园园尧猿 远园园尧猿 愿园园尧源 园园园尧源
圆园园 则窑皂蚤灶 原员进行离心试验袁结果利用 猿 愿园园 则窑皂蚤灶 原员离
心可以得到最多的原生质体沉淀袁故实验中选择了这
个转速进行离心冤袁祝子坪等咱远暂试验中是用 猿 源园园 则窑
皂蚤灶 原员进行离心袁由原生质体产量判断转速稍高可能更
有利于原生质体的沉淀和获得遥 这与李江等咱圆愿暂进行
毛栓菌原生质体收集时发现 源 园园园 则窑皂蚤灶 原员是比较理
想的离心速度这一发现有相似之处袁原因可能是速度
太慢袁原生质体不能全部沉淀袁速度太快袁原生质体因
机械力而破碎袁导致原生质体获得量较小遥
愿怨怨员
摇 员员 期 桑黄菌原生质体的高效分离探究
源摇 结论
本试验在 员郾 缘豫溶壁酶的酶液尧菌龄为 员园 凿尧园郾 远
皂燥造窑蕴 原员甘露醇为酶解渗透压稳定剂的基础上袁研究酶
解温度尧酶解时间尧酶解转速对原生质体分离的影响袁
得到的最佳酶解条件为院酶解时间 猿 澡袁酶解温度 猿园
益袁酶解转速 员园园 则窑皂蚤灶 原员遥 桑黄菌原生质体分离最高
产量为 源远圆缘 万个窑皂蕴 原员遥
通过正交试验选出了分离桑黄原生质体的最佳处
理方式袁为解决育种难题找到了一种较适合的方法袁具
有广阔的应用前景遥 这将对选育桑黄各种生物活性物
质的高产菌株具有一定的指导意义遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 弓建国援 食用菌栽培技术咱酝暂援 北京院化学工业出版社袁圆园员员
咱 圆 暂 摇 宋力袁孙培龙袁郭彬彬袁魏红福袁陈灵杰援 桑黄的研究进展咱 允暂 援
中国食用菌袁圆园园园袁圆源渊猿冤院苑 原 员园
咱 猿 暂 摇 胡文彬袁马海乐袁周存山援 桑黄的研究与开发咱 允暂 援 食品研究与
发展袁圆园园远袁圆苑渊猿冤院愿园 原 愿员
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咱 远 暂 摇 祝子坪袁马海乐援 桑黄菌原生质体的分离与再生研究咱允暂 援 中国
中药杂志袁圆园园苑袁猿圆渊圆员冤院圆圆猿圆 原 圆圆猿缘
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咱 怨 暂 摇 秦俊哲袁刘华援 桑黄功效成分研究的新进展咱 允暂 援 食用菌袁圆园园愿袁
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咱员圆暂摇 戴玉成援 药用担子菌鲍氏层孔菌渊桑黄冤的新认识咱 允暂 援 中草药袁
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咱员猿暂摇 李瑞雪袁汪泰初袁贾鸿英袁胡飞援 液体发酵技术培养桑黄的工艺
条件优化试验咱允暂 援 中国蚕业袁圆园员园袁渊猿冤院圆园 原 圆员
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咱员怨暂摇 王波袁祁丽萍袁贾定洪袁鲜灵援 金针菇菌株单核原生质体交配型
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咱圆源暂摇 赵小强袁马晖玲袁周万海袁林栋援 草地早熟禾原生质体培养与融
合咱允暂 援 核农学报袁圆园员园袁圆源渊源冤院苑猿苑 原 苑源猿
咱圆缘暂摇 李玉珠袁陶茸袁王娟袁师尚礼袁马辉玲袁赵小强援 百脉根原生质体
的分离和酶解条件的研究咱 允暂 援 草地学报袁圆园员园袁 员愿渊远冤院苑怨愿 原
愿园源
咱圆远暂摇 庄楚强袁何春雄援 应用数理统计基础咱酝暂援 广州院华南理工大学
出版社袁圆园园怨
咱圆苑暂摇 谭周进袁杨海君袁林曙袁吴铁援 利用原生质体融合技术选育微生
物菌种咱允暂 援 核农学报袁圆园园缘袁员怨渊员冤院苑缘 原 苑怨
咱圆愿暂摇 李江袁袁月祥袁闫自英袁刘晓风袁廖银章袁李娜遥 毛栓菌原生质体
制备和再生及单核菌株产漆酶特性咱 允暂 援 菌物学报袁圆园员圆袁猿员
渊员冤院员园圆 原 员园怨
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