全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊源冤院园缘怨苑 耀 园远园源允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄园远鄄员苑摇 接受日期院圆园员猿鄄员园鄄员猿
基金项目院河北省自然科学基金渊悦圆园员园园园员源怨员冤
作者简介院李会宣袁女袁主要从事真核基因表达调控研究遥 耘鄄皂葬蚤造院造蚤澡怎蚤曾怎葬灶藻则岳 员圆远援 糟燥皂
通讯作者院李桂琴袁女袁教授袁主要从事植物分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院早择造蚤怨怨怨岳 员远猿援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园源鄄园缘怨苑鄄园愿
鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的
构建及转化
李会宣摇 许冬倩摇 齐摇 靖摇 闫洪波摇 李桂琴
渊河北经贸大学生物科学与工程学院袁河北 石家庄摇 园缘园园远员冤
摘摇 要院果胶酯酶渊责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻袁孕酝耘冤催化细胞壁中多聚半乳糖醛酸的脱甲酯化袁可以降解植物
细胞壁中的果胶多糖而与果实软化有关遥 本研究根据白梨果胶酯酶基因 孕糟孕酝耘源 的序列袁设计一对含
有特定酶切位点的特异性引物袁以鸭梨渊孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤 砸藻澡凿援 冤 糟阅晕粤 为模板通过 孕悦砸 扩增得到一
段 圆怨源遭责的 孕酝耘基因片段遥 将片段反向插入植物表达载体 责月陨员圆员 的 悦葬酝灾猿缘杂 启动子和 晕韵杂 终止子
之间袁经限制性酶切分析和测序分析证明成功构建 孕酝耘 基因的反义表达载体 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘遥 将
责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘电转化农杆菌 耘匀粤员园缘袁利用含 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 的农杆菌工程菌液侵染鸭梨外植体后
于抗性培养基中诱导愈伤组织袁获得的抗性愈伤组织经 孕悦砸初步检测含有反向 孕酝耘 基因片段袁荧光定
量 孕悦砸检测结果显示受侵染的愈伤组织中 孕酝耘基因表达量降低袁表明反向插入的 孕酝耘 基因片段起到
了抑制内源基因表达的效果遥
关键词院鸭梨曰果胶酯酶曰反义表达载体曰转化
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园源援 园缘怨苑
摇 摇 鸭梨渊孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤 砸藻澡凿援 糟灶援 再葬造蚤冤是典型的
中国梨品种袁果实中富含果胶物质咱员暂 遥 果胶分子是由
不同酯化度的半乳糖醛酸以 琢 原 员袁源 糖苷键聚合而成
的多糖链袁沉积于初生细胞壁和细胞间层袁与纤维素尧
木质素尧伸展蛋白等相互交联使细胞组织结构坚
硬咱圆 原 猿暂 遥 因此袁作为细胞壁的主要成分之一袁果胶物质
的催化降解影响着果实组织结构的稳固程度遥 果胶酯
酶渊责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻袁孕酝耘冤袁作为果胶物质的降解
酶袁能从细胞壁的果胶中去除多聚半乳糖醛酸的 悦远 酯
化基团袁催化尧水解果胶生产果胶酸和甲醇袁从而加速
细胞壁的降解咱源暂 遥 植物果实中含有 孕酝耘袁酶的水解作
用可以破坏果肉组织中果胶多聚糖醛酸链间的桥联作
用袁使细胞间联接断开尧聚合度下降袁导致果肉疏松袁果
实质地变软咱缘暂 遥
抑制植物中的 孕酝耘活性可以维护植物果实质构尧
防止软化咱远暂 遥 刘剑锋等咱苑暂也证实梨果实的 孕酝耘 活性
与果肉质地密切相关遥 魏建梅等发现果胶甲酯酶作用
于京白梨果实的后期软化袁通过抑制 孕酝耘 活性袁可以
减缓果胶的降解袁控制果实软化尧延长贮藏期咱愿暂 遥 宗
迪等还从质构尧酯化度尧水溶性果胶含量 猿 个方面研究
表明果胶甲酯酶能有效地保持苹果的质构咱怨暂 遥 因此袁
根据 孕酝耘的生理生化特性的研究袁可以通过控制 孕酝耘
的活性有效保持和改善果实的质构遥 近年来袁随着对
植物 孕酝耘基因结构尧表达特性及酶学性质方面研究的
深入袁为分子水平上改造植物 孕酝耘 基因尧控制基因的
表达及酶活性提供了理论依据咱员园 原 员员暂 遥 目前袁反义
砸晕粤技术可以有效抑制基因的表达水平袁在控制植物
的果实软化尧提高果蔬的耐贮藏性上取得了一定的进
展咱员圆 原 员猿暂 遥 本研究中袁通过 孕悦砸 扩增鸭梨 孕酝耘 基因片
段袁采用 责月陨员圆员 载体构建 孕酝耘基因的反向表达载体袁
并用农杆菌介导法转化鸭梨叶片外植体袁经组织培养
获得低 孕酝耘基因表达水平的转基因愈伤组织袁为进一
步利用反义 砸晕粤技术获得保持果实品质的耐贮鸭梨
新品种奠定基础遥
苑怨缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员摇 植物材料摇 试验材料为鸭梨袁定植于河北省农
林科学院果树研究所梨园遥
员郾 员郾 圆摇 质粒及菌株摇 责哉悦皂鄄栽灾藻糟贼燥则 购自上海生物工
程有限公司曰农杆菌 耘匀粤员园缘尧责月陨员圆员 菌株和 耘援 糟燥造蚤
栽燥责员园 感受态细胞由本实验室保存遥
员郾 员郾 猿摇 酶及试剂摇 限制性内切酶尧栽源 阅晕粤 连接酶购
自北京 孕则燥皂藻早葬 生物技术有限公司袁 阅晕粤 酝葬则噪藻则尧
阅则藻葬皂栽葬择栽酝 郧则藻藻灶 孕悦砸 酝葬泽贼藻则 酝蚤曾尧阅晕粤片段回收试剂
盒购自中国上海生物工程有限公司袁栽则蚤扎燥造 购自美国
陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司袁基因组提取试剂盒尧杂再月砸 郧则藻藻灶 孕悦砸
酝蚤曾早购自中国大连宝生物工程有限公司尧糟阅晕粤 合成
试剂盒尧质粒小量制备试剂盒为北京天根生化科技公
司产品遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 砸晕粤提取及 糟阅晕粤 合成 摇 采用 栽则蚤扎燥造 法提取
鸭梨的总 砸晕粤袁然后利用天根生化科技科技有限公司
的 栽陨粤晕杂糟则蚤责贼 糟阅晕粤第一链合成试剂盒合成 糟阅晕粤遥
员郾 圆郾 圆摇 孕酝耘 基因片段的扩增 摇 根据已发表的白梨
渊孕赠则怎泽 糟燥皂皂怎灶蚤泽 泽怎遭泽责援 糟葬怎糟葬泽蚤糟葬 冤 果胶酯酶基因
孕糟孕酝耘源 悦阅杂 序列 渊 粤月园远苑远愿源郾 员 冤袁在下游 员园怨愿 耀
员猿怨员遭责处的核心区利用 韵造蚤早燥远郾 园 软件设计 员 对 孕悦砸
扩 增 引 物 孕员 渊 缘忆 原 郧郧粤郧悦栽悦郧悦栽郧栽郧粤郧栽郧郧鄄
栽粤郧粤郧郧郧栽栽悦粤栽粤郧 原猿忆冤和 孕圆渊缘忆 原 郧粤栽悦栽粤郧粤郧郧悦鄄
悦郧栽郧粤悦郧悦栽郧栽栽悦栽栽悦栽郧粤栽栽 原 猿忆冤遥 划线部分为上尧
下游引物引入的 杂葬糟陨和 载遭葬陨 酶切位点遥 引物由上海
生工合成遥 孕悦砸 体系包括 圆滋蕴 糟阅晕粤 模板袁 阅则藻鄄
葬皂栽葬择栽酝 郧则藻藻灶 孕悦砸 酝葬泽贼藻则 酝蚤曾 渊圆 伊 冤圆缘滋蕴袁上尧下游引
物渊圆园滋皂燥造窑蕴 原员 冤各 员滋蕴袁加入 凿凿匀圆韵 补足 缘园滋蕴遥孕悦砸循环参数为院 怨源益预变性 缘皂蚤灶曰怨源益变性 猿园泽袁
缘愿益退火 猿园泽袁 苑圆益延长 源缘泽袁共 猿园 个循环曰最后 苑圆益
延伸 员园皂蚤灶遥
员郾 圆郾 猿摇 孕酝耘基因反义片段的克隆与测序摇 孕悦砸 扩增
产物在 员豫琼脂糖凝胶电泳中分离袁回收目的片段袁与
责哉悦皂鄄栽 灾藻糟贼燥则连接袁采用热激法转化到 耘援 糟燥造蚤 栽燥责员园
感受态细胞袁经蓝白斑筛选阳性菌落袁摇菌尧提取质粒遥
质粒经酶切鉴定正确的重组子命名为 责哉悦皂鄄粤泽孕酝耘袁
并送交上海生物工程有限公司测序遥
员郾 圆郾 源摇 反义 孕酝耘基因表达载体渊责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘冤的
构建及农杆菌转化摇 载遭葬 陨 辕 杂葬糟 陨双酶切 责哉悦皂鄄粤泽孕酝耘
重组质粒以及植物表达载体 责月陨员圆员袁回收重组载体中
目的基因的片段并和切除 郧怎泽 基因的 责月陨员圆员 线性载
体连接袁转化 耘援 糟燥造蚤 栽燥责员园 感受态细胞袁筛选阳性克隆
扩大培养后提取质粒袁用 载遭葬 陨 辕 杂葬糟 陨双酶切进一步鉴
定目的基因片段在载体中的插入方向遥 反向插入的重
组质粒命名为 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘员遥 用电击法转化农杆
菌 耘匀粤员园缘袁圆愿益倒置暗培养 圆凿袁同时作 责月陨员圆员 阴性
对 照遥 根 据 郧藻灶月葬灶噪 上 公 布 的 晕孕栽 陨陨 基 因
渊粤云源愿缘苑愿猿冤序列设计 员 对特异性引物袁 晕员 渊缘忆 原
粤栽郧粤栽栽郧粤粤悦粤粤郧粤栽郧郧粤栽栽郧悦粤 原 猿忆冤 和 晕圆 渊缘忆 原
栽悦粤郧粤粤郧粤粤悦栽悦郧栽悦粤粤郧粤粤郧郧悦 原 猿忆冤袁对抗性平板
生长的菌落利用 孕悦砸 筛选阳性克隆并在含氯霉素和
利福平的 再耘月 液体培养基中 圆愿益培养 圆源 澡袁提取质
粒遥
员郾 圆郾 缘摇 重组回复动员试验检测摇 将经 孕悦砸 鉴定为阳
性的农杆菌质粒袁采用热激法重新转化感受态 耘援 糟燥造蚤
栽燥责员园袁猿苑益培养 员远 耀 员愿 澡袁同时做不加质粒转化的阴
性对照遥 挑取单菌落袁质粒 载遭葬 陨 辕 杂葬糟 陨进行双酶切鉴
定遥
员郾 圆郾 远摇 鸭梨外植体转化及愈伤组织诱导尧检测摇 选择
苗龄 圆愿 凿的无菌鸭梨组培苗完全展开的叶片作为转
化的外植体袁置于含 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘尧韵阅远园园为 园郾 源 的
农杆菌工程菌液中浸渍 缘皂蚤灶袁接种于诱导选择培养基
渊酝杂 垣 杂猿园早窑蕴 原员 垣 远 原 月粤源郾 园皂早窑皂蕴 原 员 垣 陨粤粤园郾 猿皂早窑皂蕴 原 员 垣粤早葬则猿郾 园早窑蕴 原 员渊 责匀 缘郾 愿 冤 垣 运葬灶缘早窑蕴 原员冤避光培养 圆 凿袁再加
入 源园园滋早窑皂蕴 原员值的羧苄青霉素抑菌培养袁以后每隔一
周将羧苄青霉素浓度降低 缘园滋早窑皂蕴 原员袁直至长出抗性
愈伤组织遥 对照组选用含 责月陨员圆员 质粒的农杆菌液工
程菌液侵染外植体遥 按大连宝生物工程有限公司基因
组提取试剂盒提供的方法提取试验组和对照组抗性愈
伤组织 阅晕粤袁利用 孕悦砸检测愈伤组织是否含有 晕孕栽陨陨
基因和反向插入的 孕酝耘 基因渊引物根据反向插入的
孕酝耘 基因片段设计 孕猿院缘忆 原 郧悦悦郧栽郧粤悦郧悦栽郧栽栽悦栽鄄
栽悦栽郧粤栽 原 猿忆袁孕源院缘忆 原 郧悦栽郧栽郧粤郧栽郧郧栽粤郧粤郧郧郧栽栽悦粤
原猿忆冤遥
员郾 圆郾 苑摇 抗性愈伤组织 孕酝耘基因表达水平定量检测摇
分别取实验组和对照组愈伤组织袁利用 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司
的 栽则蚤扎燥造提取总 砸晕粤遥 根据反向 孕酝耘 保守序列设计
正向和反向特异引物遥 等量经 阅晕粤 酶处理的总 砸晕粤
与反向引物混合袁于 愿园益高温 缘皂蚤灶 以去除 砸晕粤 二级
机构袁然后 远园益保温 缘皂蚤灶 使引物与 砸晕粤 退火遥 待反
应物降至室温后袁加入 缘 伊 月怎枣枣藻则尧凿晕栽孕尧砸晕葬泽藻 抑制剂
和 酝鄄酝蕴灾反转录酶遥 反应程序为 员远益反应 猿园皂蚤灶袁然
后进行以 圆园益反应 猿园泽袁源圆益反应 猿园泽 和 缘园益反应 员泽
程序进行 远园 个循环袁最后 愿缘益反应 缘皂蚤灶 灭活反转录
愿怨缘
摇 源 期 鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的构建及转化
酶遥
利用荧光定量 孕悦砸 方法检测 孕酝耘 基因表达水
平遥 荧光染料选用 杂再月砸 郧则藻藻灶遥 反应体系中包含
圆郾 缘滋蕴 糟阅晕粤模板袁正向引物渊缘忆 原 郧悦悦郧栽郧粤悦郧悦栽郧栽鄄
栽悦栽栽悦栽郧粤栽 原 猿忆冤 和反向引物 渊 缘忆 原 郧粤郧粤栽栽郧鄄
悦粤粤粤粤栽粤粤郧栽郧郧悦粤悦粤郧 原 猿忆冤 各 缘滋蕴袁 员圆郾 缘滋蕴 圆 伊
杂再月砸 郧则藻藻灶 孕悦砸 酝蚤曾袁最后用灭菌双蒸水补足体系
圆缘滋蕴遥 反应程序 怨缘益变性 员园泽袁然后循环 源园 次 怨缘益
变性 员园泽和 远园益延伸 猿园泽遥 所有定量检测做三个生物
学重复袁植物 员愿杂则砸晕粤 作为内标基因袁阴性对照中不
含反转录模板遥 悦栽由仪器自动确定袁目标基因表达量
变化利用 圆 原吟吟悦栽 方法计算袁 吟吟悦栽 越 渊 悦栽贼葬则早藻贼鄄悦栽员愿杂则砸晕粤冤 泽葬皂责造藻载 原 渊悦栽贼葬则早藻贼鄄悦栽员愿杂则砸晕粤 冤 泽葬皂责造藻员袁杂葬皂鄄责造藻载代表试验组和对照组愈伤组织袁杂葬皂责造藻员 代表未
经转化的愈伤组织遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 鸭梨 孕酝耘基因片段的克隆
利 用 根 据 白 梨 果 胶 酯 酶 基 因 孕糟孕酝耘源
渊粤月园远苑远愿源郾 员冤序列设计的引物 孕员 和 孕圆袁以鸭梨果实
糟阅晕粤为模板袁 孕悦砸扩增 孕酝耘基因片段遥 电泳检测结
果渊图 员冤表明袁得到 圆怨源遭责 特异性强的尧单一的扩增
带遥 扩增片段大小与预期结果相符遥
注院员尧圆院孕酝耘基因 孕悦砸扩增产物曰酝院阅晕粤 分子量标准渊阅蕴圆园园园冤遥
晕燥贼藻院 员袁圆院孕悦砸 责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 孕酝耘曰 酝院阅晕粤 酝葬则噪藻则渊阅蕴圆园园园冤 援
图 员摇 鸭梨 孕酝耘基因片段克隆
云蚤早援 员摇 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 贼澡藻 孕酝耘 枣则葬早皂藻灶贼
圆郾 圆摇 重组质粒 责哉悦皂鄄粤泽孕酝耘的筛选鉴定
将扩增片段与 责哉悦皂鄄栽 增藻糟贼燥则 连接袁转化 耘援 糟燥造蚤
栽燥责员园 感受态细胞袁经蓝白斑筛选尧摇菌尧提取质粒后
进行 载遭葬陨 辕 杂葬糟陨 双酶切鉴定渊图 圆冤遥 结果表明重组质
粒上插入了大小为 圆怨源遭责的片段遥 上海生物工程公司
测序结果显示该片段与登录号为 粤月园远苑远愿源郾 员 的
孕糟孕酝耘源 序列相符渊图 猿冤袁没有移码或突变发生袁此重
组质粒命名为 责哉悦皂鄄栽鄄粤泽孕酝耘袁可用于构建反义表达
载体遥
注院酝员院阅晕粤分子量标准 渊阅蕴圆园园园冤曰员院责哉悦皂鄄栽质粒曰
圆院重组质粒 责哉悦皂鄄栽鄄粤泽孕酝耘曰 酝圆院员噪遭 阅晕粤 造葬凿凿藻则遥
晕燥贼藻院 酝员院阅晕粤 酝葬则噪藻则 渊阅蕴圆园园园冤曰员院责哉悦皂鄄栽曰
圆院责哉悦皂鄄栽鄄粤泽孕酝耘曰 酝圆院员噪遭 阅晕粤 造葬凿凿藻则援
图 圆摇 重组质粒 载遭葬陨 辕 杂葬糟陨酶切
云蚤早援 圆摇 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂 蚤凿 凿燥怎遭造藻凿蚤早藻泽贼藻凿
遭赠 杂葬糟陨 葬灶凿 载遭葬陨
圆郾 猿摇 鸭梨反义 孕遭孕酝耘基因植物表达载体的构建
植物表达载体 责月陨员圆员 中 郧怎泽基因两端有 载遭葬 陨和
杂葬糟 陨酶切位点袁用 载遭葬 陨和 杂葬糟 陨酶切 责月陨员圆员 载体后袁
其中的 郧怎泽 结构基因 渊 员郾 怨运遭 冤 将被切除袁 保留
悦葬酝增猿缘杂 启动子尧 晕燥泽 终止子等部分袁产生一个约
员员郾 员噪遭 的大片段遥 重组质粒 责哉悦皂鄄栽鄄粤泽孕酝耘 进行
载遭葬 陨 辕 杂葬糟 陨双酶切后袁由于扩增 孕酝耘 基因的引物 孕员
和 孕圆 设计有 杂葬糟 陨 和 载遭葬 陨 酶切位点袁酶切后产生一
个含有目的基因的尧长度为 圆怨源遭责片段袁与用同样酶切
的 责月陨员圆员 线性载体进行连接袁由于两者的酶切位点方
向相反袁因此目的片段将反向插入到载体 责月陨员圆员 中遥
反应完成后将连接产物转化 耘援 糟燥造蚤 栽燥责员园 感受态细
胞袁挑取卡那霉素渊运葬灶冤抗性单克隆袁培养后提取质粒
作为模板袁以 孕员 和 孕圆 为引物进行 孕悦砸 鉴定袁扩增产
物电泳结果同图 员袁并通过限制性内切酶 载遭葬 陨 辕 杂葬糟 陨
双酶切鉴定袁得到 员 条约 圆怨源遭责 的特异带遥 电泳图谱
和酶切结果表明反义 孕酝耘 基因片段已成功插入表达
载体 责月陨员圆员 中渊图 源冤遥 构建的反义表达载体命名为
责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘遥
圆郾 源摇 农杆菌的转化及鉴定
用电转化法将经酶切鉴定证实的鸭梨 孕酝耘 基因
反义表达载体 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 转化农杆菌 耘匀粤员园缘
怨怨缘
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院画框中碱基序列为扩增 孕酝耘基因片段的
引物袁其中划线部分为引入的酶切位点遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻泽 蚤灶 遭燥曾藻泽 皂藻葬灶 贼澡藻 孕悦砸 责则蚤皂藻则 燥枣 孕酝耘
早藻灶藻 枣则葬早皂藻灶贼袁蚤灶 憎澡蚤糟澡 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 泽蚤贼藻泽 憎藻则藻 怎灶凿藻则造蚤灶藻凿援
图 猿摇 克隆 孕酝耘基因片段与 孕糟孕酝耘源
悦阅杂渊粤月园远苑远愿源郾 员冤序列比较
云蚤早援 猿摇 粤造蚤早灶皂藻灶贼 燥枣 糟造燥灶藻凿 孕酝耘 早藻灶藻
枣则葬早皂藻灶贼 葬灶凿 孕糟孕酝耘源 悦阅杂 渊粤月园远苑远愿源郾 员冤
细胞袁 圆愿益培养 圆 凿后袁挑取单菌落分别用引物 孕员 和
孕圆 进行菌落 孕悦砸鉴定遥 孕悦砸 扩增产物和插入片段大
小一致的菌落渊图 缘冤袁证实 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 转入农杆
菌 耘匀粤员园缘遥 此农杆菌经扩大培养后提取质粒再次转
化大肠杆菌并从中提取质粒进行 载遭葬 陨 辕 杂葬糟 陨 双酶切
鉴定袁鉴定结果同图 缘遥 回复动员实验进一步确认
责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘质粒转入农杆菌袁可用于下一步的遗
传转化研究遥
圆郾 缘摇 鸭梨抗性愈伤组织的获得
用含 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 质粒的农杆菌侵染鸭梨叶
片外植体袁在愈伤组织诱导选择培养基上进行诱导暗
培养 圆园 凿袁提取鸭梨愈伤组织总 阅晕粤袁利用根据 晕孕栽
陨陨基因渊郧藻灶月葬灶噪院粤云源愿缘苑愿猿冤序列设计的特异性引物
晕员 和 晕圆 以及 孕酝耘 基因反向序列设计的引物 孕猿 和
孕源袁对鸭梨愈伤组织进行 孕悦砸鉴定遥 图 远 为鸭梨转基
因愈伤组织的 孕悦砸 鉴定结果袁显示有愈伤组织渊泳道
源 原 远尧员园 原 员圆冤分别得到 愿园园遭责和 圆怨源遭责特异性扩增条
带袁与 晕孕栽陨陨 基因和反向 孕酝耘 基因片段设计长度相
符袁证明外源基因的反向插入片段转入鸭梨愈伤组织
注院酝员院阅晕粤分子量标准 渊阅蕴圆园园园冤曰员尧圆院反义
表达载体 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘曰
酝圆院阅晕粤 分子量标准渊员噪遭 阅晕粤 造葬凿凿藻则冤遥
晕燥贼藻院 酝员院阅蕴圆园园园 阅晕粤 酝葬则噪藻则曰员尧圆院粤灶贼蚤泽藻灶泽藻
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘曰 酝圆院员噪遭 阅晕粤 造葬凿凿藻则援
图 源摇 反义表达载体 载遭葬陨 辕 杂葬糟陨双酶切鉴定
云蚤早援 源摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘
遭赠 载遭葬陨 辕 杂葬糟陨 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶
注院酝院阅晕粤分子量标准渊阅蕴圆园园园冤曰员院阴性对照渊责月陨员圆员 质粒冤曰圆院
责月陨员圆员 农杆菌菌落 猿院阳性对照渊耘援 糟燥造蚤 中提取的 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘
质粒冤曰源 原 远院责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘的农杆菌菌落遥
晕燥贼藻院 酝院阅蕴圆园园园 阅晕粤 酝葬则噪藻则曰员院灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 渊责月陨员圆员冤曰圆院悦燥造燥灶赠
孕悦砸 责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 责月陨员圆员曰猿院责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造渊 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 枣燥则皂 耘援
糟燥造蚤冤曰源 原 远院悦燥造燥灶赠 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼泽 燥枣 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘援
图 缘摇 菌落 孕悦砸鉴定含 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘的
农杆菌 耘匀粤员园缘 阳性克隆
云蚤早援 缘摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘
蚤灶 泽贼则葬蚤灶 耘匀粤员园缘 遭赠 糟燥造燥灶赠 孕悦砸
中袁而 猿 和 怨 泳道为转化 责月陨员圆员 质粒的愈伤组织袁只
扩增得到大小约 愿园园遭责 的条带袁为 晕孕栽陨陨 基因片段遥
责月陨员圆员 和 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘的转化效率见表 员遥
圆郾 远摇 抗性愈伤组织 孕酝耘基因表达水平分析
选择转化成功的鸭梨愈伤组织提取总 砸晕粤袁利用
砸栽鄄择孕悦砸方法检测 孕酝耘基因的表达水平变化遥 试验
园园远
摇 源 期 鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的构建及转化
摇 摇 摇 摇 表 员摇 遗传转化效率统计表
栽葬遭造藻 员摇 栽澡藻 贼葬遭造藻 燥枣 贼澡藻 藻枣枣蚤糟藻灶糟赠 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
载体 外植体总数员 出愈数渊率豫冤圆 孕悦砸检出外源基因愈伤组织数渊率豫冤猿
孕酝耘基因表达与对照差异显著
愈伤组织数渊率豫冤
责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 员苑圆怨葬 员怨员渊员员郾 园缘冤葬 员猿渊园郾 苑缘冤葬 员园渊园郾 缘愿冤葬
责月陨员圆员 员苑员园葬 员愿圆渊员园郾 远源冤葬 员圆渊园郾 苑园冤葬 园渊园郾 园园冤遭
摇 摇 注院表中不同字母表示同一栏中数据存在显著差异渊孕 约 园郾 园缘冤遥
员院 百分率以接种外植体总数为分母曰
圆院 出愈率为外植体经侵染过程后袁接种到选择培养基渊含 运葬灶缘园皂早窑蕴 原员 袁悦葬则遭圆缘园皂早窑蕴 原员 冤上愈伤组织发生率曰
猿院 孕悦砸检出外源基因分别为 晕孕栽陨陨或者反向 孕酝耘渊分别对应 责月陨员圆员 和 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘侵染外植体冤遥
晕燥贼藻院阅蚤枣枣藻则藻灶贼 造藻贼贼藻则泽 憎蚤贼澡蚤灶 葬 糟燥造怎皂灶 皂藻葬灶 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 渊孕 约 园郾 园缘冤
员院 阅蚤枣枣藻则藻灶贼 造藻贼贼藻则泽 憎蚤贼澡蚤灶 葬 糟燥造怎皂灶 皂藻葬灶 泽蚤早灶蚤枣枣蚤糟葬灶贼造赠 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 渊孕 约 园郾 园缘冤 援 栽澡藻 灶怎皂遭藻则 燥枣 贼燥贼葬造 藻曾责造葬灶贼泽 蚤泽 贼葬噪藻灶 葬泽 贼澡藻 凿藻灶燥皂蚤灶葬贼燥则 燥枣 贼澡藻 责藻则糟藻灶贼鄄
葬早藻曰
圆院 栽澡藻 糟葬造造怎泽 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 责藻则糟藻灶贼葬早藻 憎葬泽 糟葬造糟怎造葬贼藻凿 葬枣贼藻则 贼澡藻 藻曾责造葬灶贼泽 憎藻则藻 贼则葬灶泽枣藻则则藻凿 贼燥 泽藻造藻糟贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 缘园皂早窑蕴 原员 运葬灶 葬灶凿 圆缘园皂早窑蕴 原员
悦葬则遭曰
猿院 栽澡藻 藻曾燥早藻灶燥怎泽 早藻灶藻泽 则藻枣藻则 贼燥 晕孕栽陨陨 葬灶凿 则藻增藻则泽藻 孕酝耘渊 枣燥则 藻曾责造葬灶贼泽 蚤灶枣藻糟贼藻凿 遭赠 责月陨员圆员 葬灶凿 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻冤 援
注院酝院阅晕粤分子量标准渊阅蕴圆园园园冤曰员尧苑院阴性对照渊未转化鸭梨愈
伤组织冤曰圆尧愿院阳性对照渊责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘质粒冤曰猿尧怨院转化 责月陨员圆员
鸭梨愈伤组织曰源 原 远尧员园 原 员圆院鸭梨抗性愈伤组织遥
晕燥贼藻院 酝院阅蕴圆园园园 阅晕粤 酝葬则噪藻则曰员尧苑院晕藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造渊哉灶贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿
再葬造蚤 糟葬造造怎泽冤曰 圆尧愿院责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造渊 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 责造葬泽皂蚤凿冤曰猿尧怨院
再葬造蚤 糟葬造造怎泽 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 责月陨员圆员曰源 原 远尧员园 原 员圆院再葬造蚤 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 糟葬造造怎泽曰
酝院酝葬则噪藻则援
图 远摇 鸭梨抗性愈伤组织 孕悦砸鉴定
云蚤早援 远摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 再葬造蚤 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 糟葬造造怎泽 遭赠 孕悦砸
结果表明袁转化含有反向 孕酝耘基因的 猿 组愈伤组织中
孕酝耘基因表达量分别为未转化对照样品的 远圆郾 圆豫 尧
苑园郾 愿豫和 苑员郾 员豫 袁均显著低于对照袁而转化 责月陨员圆员 空
载体的 猿 组愈伤组织 孕酝耘 基因表达量分别为对照的
员员圆郾 愿豫 尧员园苑郾 圆豫和 怨愿郾 苑豫 袁其中两组高于对照袁只有
一组略低于对照袁但差异不显著渊图 苑冤袁这说明转入反
向 孕酝耘基因的愈伤组织中内源 孕酝耘基因表达受到一
定程度的抑制袁并且这种抑制作用来自反义的 孕酝耘 基
因而不是由于 责月陨员圆员 载体自身的作用遥 为了进一步
研究反义基因表达的稳定性袁试验分析了长出后连续
培养 圆园尧猿园 和 源园 凿 的 猿 组抗性愈伤组织袁结果显示袁
与未经转化的对照组相比袁第 员尧圆 两组愈伤组织在不
注院员 原 猿院分别代表不同的抗性愈伤组织袁孕酝耘基因在未经转化的
愈伤组织渊对照冤中表达量设定为 员袁相对表达量是指相对于对照
的表达量遥
晕燥贼藻院 员 原 猿院 阅蚤枣枣藻则藻灶贼 再葬造蚤 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 糟葬造造怎泽援 栽澡藻 孕酝耘 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增鄄
藻造 蚤灶 怎灶贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 渊糟燥灶贼则燥造冤再葬造蚤 糟葬造造怎泽 蚤泽 凿藻枣蚤灶藻凿 葬泽 员袁 贼澡藻 则藻造葬贼蚤增藻
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
造藻增藻造 燥枣 孕酝耘 早藻灶藻 蚤泽 灶燥则皂葬造蚤扎藻凿 贼燥 糟燥灶贼则燥造援
图 苑摇 抗性愈伤组织 孕酝耘基因相对表达水平
云蚤早援 苑摇 栽澡藻 则藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 燥枣 孕酝耘 早藻灶藻 蚤灶
凿蚤枣枣藻则藻灶贼 再葬造蚤 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 糟葬造造怎泽
同的时段内 孕酝耘基本稳定在较低的表达量袁并且第 员
组还有进一步降低的趋势渊图 愿冤袁第 猿 组在培养 圆园 凿
和 猿园 凿时袁孕酝耘 基因的表达量也较低遥 以上结果表
明袁反向 孕酝耘基因的转入在一定程度上抑制了愈伤组
织中 孕酝耘基因的表达遥
员园远
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院员 原 猿院分别代表不同的抗性愈伤组织袁相对表达量指 孕酝耘 基因
相对于未经转化的对照袁各个时期对照中 孕酝耘表达量设定为 员遥
晕燥贼藻院 员 原 猿院 阅蚤枣枣藻则藻灶贼 再葬造蚤 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 糟葬造造怎泽援 栽澡藻 则藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
造藻增藻造 燥枣 孕酝耘 早藻灶藻 蚤泽 灶燥则皂葬造蚤扎藻凿 贼燥 怎灶贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 渊糟燥灶贼则燥造冤 再葬造蚤 糟葬造造怎泽
蚤灶 泽葬皂藻 贼蚤皂藻泽援 栽澡藻 孕酝耘 早藻灶藻 则藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造 燥枣 糟燥灶贼则燥造 蚤泽 凿藻鄄
枣蚤灶藻凿 葬泽 员援
图 愿摇 孕酝耘基因相对表达量随抗性愈伤
组织培养时间变化情况
云蚤早援 愿摇 栽澡藻 孕酝耘 早藻灶藻 则藻造葬贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
造藻增藻造泽 燥枣 再葬造蚤 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 糟葬造造怎泽 蚤灶 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼蚤皂藻泽
猿摇 讨论
在高等植物中 孕酝耘多数为多基因家族袁编码不同
的异构体袁以同工酶形式存在于植物体的许多组织
中咱员源暂 遥 虽然未见鸭梨 孕酝耘 基因家族的报道袁但在与
鸭梨同属的白梨中发现了 源 个 孕酝耘 基因袁孕糟孕酝耘员
渊 粤月园远苑远愿员郾 员 冤尧 孕糟孕酝耘圆 渊 粤月园远苑远愿圆郾 员 冤 和 孕糟孕酝耘猿
渊粤月园远苑远愿猿郾 员冤 与果实的质构有关遥 其中 孕糟孕酝耘源
渊粤月园远苑远愿源郾 员冤袁悦阅杂区长为 员缘猿园遭责袁与果实软化密切
相关咱员缘暂 遥 孕糟孕酝耘源 全长 缘园怨葬葬袁核心区域中具有多个
平行的 茁 原螺旋袁在结构上与其它植物的 孕酝耘 核心区
域表现出极高的相似性咱员远暂 遥 因此袁本文应用 孕糟孕酝耘源
基因中 员园怨愿 耀 员猿怨员遭责 位的序列袁编码酶核心区域 源园愿
耀 源员缘葬葬和 源员怨 耀 源圆猿葬葬 的 茁 原螺旋袁构建反义表达载
体 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘袁在转基因愈伤组织中发挥了良好
的作用遥 由此推测袁鸭梨和白梨的 孕酝耘基因可能具有
一定的同源性袁至于在鸭梨中是否也存在 孕酝耘基因家
族袁有待于进一步研究和探讨遥 此外袁利用同源性极高
的序列构建的 孕酝耘 基因反义表达载体能否应用到鸭
梨以外的其它梨品种的转基因中抑制 孕酝耘的活性袁也
需要进行试验和研究遥
随着植物基因组及基因结构和功能研究的广泛和
深入袁使得反义 砸晕粤技术可以通过特定基因的沉默改
善果蔬的品质和增强果蔬的贮藏性咱员苑暂 遥 其中最为成
功的就是延缓成熟和软化的反义 砸晕粤 转基因番茄袁
韵藻造造藻则尧 罗云波尧栽蚤藻皂葬灶 分别通过反义表达载体的转
化袁获得了转 粤悦悦 氧化酶渊员鄄葬皂蚤灶燥糟赠糟造燥责则燥责葬灶藻 原 员 原
糟葬则遭燥曾赠造葬贼藻 燥曾蚤凿葬泽藻袁 粤悦韵冤尧粤悦悦 合成酶渊员 原 葬皂蚤灶燥糟赠鄄
糟造燥责则燥责葬灶藻 原 员 原 糟葬则遭燥曾赠造葬贼藻 泽赠灶贼澡葬泽藻袁粤悦杂冤及 孕酝耘 基
因的番茄袁使果实的成熟延迟袁储藏期延长咱员愿 原 圆园暂 遥 目
前袁反义 砸晕粤 技术逐渐应用袁在梨的果实品质上取得
了初步的研究进展遥 悦葬燥 等咱圆员暂将 粤悦韵 基因反义转化
西洋梨 蕴葬 云则葬灶糟藻袁获得的转基因苗中乙烯释放量明显
降低袁有助于培育出增强果实贮藏性的西洋梨遥 河北
经贸大学现代农业物理工程课题组利用反义 孕孕韵 基
因表达载体转化鸭梨袁获得了低 孕孕韵 表达水平的鸭梨
转基因幼苗袁期望得到有助于减缓果实褐变的新品
种咱圆圆暂 遥 以上反义 砸晕粤技术在转基因梨的幼苗中都表
现出了良好的作用袁但基因的表达会受空间尧时间以及
组织特异性的影响袁因此袁反义基因能否在转基因植株
的果实中稳定表达袁以及本研究中获得的转入反义
孕酝耘基因的第 猿 组愈伤组织在培养 源园 凿时 孕酝耘基因
的表达量剧烈增加袁并高出未经转化的愈伤组织渊图
愿冤袁其中的机制和原因都有待于继续研究和阐明遥
本研究目标果胶甲酯酶的功能作用主要体现在果
实中袁因此袁应检测果实中转基因表达情况遥 但由于鸭
梨属于木本果树袁营养生长期较长袁即获得可以结果的
转基因植株周期很长袁短时间内难以实现袁因此袁本研
究仅检测了愈伤组织中该基因的表达情况遥 由于愈伤
组织可进一步诱导再生芽和根袁进而生成完整植株袁并
且已有报道证实苹果咱圆猿暂 尧番茄咱圆源暂 尧草莓咱员猿暂 尧甘蔗咱圆缘暂等
报道证实已通过农杆菌介导的反义载体转化尧诱导愈
伤组织进而培育出植株袁可以改变果实的品质遥 目前
本研究中的 孕酝耘基因的反义表达载体转化鸭梨只获
得了愈伤组织袁后续的研究将侧重于再生的转基因植
株中袁尤其是果实中袁孕酝耘 基因的表达及 孕酝耘 活性分
析袁为培育出耐储藏并保持果品质地的新型鸭梨奠定
基础遥
源摇 结论
本研究根据白梨 孕糟孕酝耘源 基因序列设计引物袁以
鸭梨 糟阅晕粤 为模板通过 孕悦砸 扩增到一段 圆怨源遭责 的
孕酝耘基因片段袁并与 责月陨员圆员 连接成功构建了鸭梨
孕酝耘 基因的反义表达载体 责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘遥 将
责月陨员圆员 原 粤泽孕酝耘 转化农杆菌 耘匀粤员园缘袁利用工程菌液
侵染鸭梨外植体诱导出含有反向 孕酝耘 基因片段的抗
性愈伤组织遥 反向 孕酝耘 基因片段的导入抑制了鸭梨
抗性愈伤组织内源 孕酝耘基因的表达遥
圆园远
摇 源 期 鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的构建及转化
参考文献院
咱 员 暂 摇 赵纪伟袁 彭建营袁 许建锋袁 张玉星援 不同 耶安梨爷株系后熟前后
果实营养成分变化咱 允暂 援 中国农学通报袁 圆园员员袁 圆苑渊员怨冤院 圆员园 原
圆员猿
咱 圆 暂 摇 杂藻则早藻 孕袁 酝葬扎藻葬怎 运袁 匀藻则增佴贼 悦援 栽澡藻 贼澡则藻藻鄄凿蚤皂藻灶泽蚤燥灶葬造 泽贼则怎糟贼怎则藻泽 燥枣
贼澡藻 责藻糟贼蚤糟 责燥造赠泽葬糟糟澡葬则蚤凿藻泽咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠 葬灶凿 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁
圆园园园袁 猿愿渊员冤院 猿苑 原 缘缘
咱 猿 暂 摇 孕佴则藻扎 杂袁 砸燥凿则侏早怎藻扎 悦 酝袁 阅燥糟燥 栽援 粤 糟燥皂责造藻曾 责造葬灶贼 糟藻造造 憎葬造造 责燥造赠鄄
泽葬糟糟澡葬则蚤凿藻院 则澡葬皂灶燥早葬造葬糟贼怎则燥灶葬灶 陨陨援 粤 泽贼则怎糟贼怎则藻 蚤灶 择怎藻泽贼 燥枣 葬 枣怎灶糟贼蚤燥灶
咱允暂 援 月蚤燥糟澡蚤皂蚤藻袁 圆园园猿袁 愿缘渊员冤院 员园怨 原 员圆员
咱 源 暂 摇 匀怎蚤泽皂葬灶 酝袁 杂糟澡燥造泽 匀袁灾燥则葬早藻灶 粤援 耘灶扎赠皂葬贼蚤糟 凿藻早则葬凿葬贼蚤燥灶 燥枣 糟藻造造
憎葬造造 责燥造赠泽葬糟糟澡葬则蚤凿藻泽 枣则燥皂 泽燥赠遭藻葬灶 皂藻葬造咱允暂 援 悦葬则遭燥澡赠凿则葬贼藻 孕燥造赠皂藻则泽袁
员怨怨怨袁 猿愿渊源冤院 圆怨怨 原 猿园苑
咱 缘 暂 摇 运葬怎则 杂袁 阅澡蚤造造燥灶 宰袁 郧葬则早 粤袁 酝葬澡葬躁葬灶 月援 酝葬蚤灶贼藻灶葬灶糟藻 燥枣 枣则怎蚤贼 枣蚤则皂鄄
灶藻泽泽 葬灶凿 责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造 藻泽贼藻则葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责藻葬则 糟怎造贼蚤增葬则泽
贼澡则燥怎早澡 责燥泽贼鄄澡葬则增藻泽贼 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 凿蚤责澡藻灶赠造葬皂蚤灶藻咱 允暂 援 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼
葬灶凿 耘糟燥造燥早赠袁 圆园员员袁 圆怨渊圆冤院 缘源远 原 缘源怨
咱 远 暂 摇 运葬怎则 运袁 阅澡蚤造造燥灶 宰袁 酝葬澡葬躁葬灶 月援 悦澡葬灶早藻泽 蚤灶 责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造 藻泽贼藻则葬泽藻
葬糟贼蚤增蚤贼赠 憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责葬糟噪葬早蚤灶早 皂葬贼藻则蚤葬造泽 葬灶凿 泽贼葬早藻泽 燥枣 枣则怎蚤贼 澡葬则增藻泽鄄
贼蚤灶早 凿怎则蚤灶早 糟燥造凿 泽贼燥则葬早藻 燥枣 责藻葬则 糟增援 孕怎灶躁葬遭 遭藻葬怎贼赠咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣
云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园员圆院 员 原 缘
咱 苑 暂摇 刘剑锋袁 程云清袁 彭抒昂援 梨采后细胞壁成分及果胶酶活性与
果肉质地的关系咱允暂 援 园艺学报袁 圆园园源袁 猿员渊缘冤院 缘苑怨 原 缘愿猿
咱 愿 暂 摇 魏建梅袁 马锋旺袁 关军锋袁 袁军伟袁 朱向秋援 京白梨果实后熟软
化过程中细胞壁代谢及其调控咱 允暂 援 中国农业科学袁 圆园园怨袁 源圆
渊愿冤院 圆怨愿苑 原 圆怨怨远
咱 怨 暂摇 宗迪袁 顾慧莹袁 王庆援 果胶甲酯酶对保持苹果质构作用的研究
咱允暂 援 食品工业科技袁 圆园园缘袁 圆远渊猿冤院 苑远 原 苑怨
咱员园暂摇 允蚤葬灶早 载 孕袁 悦澡藻灶 孕袁 再蚤灶 酝 蕴袁再葬灶早 匝援 悦燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶袁 责怎则鄄
蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽葬贼蚤燥灶 燥枣 责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻 枣则燥皂 粤泽责藻则早蚤造造怎泽
灶蚤早藻则 蚤灶 孕蚤糟澡蚤葬 责葬泽贼燥则蚤泽 枣燥则 责燥贼藻灶贼蚤葬造 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻 枣则怎蚤贼 躁怎蚤糟藻 蚤灶鄄
凿怎泽贼则赠咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 贼澡藻 杂糟蚤藻灶糟藻 燥枣 云燥燥凿 葬灶凿 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 圆园员猿袁
怨猿渊圆冤院 猿苑缘 原 猿愿员
咱员员暂摇 悦葬觭觔燥 杂袁 蕴藻蚤贼藻 栽袁 月怎凿扎蚤灶泽噪蚤 陨袁 阅燥泽 杂 栽袁 杂糟澡燥造扎 酝袁 悦葬则责藻灶贼蚤藻则蚤 孕
灾袁 阅燥皂蚤灶早怎藻泽 阅袁 灾蚤藻蚤则葬 蕴袁 孕藻则藻蚤则葬 蕴援 郧藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 藻灶扎赠鄄
皂葬贼蚤糟 葬糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣 责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻 凿怎则蚤灶早 枣则怎蚤贼 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 葬灶凿
则蚤责藻灶蚤灶早 蚤灶 悦燥枣枣藻葬 葬则葬遭蚤糟葬 蕴咱允暂 援 郧藻灶藻贼蚤糟泽 葬灶凿 酝燥造藻糟怎造葬则 砸藻泽藻葬则糟澡袁
圆园员圆袁 员员渊猿冤院 猿员愿远 原 猿员怨苑
咱员圆暂摇 朱海生袁 潘东明袁 林义章袁 张志忠袁 温庆放援 根癌农杆菌介导草
莓遗传转化研究咱允暂 援 核农学报袁 圆园园愿袁 圆圆渊员冤院 猿远 原 源园
咱员猿暂摇 蕴藻藻 再 运袁 运蚤皂 陨 允援 酝燥凿怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 枣则怎蚤贼 泽燥枣贼藻灶蚤灶早 遭赠 葬灶贼蚤泽藻灶泽藻 泽怎责鄄
责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 藻灶凿燥 原 茁 原 员袁 源 原 早造怎糟葬灶葬泽藻 蚤灶 泽贼则葬憎遭藻则则赠咱允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则
月则藻藻凿蚤灶早袁 圆园员员袁 圆苑渊猿冤院 猿苑缘 原 猿愿猿
咱员源暂摇 蕴燥怎增藻贼 砸袁 悦葬增藻造 耘袁 郧怎贼蚤藻则则藻扎 蕴袁 郧怎佴灶蚤灶 杂袁 砸燥早藻则 阅袁 郧蚤造造藻贼 云袁
郧怎藻则蚤灶藻葬怎 云袁 孕藻造造燥怎曾 允援 悦燥皂责则藻澡藻灶泽蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 责则燥枣蚤造蚤灶早 燥枣 贼澡藻
责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻 早藻灶藻 枣葬皂蚤造赠 凿怎则蚤灶早 泽蚤造蚤择怎藻 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 蚤灶 粤则葬鄄
遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬咱允暂 援 孕造葬灶贼葬袁 圆园园远袁 圆圆源渊源冤院 苑愿圆 原 苑怨员
咱员缘暂摇 杂藻噪蚤灶藻 阅袁 酝怎灶藻皂怎则葬 陨袁 郧葬燥 酝袁 酝蚤贼泽怎澡葬泽澡蚤 宰袁 栽燥赠燥皂葬泽怎 栽袁 酝怎鄄
则葬赠葬皂葬 匀援 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 糟阅晕粤泽 藻灶糟燥凿蚤灶早 糟藻造造鄄憎葬造造 澡赠凿则燥造葬泽藻泽 枣则燥皂 责藻葬则
渊孕赠则怎泽 糟燥皂皂怎灶蚤泽冤 枣则怎蚤贼 葬灶凿 贼澡藻蚤则 蚤灶增燥造增藻皂藻灶贼 蚤灶 枣则怎蚤贼 泽燥枣贼藻灶蚤灶早 葬灶凿
凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 皂藻造贼蚤灶早 贼藻曾贼怎则藻咱 允暂 援 孕澡赠泽蚤燥造燥早蚤葬 孕造葬灶贼葬则怎皂袁 圆园园远袁
员圆远渊圆冤院 员远猿 原 员苑源
咱员远暂摇 允燥澡葬灶泽泽燥灶 运袁 耘造鄄粤澡皂葬凿 酝袁 云则蚤藻皂葬灶灶 砸袁 允觟则灶增葬造造 匀袁 酝葬则噪燥增蚤姚糟 韵袁
耘噪造怎灶凿 匀援 悦则赠泽贼葬造 泽贼则怎糟贼怎则藻 燥枣 责造葬灶贼 责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻 咱 允暂 援
云耘月杂 蕴藻贼贼藻则泽袁 圆园园圆袁 缘员源渊圆冤院 圆源猿 原 圆源怨
咱员苑暂摇 苗立祥袁 张豫超袁 杨肖芳袁 蒋桂华援 森林草莓全基因组 宰砸运再
转录因子基因的鉴定与分析 咱 允暂 援 核农学报袁 圆园员圆袁 圆远 渊愿冤院
员员圆源 原 员员猿员
咱员愿暂摇 罗云波袁郝四平袁生吉萍援 反义 粤悦杂转基因乙烯缺陷型番茄的生
理特性咱允暂 援 中国农业大学学报袁 圆园园园袁 缘渊猿冤院 员猿 原 员苑
咱员怨暂摇 栽蚤藻皂葬灶 阅 酝袁 匀葬则则蚤皂葬灶 砸 宰袁 砸葬皂葬皂燥澡葬灶 郧袁 匀葬灶凿葬 粤 运援 粤灶 葬灶贼蚤鄄
泽藻灶泽藻 责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻 早藻灶藻 葬造贼藻则泽 责藻糟贼蚤灶 糟澡藻皂蚤泽贼则赠 葬灶凿 泽燥造怎遭造藻
泽燥造蚤凿泽 蚤灶 贼燥皂葬贼燥 枣则怎蚤贼咱允暂 援 栽澡藻 孕造葬灶贼 悦藻造造 韵灶造蚤灶藻袁 员怨怨圆袁 源渊远冤院 远远苑
原 远苑怨
咱圆园暂摇 韵藻造造藻则 孕 宰袁 蕴怎 酝袁 栽葬赠造燥则 蕴 孕袁 孕蚤噪藻 阅 粤袁 栽澡藻燥造燥早蚤泽 粤援 砸藻增藻则泽蚤遭造藻
蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 燥枣 贼燥皂葬贼燥 枣则怎蚤贼 泽藻灶藻泽糟藻灶糟藻 遭赠 葬灶贼蚤泽藻灶泽藻 砸晕粤咱允暂援 杂糟蚤藻灶糟藻袁
员怨怨员袁 圆缘源渊缘园猿园冤院 源猿苑 原 源猿怨
咱圆员暂摇 郧葬燥 酝袁 酝葬贼泽怎贼葬 晕袁 酝怎则葬赠葬皂葬 匀袁 栽燥赠燥皂葬泽怎 栽袁 酝蚤贼泽怎澡葬泽澡蚤 宰袁
阅葬灶凿藻噪葬则 粤 酝袁 栽葬燥 砸袁 晕蚤泽澡蚤皂怎则葬 运援 郧藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 藻贼澡赠造藻灶藻
责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责藻葬则 渊 孕赠则怎泽 糟燥皂皂怎灶蚤泽 糟增援 耶 蕴葬 云则葬灶糟藻爷冤
憎蚤贼澡 泽藻灶泽藻 燥则 葬灶贼蚤泽藻灶泽藻 糟阅晕粤 藻灶糟燥凿蚤灶早 粤悦悦 燥曾蚤凿葬泽藻咱允暂 援 孕造葬灶贼 杂糟蚤鄄
藻灶糟藻袁 圆园园苑袁 员苑猿渊员冤院 猿圆 原 源圆
咱圆圆暂摇 蕴蚤 郧 载袁 匝蚤 允袁 在澡葬灶早 再 载袁 郧葬燥 在 匀袁 载怎 阅 匝袁 蕴蚤 匀 载袁 匀怎燥 悦 酝援
悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 枣燥则 贼澡藻 葬灶贼蚤泽藻灶泽藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则 燥枣
贼澡藻 责燥造赠责澡藻灶燥造 燥曾蚤凿葬泽藻 早藻灶藻 蚤灶 再葬造蚤 责藻葬则咱 允暂 援 云则燥灶贼蚤藻则泽 燥枣 粤早则蚤糟怎造鄄
贼怎则藻 蚤灶 悦澡蚤灶葬袁 圆园员员袁 缘渊员冤院 源园 原 源源
咱圆猿暂摇 酝葬则贼蚤灶藻造造蚤 云袁 栽藻燥 郧袁 哉则葬贼泽怎 杂袁 孕燥凿蚤泽澡藻贼贼赠 晕袁 阅葬灶凿藻噪葬则 粤援 耘枣枣藻糟贼泽
燥枣 贼澡藻 杂蚤造藻灶糟蚤灶早 燥枣 杂燥则遭蚤贼燥造 阅藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻 燥灶 杂怎早葬则 孕葬则贼蚤贼蚤燥灶蚤灶早 蚤灶
灾藻早藻贼葬贼蚤增藻 杂蚤灶噪泽 蚤灶 粤责责造藻 咱 允暂 援 耘怎则燥责藻葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则葬造
杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园员员袁 苑远渊圆冤院 缘远 原 远圆
咱圆源暂摇 马超袁 何娟袁郝青南袁 王蕾袁鲁晓燕袁 马兵钢援 构建番茄红素 茁 辕
着 环化酶基因 砸晕粤蚤 植物表达载体及其表达分析咱 允暂 援 核农学
报袁 圆园员园袁 圆源渊猿冤院 源愿圆 原 源愿怨
咱圆缘暂摇 宰葬灶早 粤 匝袁 阅燥灶早 宰 匝袁 宰藻蚤 再 宰袁 匀怎葬灶早 悦 酝袁 匀藻 蕴 云袁 再葬灶早 蕴
栽袁 蕴蚤 再 砸援 栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 泽怎早葬则糟葬灶藻 憎蚤贼澡 粤悦悦 燥曾蚤凿葬泽藻 葬灶贼蚤泽藻灶泽藻
早藻灶藻咱允暂 援 杂怎早葬则 栽藻糟澡袁 圆园园怨袁 员员渊员冤院 猿怨 原 源猿
猿园远
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员源袁圆愿渊源冤院园缘怨苑 耀 园远园源
栽澡藻 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 燥枣 粤灶贼蚤泽藻灶泽藻 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 灾藻糟贼燥则 燥枣 孕藻糟贼蚤灶
酝藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻 郧藻灶藻 葬灶凿 蚤贼泽 栽则葬灶泽枣藻则 贼燥 再葬造蚤 孕藻葬则
渊孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤 砸藻澡凿援 冤
蕴陨 匀怎蚤鄄曾怎葬灶摇 载哉 阅燥灶早鄄择蚤葬灶摇 匝陨 允蚤灶早摇 再粤晕 匀燥灶早鄄遭燥摇 蕴陨 郧怎蚤鄄择蚤灶
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灶怎糟造藻葬泽藻 泽蚤贼藻泽 枣燥则 再葬造蚤 责藻葬则 责藻糟贼蚤灶 皂藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻 早藻灶藻 憎藻则藻 凿藻泽蚤早灶藻凿 葬糟糟燥则凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 孕糟孕酝耘源 泽藻择怎藻灶糟藻 蚤灶 孕赠则怎泽 糟燥皂鄄
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蚤贼蚤增藻 燥灶藻泽援 栽澡藻 孕酝耘 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 蚤灶 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟葬造造怎泽 憎藻则藻 择怎葬灶贼蚤枣蚤藻凿 遭赠 砸藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 葬灶凿 贼澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡藻
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运藻赠 憎燥则凿泽院孕赠则怎泽 遭则藻贼泽糟澡灶藻蚤凿藻则蚤 砸藻澡凿援 曰孕藻糟贼蚤灶 酝藻贼澡赠造藻泽贼藻则葬泽藻曰粤灶贼蚤泽藻灶泽藻 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 灾藻糟贼燥则曰栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
源园远