全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):542 ～ 547
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0542-06
杏鲍菇产木聚糖酶固态发酵条件优化及其酶学性质
吴 萍 史 钧 李正鹏 祝嫦巍
(安徽科技学院生命科学学院，安徽 凤阳 233100)
摘 要:本文利用啤酒糟为主要原料，以杏鲍菇为菌种进行木聚糖酶发酵研究。通过单因素和正交试验
确定最佳培养条件，并对其粗酶的酶学性质进行研究。结果表明，各因素对产酶能力的影响大小依次
为:培养时间、料水比、氮源、pH、碳源。固态发酵的最佳培养条件为:碳源为以 6 ∶ 2 ∶ 2配备的啤酒糟、玉
米芯、麸皮混合物，氮源为 1. 5%的酵母膏，pH 为 5，装瓶量为 7g /50ml 三角瓶，接种量为 25%，培养天数
为 9d，料水比为 1∶ 1. 6。其粗酶液的最适反应温度为 50℃，最适 pH 为 6。在 pH 为 4 ～ 7 时酶的稳定性
较好，但木聚糖酶的热稳定性较差，60℃以上时酶活力损失 70%以上。
关键词:杏鲍菇;啤酒糟;固态发酵;木聚糖酶;正交试验
SOLID-PHASE FERMENTATION CONDITION AND ENZYMATIC
CHARACTERISTICS OF XYLANASE FROM Pleurotus eyngii
WU Ping SHI Jun LI Zheng-peng ZHU Chang-wei
(College of Life Science，Anhui Science and Technology University，Fengyang，Anhui 233100)
Abstract:In this paper brewer’s grains were used as main material to produce xylanase by Pleurotus eryngii.
Monofactorial and orthogonal experiments were conducted to optimize the fermentation conditions，and the enzymatic
characteristics of crude enzyme liquid were also studied. The results showed that the factors influencing xylanase yield
from main to minor were incubation time，the ratio between material and water，nitrogen source，pH and carbon source.
The optimal culture conditions for enzyme producing were:the mixture of brewer’s grains，corn cob and wheat bran of 6
∶ 2∶ 2 as carbon source，1. 5% of yeast extract as nitrogen source，pH 5，7g medium in 50ml erlenmeyer flask，25% of
inoculum’s volume for 9 days incubation，and the best ratio between material and water is 1∶ 1. 6. The optimal condition
of the crude enzyme liquid is 50℃，pH6. The enzyme is stabile between pH 4 ～ 7，but its themal stability is poor，more
than 70% of the enzyme activity lost above 60℃ .
Key words:Pleurotus eyngii;brewer’s grain;solid state fermentation;xylanase;orthogonal experiment
收稿日期:2009-08-30 接受日期:2009-11-20
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金(KJ2009B168Z)，安徽科技学院生物学重点建设学科项目
作者简介:吴 萍(1958-)，女，安徽五河人，副教授，主要从事微生物学教学与微生物发酵方面研究。Tel:0550-6732295;E-mail:wupinggu@ 126.
com
啤酒糟是啤酒酿造的主要废弃物之一，据测定鲜
啤酒 糟 含 水 分 79. 25%、粗 蛋 白 5. 19%、粗 脂 肪
1. 86%、粗纤维 1. 41%、无氮浸出物 11. 51%，灰分
0. 78%，其中无氮浸出物的主要成分是木聚糖。近年
来，我国啤酒工业迅速发展，成为世界上第二大啤酒生
产国，年产啤酒超过 2000 多万吨，由此产生约 1000 万
吨的啤酒糟。为此，一些研究人员对啤酒糟的利用进
行了探究，如从啤酒糟中提取膳食纤维、制备功能性乳
酸发酵纤维饮料、利用啤酒糟发酵生产蛋白饲料、利用
啤酒糟发酵生产复合氨基酸营养液等［1 ～ 3］。
本试验采用杏鲍菇为菌种，以啤酒糟作为主要原
料，添加其他辅料，对固态发酵生产饲用木聚糖酶的培
养条件进行优化。其意义一为啤酒糟这一再生资源的
应用寻找新的途径，二为探索杏鲍菇能否利用啤酒糟
245
3 期 杏鲍菇产木聚糖酶固态发酵条件优化及其酶学性质
产生高活力饲用木聚糖酶。国内外报道产木聚糖酶的
微生物大多是细菌和霉菌等，很少有利用杏鲍菇这类
食用真菌作为木聚糖酶产生菌进行研究。考虑杏鲍菇
本身为食用真菌，比较安全，且杏鲍菇是一种腐生菌，
能分泌水解性的胞外酶，可将自然界大分子有机物如
半纤维素(木聚糖)等分解利用，因此，本研究为用杏
鲍菇为菌种来发酵生产在饲料行业应用的木聚糖酶提
供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种 杏鲍菇(Pleurotus eyngii)由安徽科技学
院生物技术实验室保存。
1. 1. 2 原料 选择晒干的啤酒糟(蚌埠华润啤酒厂
提供)，使用微型粉碎机粉碎后备用。
1. 1. 3 培养基 斜面培养基:马铃薯 200g、蛋白胨
10g、葡萄糖 20g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0. 5g、VB1 2
粒、琼脂 20g、水 1000ml、pH 自然，在 121℃ 下灭菌
30min;液体种子培养基:马铃薯 200g、蛋白胨 10g、葡
萄糖 20g、啤酒糟 2g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0. 5g、
水 1000ml、pH 自然，在 121℃下灭菌 30min;固体基础
发酵培养基:啤酒糟 8g、麸皮 2g、硫酸铵 0. 1g、KH2PO4
0. 05g、MgSO4·7H2O 0. 05g;料水比 1 ∶ 1. 7 ～ 1 ∶ 2. 2，pH
自然，121℃灭菌 30min。
1. 1. 4 仪器及试剂 T6 新世纪可见紫外分光光度计
(北京普析通用仪器有限公司)、QYC-211 全温振荡培
养箱(上海福玛实验设备有限公司)、HH·B11·420 电
热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)、LDZX-50KBS
立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、SW-CJ-
IF 超净工作台(苏净集团安泰公司)、HH-6 型数显恒
温水浴锅(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)、FZ-
102 型微型植物粉碎机(天津市泰斯特特仪器有限公
司)。3，5-二硝基水杨酸(中国医药集团上海试剂公
司)、燕麦木聚糖(Sigma 公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 斜面菌种培养 将杏鲍菇接种至新制的斜面
培养基上，置于恒温培养箱中，在 25℃恒温条件下培
养 7d。
1. 2. 2 液体种子培养 将已活化的菌种在无菌条件
下，用事先准备好的无菌液体培养基分别洗下菌丝，将
其接入到装有 80ml 液体种子培养基的 250ml 三角烧瓶
中，然后放置于 25℃、160r /min 的恒温摇床中培养 7d。
1. 2. 3 固体发酵培养 将培养好的液体种子按干料
的 20% 接种量接入到已灭菌的基础发酵培养基中
(5g /50ml 三角烧瓶)，置于 25℃恒温箱中培养 10d。
1. 2. 4 单因素试验设计 碳源组分及配比的影响:以
基础发酵培养基为基础，其他培养条件不变，在培养基
中将碳源分别替换为啤酒糟 10g、啤酒糟 8g 和玉米芯
2g;啤酒糟 6g、玉米芯 2g、麸皮 2g，和原基础培养基共
3 个因素。氮源的影响(添加量均为培养基干料的
1%):以基础发酵培养基为基础，其他培养条件不变，
在培养基中将氮源分别替换为硝酸铵、硫酸铵、牛肉
膏、酵母膏、黄豆粉、玉米粉 6 个因素。不同起始 pH
值的影响:其他培养条件不变，在基础发酵培养基中将
起始 pH 值设定为 4、5、6、7、8 等 5 个梯度。不同装瓶
量的影响:其他培养条件不变，在发酵培养时，将装瓶
量设定为在 50ml 的三角瓶中分别装入基础发酵培养
基 1、3、5、7 和 9g 等 5 个梯度。不同接种量的影响:其
他培养条件不变，在发酵培养时，将接种量设定为
5%、10%、15%、20%、25%、30%等 6 个梯度。不同培
养天数的影响:其他培养条件不变，将培养天数设定为
7、8、9、10 和 11d 等 5 个梯度进行试验。不同料水比
的影响:其他培养条件不变，在基础发酵培养基中将料
水比设定为 1:1. 3、1∶ 1. 5、1∶ 1. 8、1∶ 2. 0 和 1∶ 2. 2 等 5
个梯度。
1. 2. 5 正交试验设计 在单因素试验的基础上，采用
L16(4
5)正交试验法对碳源及组分配比、氮源添加量、
pH 值、料水比、培养时间 5 个影响产酶的因素进行优
化，因素水平表见表 1。
表 1 因素水平表
Table 1 The table of factors and level
水平 level
A 啤酒槽 ∶玉米芯 ∶麸皮
brewers grains∶ corn cob∶ bran
B 酵母膏
yeast extract(%)
C pH
D 料水比
ratio beween material and water
E 培养天数
culture days
1 5∶ 3∶ 3 0. 5 4 1∶ 1. 6 7
2 6∶ 2∶ 2 1. 0 5 1∶ 1. 8 8
3 7∶ 2∶ 1 1. 5 6 1∶ 2. 0 9
4 8∶ 1∶ 1 2. 0 7 1∶ 2. 2 10
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核 农 学 报 24 卷
1. 2. 6 木聚糖粗酶活力的测定(DNS 法) 向发酵好
的固态培养物中加入 pH4. 8 的乙酸-乙酸钠缓冲液，置
于 40℃恒温水浴锅中水浴加热 2h，用 8 层纱布过滤，
将滤液置于 5ml 的离心管中 6000r /min 离心 15min，上
清液即为粗酶液。取 0. 1ml 粗酶液于 15ml 的干燥刻
度试管之中，加入 1%木聚糖溶液 1. 9ml，50℃水浴加
热 30min，使粗酶液与木聚糖充分反应，再加入 3ml
DNS 试剂，沸水浴 5min 终止反应，冷却至室温，定容至
15ml，于 520nm 下测吸光度值。以 100℃灭活的粗酶
液作对照。
木聚糖酶酶活力单位定义为:在 50℃条件下每分
钟水解木聚糖形成相当于 1μg 还原糖(以木糖计)所
需的酶量(U /g)，即:
木聚糖酶活力单位 = N × G /0. 1 × 30
其中，N:酶液稀释倍数;G:酶解溶液中木糖的含
量，μg;0. 1:加酶量;30:酶解时间，min。
1. 2. 7 木聚糖酶酶学性质研究 酶的最适 pH 值:取
0. 1ml 粗酶液，分别加入到用 pH 3、4、5、6、7 和 8 的缓
冲液配制的木聚糖溶液中，按 1. 2. 6 方法测粗酶液的
酶活力，得出木聚糖酶粗酶液的最适反应 pH 值。酶
的最适温度:将粗酶液分别在 30℃、40℃、50℃、60℃、
70℃和 80℃的条件下与底物反应，按 1. 2. 6 酶活力的
测定方法测粗酶液的酶活力，确定此木聚糖酶粗酶液
的最佳反应温度。木聚糖酶的 pH 稳定性:用 pH3、4、
5、6、7 和 8 的缓冲液稀释酶液，50℃水浴保温 4h，按
1. 2. 6 酶活力测定方法测粗酶液残余的酶活力，以酶
活力最高者为 100%;木聚糖酶的热稳定性:将粗酶液
分别放在 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和 80℃水浴中
保温 1h，按 1. 2. 6 酶活力的测定方法测粗酶液残余的
酶活力，以酶活力最高者为 100%。
2 结果与分析
2. 1 固体发酵单因素试验
2. 1. 1 碳源配比对木聚糖酶活力的影响 由图 1 可
知，当以啤酒糟、玉米芯与麸皮 3 者作为混合碳源时木
聚糖酶的活力最高，以啤酒糟和玉米芯作为碳源时木
聚糖酶的活力次之，而单一用啤酒糟作为碳源时，酶活
力相对较低。
2. 1. 2 氮源对木聚糖酶活力的影响 由图 2 中可以
看出，6 种氮源中使用酵母膏时所产木聚糖酶的活力
最高，这可能与酵母膏中除含有有机氮以外，还含有一
些其他供菌株生长的有机物有关，因此加入一定量的
酵母膏作为氮源有利于菌株的产酶。
图 1 碳源不同配比对产木聚糖酶的影响
Fig. 1 The influence of different carbon
sources on xylanase production
图 2 氮源对产木聚糖酶的影响
Fig. 2 The influence of different nitrogen sources
on xylanase production
2. 1. 3 起始 pH 值对木聚糖酶活动的影响 由图 3
可知，当起始 pH 值为 5 时菌株产木聚糖酶最高，这是
由该菌株的生物学特性所决定的。
图 3 pH 值对产木聚糖酶的影响
Fig. 3 The influence of pH
on xylanase production
2. 1. 4 装瓶量对木聚糖酶活力的影响 由图 4 可
知，装瓶量对产酶活力有直接影响。装瓶量少，培养基
445
3 期 杏鲍菇产木聚糖酶固态发酵条件优化及其酶学性质
的水分散发过快，菌株的生长受到抑制，从而影响产酶
量;装瓶量过多，瓶内通气量较差，也不利于菌株生长
及酶的产生，因此，装瓶量为 7g 时菌株的产酶量最高。
图 4 装瓶量对木聚糖酶的影响
Fig. 4 The influence of bottling capacity
on xylanase production
2. 1. 5 接种量对产木聚糖酶活力的影响 由图 5 可
知，在一定范围内接种量对酶活力的影响不大。当接
种量为 25%时，产酶活力较高，若从生产成本考虑，可
选用 15% ～ 20%的接种量。
图 5 接种量对产木聚糖酶的影响
Fig. 5 The influence of inoculum
on xylanase production
2. 1. 6 培养天数对产木聚糖酶活力影响 由图 6 可
以看出，不同培养天数对酶活力影响不同，酶活力随着
培养天数的增加而增加，当培养到第 9 天后，酶活力达
到最高峰，继续延长培养天数，酶活力反而下降。这可
能是由于发酵时间过长产生了其他代谢产物，抑制了
酶的活性。因此，培养天数以 9d 为宜。
2. 1. 7 料水比对产木聚糖酶活力的影响 由图 7 可
看出，料水比为 1 ∶ 1. 8 时酶活力最高。如果含水量过
低会导致培养基干燥，孢子萌发时间延长，影响菌丝体
的生长，菌株产酶量较低;含水量过高，会使培养基粘
结成块，多孔性降低，透气性差，不利于菌株的生长，酶
产量降低。因此，适当水分含量的培养基不仅对菌株
的生长至关重要，而且是木聚糖酶合成的关键因素。
图 6 培养天数对产木聚糖酶的影响
Fig. 6 The influence of different culture days
on xylanase production
图 7 料水比对产木聚糖酶的影响
Fig. 7 The influence of ratio beween
material and water on xylanase production
2. 2 固态发酵正交优化试验
产酶条件的正交试验结果见表 2。
由表 2 可以看出，在 16 个处理中，产酶量各不相
同，存在一定的差异。决定产酶量大小的影响因子
依次是 E ﹥ D ﹥ B ﹥ C ﹥ A。产酶条件的最优组合
为 A2B3 C2D1 E3，即培养基中碳源为啤酒糟 ∶ 玉米芯 ∶
麸皮 = 6 ∶ 2 ∶ 2，氮源为酵母膏 1. 5%，pH 5，装瓶量
7g /50ml 三角瓶装，接种量 25%，培养天数 9d，料水
比 1 ∶ 1. 6。
2. 3 酶学性质研究
2. 3. 1 酶的最适 pH 值 按 1. 2. 7 的方法进行试验，
结果如图 8 所示。在 pH 6 时，木聚糖酶活力最高，在
偏酸或偏碱的条件下，木聚糖的酶活力明显下降。因
此杏鲍菇产生的木聚糖酶催化反应的最适反应 pH 值
为 6。
2. 3. 2 酶的最适温度 按 1. 2. 7 的方法进行试验，结
果如图 9 所示。由图 9 可知，在 30℃ ～ 50℃范围内木
聚糖酶活力随着温度的升高而迅速增加，50℃时酶活
力达到最大值，60℃ 后酶活力开始急剧下降。因此
50℃是木聚糖酶的最适反应温度。
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核 农 学 报 24 卷
表 2 正交试验结果
Table 2 The results of orthogonal experiment
处理 treatment A B C D E 酶活力 enzyme activity(U /g)
1 1 1 1 1 1 2274. 90
2 1 2 2 2 2 1904. 17
3 1 3 3 3 3 2748. 74
4 1 4 4 4 4 1222. 95
5 2 1 2 3 4 2123. 13
6 2 2 1 4 3 2059. 41
7 2 3 4 1 2 2252. 88
8 2 4 3 2 1 1876. 36
9 3 1 3 4 2 1832. 34
10 3 2 4 3 1 1868. 25
11 3 3 1 2 4 1723. 43
12 3 4 2 1 3 2426. 66
13 4 1 4 2 3 2164. 84
14 4 2 3 1 4 1981. 79
15 4 3 2 4 1 2025. 81
16 4 4 1 3 2 1662. 03
k1 2037. 69 2098. 80 1929. 94 2234. 06 2011. 33
k2 2077. 95 1953. 40 2119. 94 1917. 20 1912. 85
k3 1962. 67 2187. 72 2109. 81 2100. 54 2349. 91
k4 1958. 62 1797. 00 1877. 23 1785. 13 1762. 83
R 119. 33 390. 72 242. 72 448. 93 587. 09
图 8 pH 对木聚糖酶活力的影响
Fig. 8 The influence of pH on xylanase activity
2. 3. 3 酶的 pH 稳定性 按 1. 2. 7 的方法进行试验，
结果如图 10 所示。由图 10 可以看出，该菌株所产生
的木聚糖酶，在 pH 值为 4 ～ 7 时酶活力基本稳定，当
pH 值在 4 以下或高于 7 时木聚糖酶活性逐渐下降，但
下降速度较慢，pH 达到 8 时，相对酶活力为 59. 81%。
2. 3. 4 木聚糖酶热稳定性 按 1. 2. 7 方法进行试验，
结果如图 11 所示。由图 11 可知在 30℃ ～ 50℃时木
聚糖酶酶活力比较稳定，超过 50℃，相对酶活力迅速
下降，60℃以上时酶活力损失 70%以上。说明该酶热
稳定性较差。
图 9 温度对木聚糖酶活力的影响
Fig. 9 The influence of temperature
on xylanase activity
3 讨论
本试验经正交试验设计，得出各因素对木聚糖酶
活力的影响顺序依次为培养时间、料水比、氮源、pH 和
碳源。正交试验中，pH 值并不是主要影响因素，但培
养基初始 pH 值对木聚糖酶的合成有较大影响。因
此，在生产中可以考虑在固体培养基中加入一些缓冲
剂来控制培养基中的 pH 变化。
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图 10 木聚糖酶 pH 稳定性
Fig. 10 pH stability of xylanase
图 11 木聚糖酶的热稳定性
Fig. 11 Thermal stability of xylanase
关于食用真菌产木聚糖酶研究，国内只有少量报
道，其中大部分产木聚糖酶活性较低。岳晓禹等［9］研
究食用菌 Pleurotus ostreatus SYJ042 液体发酵产木聚糖
酶活性为 5. 8U /ml;吴萍等［10，11］研究白灵菇，培养条
件优化后木聚糖酶活性达 71. 34U /ml，营养条件的优
化后木聚糖酶活性达 60. 50U /ml。本研究中杏鲍菇产
木聚糖酶固态发酵条件经正交试验优化后的表观组合
达 2748. 74(U /g)，为目前国内报道食用真菌的最高产
酶水平。
在优化条件下，选用杏鲍菇固态发酵啤酒糟生产
木聚糖酶，具有生产成本低、经济效益高和生产工艺简
单等特点，能有效利用资源又能治理环境污染，变废为
宝。且杏鲍菇是可食用的真菌，利用杏鲍菇固态发酵
啤酒糟生产饲用木聚糖酶更具安全性。
4 结论
以啤酒糟为主要原料杏鲍菇产木聚糖酶的最佳固
态发酵条件碳源为啤酒糟 ∶玉米芯 ∶麸皮 = 6∶ 2∶ 2，氮源
为 1. 5%的酵母膏，pH 5，装瓶量 7g /50ml 三角瓶装，
接种量 25%，培养天数 9d，料水比为 1∶ 1. 6。
酶学性质的研究结果表明，酶的最适反应温度为
50℃，最适 pH 为 6，在 pH 为 4 ～ 7 时酶的稳定性较好，
但木聚糖酶的热稳定性较差，60℃以上时酶活力损失
70%以上。
参考文献:
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(责任编辑 高美须 裴 颖)
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