全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 032280206
γ射线对斜卧青霉的诱变筛选及产酶条件优化
宋安东1 ,2 ,3 　苏丽娟2 　谢　慧1 　曲音波3 　杨　铭4
(11 河南农业大学生命科学学院 ,河南 郑州　450002 ;21 河南天冠集团博士后科研工作站 ,河南 南阳　473000 ;
31 山东大学生命科学学院博士后流动站 ,山东 济南　250100 ;41 商丘职业技术学院农学系 ,河南 商丘　476000)
摘 　要 :以斜卧青霉 ( Penicillium decumbens) A10 为出发菌株 ,经 450 Gy 60 Coγ射线诱变处理 ,选育出 1 株
纤维素酶高产菌株 A50 ,对其产纤维素酶的液态发酵条件进行研究优化 ,确定了所试因素的最佳组合 ,
即主碳源浓度为 5 % ,其中麸皮与玉米秸秆比例为 1∶1 ,辅加碳源为 011 %的葡萄糖 ,辅加氮源为 012 %的
磷酸氢二铵 , Tween280 添加量为 011 % ,培养基初始 pH 为 510 ,300ml 三角瓶的装液量为 30ml、接种量
10 %、培养温度为 32 ℃、摇床转速 200rΠmin。发酵至 60h 时 ,纤维素酶活和滤纸酶活均达到最高 ,分别为
27128 和 1198IUΠml ,较出发菌株 A10 分别提高了 3312 %和 45159 %。
关键词 :60 Coγ射线辐照 ;斜卧青霉 A10 ;诱变 ;发酵 ;纤维素酶
MUTANT STRAIN SCREENING BY 60 Coγ2RAYS IRRADIATION AND
ITS CELLULASE ENZYME PRODUCE CONDITION
SONG An2dong1 ,2 ,3 　SU Li2juan2 　XIE Hui1 　QU Yin2bo3 　YANG Ming4
(11Life Science College , Henan Agricultural University , Zhengzhou , Henan 　450002 ;
21 Postdoctoral Research Station , Henan Tianguan Group , Nanyang , Henan 　473000 ; 31 Postdoctoral Programs , Life Science College ,
Shandong University ,Jinan , Shandong 　250100 ; 41Agronomy Department , Shangqiu vocational Technical College , Shangqiu , Henan 　476000)
Abstract :A mutant strain A50 with high cellulase activity was induced and isolated by using 60 Coγ2rays irradiation from the
initial Penicillium decumbens A101 The optimum fermentation conditions of A50 were investigated through orthogonal designing
experiment , the major carbon resource 5 % , the ratio between wheat bran and corn straw 1∶1 , the concentration of glucose as
supplemental carbon 011 % , the concentration of (NH4 ) 2 HPO4 as supplemental nitrogen resource 012 % , the initial pH of
liquid medium 510 , the inoculated amount for fermentation 10 % and the concentration of Tween280 011 % , 30ml initial media
filled in the 300ml flask with culture condition of 32 ℃and 200rΠmin. Under the optimum conditions mentioned above , the
highest activities of cellulase and filter paper enzyme were 27128 and 1198IUΠml at 60h fermentation , respectively , which was
3312 % and 45159 % higher than those of the initial strain.
Key words :60 Coγ2rays irradiation ; Penicillium decumbens A10 ; inducement ; fermentation ; cellulase
收稿日期 :2007208211 　接受日期 :2007210210
基金项目 :河南省杰出人才创新基金项目 (321001300) ;国家农业成果转化资金项目 (2006GB2D000173)
作者简介 :宋安东 (19722) ,男 ,河南宜阳人 ,副教授 ,博士后 ,研究方向为微生物能源工程和生物资源转化。E2mail :song1666 @1261com　　纤维素是葡萄糖通过β21 ,4 糖苷键结合而成的高分子聚合物 ,是植物细胞壁的主要构成物质之一 ,占植物秸秆干重的 1Π3～1Π2。在自然界有机物中 ,纤维素储存量最多。据估计 ,整个地球每年由光合作用生成的纤维素高达 4000 亿吨。若将其降解为葡萄糖 ,并进一步转化为食品、饮料或乙醇 ,将对缓解人类目前面临 的粮食和能源危机发挥重大作用[1～3 ] 。然而 ,目前普遍存在着纤维素酶活力偏低、成本偏高、纤维素降解成本过高等问题 ,这成为限制纤维素原料进一步利用的重要瓶颈[4 ] 。近十几年来 ,经过研究人员大量的育种和工艺研究[5～8 ] ,纤维素酶活性得到不断提高 ,含高纤维素酶的优良菌株也时有发现 ,但仍与实际生产需求
082　 核 农 学 报　2008 ,22 (3) :280～285Journal of Nuclear Agricultural Sciences
有一定距离。选育高产纤维素酶菌株 ,探索可用于纤
维素酶制剂工业化生产的液态发酵工艺是当前研究的
重点 ,这将为纤维素资源的高效转化和利用尤其是为
纤维素原料生产燃料乙醇中成本的降低奠定基础。
斜卧青霉 ( Penicillium decumbens) A10 是产生纤维
素酶的重要菌株[9 ,10 ] 。本研究通过诱变该菌株 ,以期
选育出具更高活力的纤维素酶菌株 ,并对菌株的液态
发酵条件进行优化 ,为纤维素酶的工业化生产奠定基
础。
1 　材料与方法
111 　材料
出发菌株斜卧青霉 A10 ( Penicillium decumbens) ,由
山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授提
供。斜面培养基 :10 %麸皮浸汁 ,1 %葡萄糖 ,2 %琼脂。
微晶纤维素双层平板培养基 (菌株的初筛培养基) [10 ] :
下层为加浓 Mandels 氏营养盐液 ,上层为 1 %微晶纤维
素 + 2 %的琼脂 ;种子摇瓶培养基 :10 %麸皮浸汁 ,1 %
葡萄糖 ,每 100ml 三角瓶中装 60ml 麸皮浸汁 ;产酶基
础培养基 : 2 %麸皮、3 %玉米秸秆粉、013 % KH2 PO4 、
012 % ( NH4 ) 2 SO4 、0103 % CO ( NH2 ) 2 、0103 % MgSO4 、
015 %CaCO3 。
以上培养基均匀配制分装后在 121 ℃灭菌 30min ,
备用。
112 　方法
11211 　菌株诱变[11 ] 　取恒温箱内 30 ℃下培养 3d 的
麸皮浸汁斜面菌种 ,用 0175 %的生理盐水洗下孢子 ,
置于无菌并盛有玻璃珠的三角瓶中 ,在 220rΠmin 的摇
床上震荡 5h ,使孢子活化和分散 ,然后用脱脂棉过滤
孢子悬液 ,用血球计数板对孢子进行镜检计数 ,用生理
盐水将孢子悬液稀释到 106～107 ,再进行60 Coγ诱变处
理[12 ] 。诱变处理在河南省科学院同位素所钴源进行 ,
辐照剂量分别为 0 (对照) 、450、550、650、750 和 850 Gy ,
剂量率为 200GyΠmin。
致死率 ( %) = (1 - 诱变处理的孢子液在平板上长
出的菌落数Π未诱变的孢子在平板上长出的菌落数) ×
100 %
11212 　菌株筛选 　将经诱变处理的孢子悬液稀释成
一定浓度梯度 ,涂布到初筛培养基平板上 ,30 ℃避光培
养 3d 后 ,挑取水解圈较大的菌落转接到麸皮浸汁斜面
培养基上扩大培养 ,然后接入摇瓶发酵进行复筛 ,选取
酶活力高的菌株[13 ] 。
11213 　发酵产酶试验 　将筛选的菌株按 10 %的接种
量接入产酶基础培养基中 ,48h 前温度控制在 32 ℃,摇
床转速控制为 200rΠmin ;48h 后温度降为 28 ℃,摇床转
速降为 160rΠmin ,发酵周期为 68h。
113 　分析测定
将发酵液在低温下以 4000rΠmin 离心 10min ,取上
清粗酶液进行活力测定。
11311 　羧甲基纤维素钠盐 (CMC2Na) 酶活性测定[14 ] 　
取 012ml 适当稀释的酶液 ,加入到 118ml 1 %的纤维素
溶液 中 ( 用 011molΠL 的 HAc2NaAc 缓 冲 液 配 制 ,
pH418) ,在 50 ℃保温 30min 后 ,加入 2ml DNS 溶液 ,煮
沸 10min 灭活显色 ,定容到 15ml ,在 550nm 波长下测定
还原糖量 (以葡萄糖计) ,以灭活的酶液作为对照。
11312 　滤纸酶活 (FPA)测定[14 ] 　取 012ml 适当稀释的
酶液 ,加 112ml pH418 的 011molΠL 的醋酸缓冲液和 1
条 1 ×6cm 滤纸条 (50 + 015mg) ,在 50 ℃保温 1h 后 ,加
入 2ml DNS 溶液 ,煮沸 10min 灭活显色 ,定容到 15ml ,
在 550nm 波长下测定还原糖量 (以葡萄糖计) ,以灭活
的酶液作为对照。在上述条件下 ,每 min 产生 1μmol
葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位 (UΠml) 。(滤纸
是聚合度和结晶度都居中等的纤维性材料 ,以其为底
物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶
系总的糖化能力的方法得到广泛应用 ,它反映了三类
酶组分的协同作用 ,统称滤纸酶活 (FPA) 。)
2 　结果与分析
211 　出发菌株经诱变处理后的存活曲线
60 Coγ射线辐照斜卧青霉对其存活率的影响见图
1。
图 1 　60 Coγ射线辐照处理后斜卧青霉 A10 的存活曲线
Fig. 1 　The survival rate of Penicillium decumbens A10
after 60 Coγ2rays irradiation
由图 1 可看出 ,随着剂量的增大 ,斜卧青霉的存活
率下降 ,致死率上升。一般情况下 ,致死率在 75 %～
85 %之间为合适的诱变剂量 ,在 450Gy 条件下 ,孢子悬
液的致死率为 8213 % ,所以选取 450Gy 为最适诱变剂
182　3 期 γ射线对斜卧青霉的诱变筛选及产酶条件优化
量。
212 　诱变选育
经 450Gy 60 Coγ射线处理的孢子悬液 ,稀释后涂
布在初筛平板上。从微晶纤维素双层平板上挑取透明
圈与菌落直径二者比值较大的 200 多个菌落 ,扩大培
养后接入产酶基础培养基 ,并测其酶活力。酶活力比
出发菌株 A10 高的菌株列入表 1。由表 1 可看出 ,突
变株 A50 的纤维素酶活力和滤纸酶活力最高 ,分别为
25133IUΠml 和 1181IUΠml ,比出发菌株 A10 分别提高了
2317 %和 33113 %。
表 1 　60 Coγ射线诱变的复筛结果
Table1 Rescreening result of mutation after 60 Coγ2rays irradiation
菌株编号
No. of mutation
strain
透明圈直径
(A) diameter of
hydrolysis
zone (mm)
菌落直径 (B)
diameter
of clone (mm)
AΠB 纤维素酶活性cellulase
activity
( IUΠml) 滤纸酶活性FPA activity( IUΠml) 纤维素酶活性提高improved rateof cellulase
activity ( %)
滤纸酶活性
提高
improved rate
of FPA
activity ( %)
A10 7 215 218 20148 1136
A1 1011 3 3137 23114 1163 13101 19150
A23 618 119 3158 24115 115 17193 10141
A27 1118 3 3193 23176 1154 16105 13106
A40 12 312 3175 23133 1145 13190 6163
A50 816 118 4178 25133 1181 23170 33113
213 　突变株 A50 的遗传稳定性
将突变株 A50 的孢子在麸皮浸汁斜面培养基上
连续转接 8 次 ,利用产酶基础培养基进行发酵产酶。
由表 2 可知 ,突变株 A50 转管 8 次后 ,其纤维素酶活力
和滤纸酶活力变化不大 ,说明 A50 是遗传稳定的突变
株。
表 2 　突变株 A50 的遗传稳定性
Table 2 　Genetic stability of mutant A50
( IUΠml)
传代次数
No. of generation
纤维素酶活性
cellulase activity
滤纸酶活性
FPA activity
1 25133 1181
2 25175 1179
3 24158 1167
4 23163 1121
5 25192 1184
6 26124 1185
7 26156 1185
8 24189 1176
214 　突变株 A50 产酶条件优化
21411 　不同主碳源对菌株产酶的影响　对霉菌而言 ,
纤维素酶是胞外酶 ,是诱导酶 ,碳源的不同对纤维素酶
的合成有显著影响 ,麸皮因含有淀粉、纤维素、半纤维
素、有机氮及生长因子等营养物质 ,而被广泛地应用于
发酵行业中。麸皮促进产酶的原因 ,可能是所含的纤
维素和半纤维素对酶的合成具有诱导作用。多种碳源
与麸皮复合对产酶的影响结果见表 3。
表 3 　不同碳源组合对突变株 A50 产酶的影响
Table 3 　Effects of different carbon resource on cellulase
produce of mutant A50
主碳源
main carbon source
纤维素酶活性
cellulase activity
( IUΠml) 滤纸酶活性FPA activity( IUΠml)
2 %麸皮 + 3 %玉米秸秆
2 %wheat bran + 3 %corn stalk
23179 1146
2 %麸皮 + 3 %纤维素
2 %wheat bran + 3 %cellulose
9113 0159
2 %麸皮 + 3 %微晶纤维素
2 %wheat bran + 3 % microcrystalline cellulose
21158 1122
2 %麸皮 + 3 %葡萄糖
2 %wheat bran + 3 %glucose
20150 0156
2 %麸皮 + 3 %蔗糖
2 %wheat bran + 3 %sucrose
9133 0131
2 %麸皮 + 3 %玉米芯
2 %wheat bran + 3 %corncob
15163 1166
3 %麸皮 + 115 %微晶纤维素
3 %wheat bran + 115 %
microcrystalline cellulose
16177 0162
3 %麸皮 + 115 %纤维素
3 %wheat bran + 115 % cellulose 20198 1104
由表 3 可以看出 ,麸皮在各组合中均对产酶起着
重要作用 ,以麸皮与玉米秸秆的复合最为显著 ,在此条
件下 ,纤维素酶活力和滤纸酶活力分别为23179IUΠml
和 1146IUΠml。因此选用 2 %麸皮与 3 %玉米秸秆为
A50 菌株的主碳源组成。
21412 　辅加碳源对产酶的影响　在主碳源为 2 %麸皮
和 3 %玉米秸秆的条件下 ,选择浓度为 011 %的不同糖
282 核　农　学　报 22 卷
类作为辅加碳源 ,液体发酵 68h 测定纤维素酶的活力 ,
结果如图 2 所示。
图 2 　辅加碳源对突变株 A50 产酶的影响
Fig. 2 　Effects of supplementary carbon resource on
cellulase produce of mutant A50
　　由图 2 可知 ,当碳源为葡萄糖时 ,两种酶的活力都
达到最高 ,这可能是葡萄糖作为速效碳源可促进菌丝
体的生长 ,从而有利于纤维素酶产生的原因 ,而其他几
种糖类都不同程度地影响了纤维素酶的活力。在添加
011 %葡萄糖时 ,纤维素酶活力和滤纸酶活力分别为
26101IUΠml 和 1186IUΠml。
21413 　不同氮源对产酶的影响　在主碳源为 2 %麸皮
和 3 %玉米秸秆、辅加碳源为 011 %的葡萄糖的条件
下 ,选取硝酸铵、草酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵、尿素、牛
肉膏、蛋白胨代替原来的硫酸铵 ,浓度均为 012 % ,对
突变株 A50 进行液体发酵试验 ,结果如图 3 所示。
图 3 　辅加氮源对突变株 A50 产酶的影响
Fig. 3 　Effects of supplementary nitrogen on cellulase activity of mutant A50
　　由图 3 可知 ,和其他氮源相比 ,以磷酸氢二铵和硝
酸铵代替硫酸铵作为氮源时 ,对产酶影响都很大。以
硝酸铵为氮源时 ,纤维素酶活性和滤纸酶活性分别为
24159IUΠml 和 1155IUΠml ,以磷酸氢二铵为氮源时 ,二
者分别为 24138IUΠml 和 1180IUΠml ,综合考虑结果 ,最
终选取磷酸氢二铵为最佳氮源。
21414 　正交试验设计　选择主碳源浓度、麸皮与玉米
秸秆的比例、培养基初始 pH 值、装液量 (300ml 三角
瓶) 、接种量、Tween280 和温度七因子三水平进行正交
试验 ,如表 4。
采用表头为L18 (37 )的正交试验结果如表 5 所示。
表 4 　正交试验因素水平表
Table 4 　Factors and levels table of orthogonal test
水平
level
主碳源浓度
main carbon source
concentration
( %)
麸皮∶
玉米秸秆
wheat bran :
corn straw
pH
装液量
media
volumn(ml)
接种量
inoculated
amount ( %)
Tween280( %) 温度与转速
temperature and rotating speed
1 4 3∶7 510 30 5 011 (48h 前) 32 ℃,200rΠmin , (48h 后) 28 ℃,160rΠmin
2 5 2∶3 610 60 8 012 30 ℃200rΠmin
3 6 1∶1 710 90 10 013 32 ℃200rΠmin
　　比较各因素的极差大小可以看出 ,装液量对菌株
的纤维素酶活性影响最大 ,其次是摇床的温度和转速 ,
之后是产酶培养基的初始 pH 值、主碳源浓度 ,最后是
Tween280 的添加 ,该物质对菌株纤维素酶活性的影响
最小 ,几乎没有影响。
比较各试验因子的均值大小得出 ,菌株的最佳产
酶条件为 :主碳源浓度为 5 % ,麸皮与玉米秸秆的比例
为 1∶1 ,培养基初始 pH 为 510 ,300ml 三角瓶的装液量
为 30ml ,接种量 10 % , Tween280 添加量为 011 % ,培养
温度为 32 ℃,摇床转速 200rΠmin。
382　3 期 γ射线对斜卧青霉的诱变筛选及产酶条件优化
表 5 　试验方案及结果计算表
Table 5 　Scheme of experiment design and results of calculation
试验序号
test No.
主碳源浓度
main carbon
source ( %)
麸皮∶
玉米秸秆
wheat bran∶
corn straw
pH
装液量
media volumn
(ml)
接种量
inoculum
( %)
Tween280 ( %) 温度与转速temperature and
rotating speed
纤维素酶
活性纤维素
ase activity
( IUΠml)
1 1 1 1 1 1 1 1 20176
2 1 2 2 2 2 2 2 18129
3 1 3 3 3 3 3 3 19149
4 2 1 1 2 2 3 3 23136
5 2 2 2 3 3 1 1 18163
6 2 3 3 1 1 2 2 22186
7 3 1 2 1 3 2 3 25146
8 3 2 3 2 1 3 1 13189
9 3 3 1 3 2 1 2 19103
10 1 1 3 3 2 2 1 10100
11 1 2 1 1 3 3 2 20160
12 1 3 2 2 1 1 3 19137
13 2 1 2 3 1 3 2 18107
14 2 2 3 1 2 1 3 21116
15 2 3 1 2 3 2 1 22161
16 3 1 3 2 3 1 2 19171
17 3 2 1 3 1 2 3 19103
18 3 3 2 1 2 3 1 23117
均值 1 mean 1 18109 19156 20190 22134 19100 19178 18118
均值 2 mean 2 21112 18160 20150 19154 19117 19171 19176
均值 3 mean 3 20105 21109 17185 17138 21108 19176 21131
极差 R range R 3103 2149 3105 4196 2108 0107 3113
最优水平
optimal level
2 3 1 1 3 1 3
215 　突变株纤维素酶的产酶历程
将突变株 A50 接入上述优化培养基 ,并于 32 ℃、
摇床转速 200rΠmin 条件下培养 ,从 24h 开始测定纤维
素酶的活性 ,每隔 12h 测定 1 次 ,直到 96h 结束 ,结果
如图 4 所示。
图 4 　突变株 A50 纤维素酶的产酶历程
Fig. 4 　The course of cellulase producing by mutant A50
由图 4 可知 ,该菌株从 24h 之后开始产酶 ,在 60h
达到产酶高峰 ,纤维素酶活性为 27128IUΠml ,滤纸酶活 性为 1198IUΠml ,之后其酶活性逐渐下降。3 　结论与讨论以60 Coγ射线对 Penicillium decumbens A10 菌株进行诱变 ,以 450Gy 为最适诱变剂量 ,本研究获得了高产的纤维素酶产生菌并建立了相应的发酵工艺条件 ,为低成本、高活力的纤维素酶的工业化生产提供了技术准备。选育出 1 株纤维素酶高产菌株 A50。对 A50 产纤维素酶的液态发酵条件进行了研究 ,确定了所试因素的最佳组合为主碳源浓度 5 % ,麸皮与玉米秸秆的比例为 1∶1 ,辅加碳源为 011 %的葡萄糖 ,辅加氮源为012 %的磷酸氢二铵 ,Tween280 添加量为 011 % ,培养基初始 pH为 510、300ml 三角瓶的装液量为 30ml ,接种量10 % ,培养温度为 32 ℃,摇床转速 200rΠmin。发酵至60h 时 ,纤维素酶活性和滤纸酶活性均达到最高 ,分别为 27128 和 1198IUΠml ,较出发菌株 A10 分别提高了3312 %和 45159 %。
482 核　农　学　报 22 卷
分离纤维素酶产生菌多数采用透明圈法[15 ] ,但该
法往往存在假阳性。这可能是同一菌落内不同孢子发
育成的菌株产酶性能有较大差异造成的。本试验采用
微晶纤维素双层培养基和纤维素刚果红培养基进行初
筛 ,经比较发现前者较后者透明圈清晰度更高 ,更易筛
选高产菌株。因此在初筛时选微晶纤维素双层平板培
养基为初筛培养基[16 ] 。
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